基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討干姜附子湯抗心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制

謝鋒，段廣靖，王斌，衛(wèi)培峰，陳琳，李敏（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）[1]是指缺血缺氧的心肌組織恢復(fù)血液供應(yīng)后，心臟結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步破壞以及心肌細(xì)胞能量代謝功能障礙的進(jìn)一步加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷，主要包括心肌梗死面積的再擴(kuò)大和危及生命的心律失常。目前，MI/RI的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為鈣超載、凋亡、氧化損傷、炎癥是MI/RI 發(fā)生的重要原因[2-3]。

干姜附子湯記載于《傷寒雜病論?太陽(yáng)病篇》，由干姜和附子配伍組成，相須使用可增強(qiáng)回陽(yáng)救逆的功效，主治亡陽(yáng)欲脫及中虛寒盛證?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，干姜附子湯具有抗休克、強(qiáng)心、增加冠狀動(dòng)脈血流量等作用[4-5]。史琴等[6]研究顯示，干姜附子湯可降低MI/RI 大鼠心電圖ST 段及心肌缺血面積。血清中乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTn-I）及肌酸激酶同工酶（CKMB）含量明顯下降，提示干姜附子湯對(duì)MI/RI 大鼠有保護(hù)作用，但其生物過(guò)程及具體機(jī)制仍不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）是研究中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用機(jī)制的重要手段[7-11]，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)干姜附子湯治療MI/RI 的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)分析并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為其深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器及試藥

胎牛血清（美國(guó)Kirge 公司，批號(hào)：20190907）；ATP 酶試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：20191205）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20200102）；ELx808 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIOTeK 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；淡附片（附子炮制品）（批號(hào)：190301）、干姜（批號(hào)：190201）（咸陽(yáng)市北京同仁堂藥店，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張崗教授鑒定為正品）。

1.2 細(xì)胞種類(lèi)及來(lái)源

大鼠心肌細(xì)胞株H9C2 細(xì)胞（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：CX0125）。

2 方法

2.1 干姜附子湯中候選活性化合物與靶點(diǎn)的收集與篩選

以附子、干姜為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索附子、干姜的化學(xué)成分。以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)[12]，獲取附子、干姜主要活性化合物?？紤]到化合物含量、代謝及藥理作用，對(duì)附子、干姜有效化合物進(jìn)行補(bǔ)充。附子的主要成分為生物堿，干姜的主要成分為揮發(fā)油，故加入現(xiàn)有研究報(bào)道的附子、干姜的主要活性成分中[13-14]。根據(jù)OB、DL 篩選完后加入deoxyaconitine、aconitine、hypaconitine、mesaconitin、6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol、zingerone 9 個(gè)化學(xué)成分。在TCMSP 和CTD（http：//ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中收集上述獲得成分的靶點(diǎn)。并使用Uniport（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)名稱(chēng)。進(jìn)而利用Cytoscape 3.8.0 繪制“干姜附子湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.2 MI/RI 靶點(diǎn)的收集

以心肌缺血再灌注損傷為關(guān)鍵詞在Disgenet[13]（http：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中收集MI/RI 靶點(diǎn)。然后將干姜附子湯和MI/RI 的靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖在線(xiàn)工具中獲取干姜附子湯抗MI/RI 的靶點(diǎn)。

2.3 干姜附子湯抗MI /RI 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將干姜附子湯抗MI/RI 的靶點(diǎn)導(dǎo)入到String（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇Multiple proteins 功能，以Homo sapiens 為條件，將獲得的結(jié)果保存為tsv 文件格式，再將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，選擇網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龉δ芸梢暬Y(jié)果。

2.4 GO 富集分析和KEGG 富集分析

在DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)[15]（https：//david.ncifcrf.gov/）中選擇Functional Annotation 功能，導(dǎo)入共同靶點(diǎn)后，以Homo sapiens 為篩選條件獲得GO、KEGG 結(jié)果。按P＜0.05 為篩選條件，使用R語(yǔ)言制作氣泡圖。

2.5 藥物制備

干姜附子湯按照方中比例（干姜∶附子＝1∶1）混合，在室溫下用8 倍量體積水浸泡0.5 h，然后煎煮2 次，每次1 h。濾液通過(guò)4 層紗布收集，合并濾液并濃縮至制成含生藥0.1 g·mL－1的藥液離心，上清液用0.22 μm 水相微孔濾膜除菌，密封。

2.6 分組及造模

將H9C2細(xì)胞分為5組：Control 組、Model 組、干姜附子湯低劑量（0.125 mg·mL－1）、干姜附子湯中劑量（0.25 mg·mL－1）、干姜附子湯高劑量（0.5 mg·mL－1）組，除Control 組外，其余4組均參照文獻(xiàn)造模方法[16]建立MI/RI 模型，其中給藥組預(yù)處理24 h 后建立MI/RI 模型。

2.7 CCK8 法檢測(cè) H9C2 細(xì)胞存活率

將濃度為1×105個(gè)·mL－1的H9C2 大鼠心肌細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞完全貼壁后各給藥組給予100 μL 含藥培養(yǎng)液干預(yù)，且含藥培養(yǎng)液設(shè)置空白對(duì)照孔，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，Model 組給予DMEM 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后于每孔加入10 μL 的CCK8，培養(yǎng)箱孵育2 h 后，小心吸凈原液，每孔加入100 μL 的DMSO 溶液，至結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，以空白對(duì)照組的吸光度均值為100%，計(jì)算其余各組細(xì)胞活性。計(jì)算公式為：

2.8 H9C2 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

Annexin V-FITC/IP 雙染法檢測(cè)凋亡，將造模后的H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至2 mL 離心管內(nèi)，PBS 小心沖洗后用不含EDTA 胰酶消化細(xì)胞，消化后將上述收集的培養(yǎng)液終止消化后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心棄上清液，后加入500 μL 結(jié)合液，5 μL Annexin V-FITC，混勻后加5 μL 碘化丙啶后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2 細(xì)胞凋亡率。

2.9 Na＋-K＋-ATP、Ca2 ＋-Mg2 ＋-ATP 酶活力測(cè)定

將按“2.6”項(xiàng)下分組的各組細(xì)胞，用PBS作為勻漿介質(zhì)破碎后離心取上清液，按線(xiàn)粒體Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶 試劑盒操作說(shuō)明，進(jìn)行酶促反應(yīng)、定磷，用分光光度計(jì)在660 nm 處測(cè)定吸光度值，通過(guò)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)推算線(xiàn)粒 體Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活力，每組均采用復(fù)管測(cè)定。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以α＝0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果

3.1.1 干姜附子湯活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過(guò)TCMSP 平臺(tái)以及化合物補(bǔ)充共收集到干姜附子湯中成分16 個(gè)，其中附子7 個(gè)，干姜9 個(gè)（見(jiàn)表1）。獲得作用靶點(diǎn)171 個(gè)，成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖1）。圖1中三角形代表成分，圓形代表靶點(diǎn)。其中Degree 值排名靠前的成分為附子中的烏頭堿（Degree：45），干姜中的β-谷甾醇（Degree：38），10-姜酚（Degree：26）。提示這些成分可能是干姜附子湯治療MI/RI 的核心成分。

表1 干姜附子湯活性成分表Tab 1 Active ingredients of dried ginger-aconite decoction

圖1 干姜附子湯-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Dried ginger-aconite decoction-active ingredient-target network

3.1.2 干姜附子湯抗MI/RI 靶點(diǎn)收集 Disgenet中獲得MI/RI 靶點(diǎn)966 個(gè)。將干姜附子湯的靶點(diǎn)與MI/RI 靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖（見(jiàn)圖2）在線(xiàn)工具中獲取干姜附子湯抗MI/RI 靶點(diǎn)80 個(gè)（見(jiàn)表2）。

圖2 干姜附子湯抗MI/RI 靶點(diǎn)Fig 2 Anti-MI/RI targets of dried ginger-aconite decoction

3.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將80 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。網(wǎng)絡(luò)圖中包含80 個(gè)節(jié)點(diǎn)，871 條邊（見(jiàn)圖3）。節(jié)點(diǎn)的大小表示度值。Degree 值排名前5 的靶點(diǎn)為AKT1、IL6、TNF、MAPK3、TP53。提示這些靶點(diǎn)可能是干姜附子湯抗MI/RI 的核心靶點(diǎn)。

3.1.4 干姜附子湯抗MI/RI 的GO 富集和KEGG通路分析 GO 功能富集分析得到GO 條目158 個(gè)（P＜0.05），包括生物過(guò)程條目（BP）118 個(gè)，主要涉及凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控，脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路，線(xiàn)粒體膜電位的調(diào)節(jié)，DNA 損傷響應(yīng)的固有凋亡信號(hào)通路，缺乏配體的外在凋亡信號(hào)通路，線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C 的釋放，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的固有凋亡信號(hào)通路。細(xì)胞組成（CC）條目22 個(gè)分子，主要涉及胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外區(qū)域、核、膜筏、血液微粒。分子功能（MF）條目18 個(gè)涉及相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、過(guò)氧化物酶活性。根據(jù)P值進(jìn)行排序，選擇前10 進(jìn)行繪圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

KEGG 通路富集篩選得到102 條信號(hào)通路（P＜0.05），主要涉及PI3K-Akt、TNF、HIF-1、甲狀腺激素、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路。如圖5所示，其中排序越靠前，提示越可能是干姜附子湯抗MI/RI 的機(jī)制。

3.1.5 干姜附子湯-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析干姜附子湯對(duì)應(yīng)的靶蛋白和通路對(duì)應(yīng)的靶蛋白進(jìn)行映射后得到32 個(gè)共有靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)12 個(gè)有效活性成分和10 條信號(hào)通路。用Cytoscape 3.8.0 構(gòu)建“干姜附子湯”治療MI/RI“活性成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖見(jiàn)圖6。

3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

表2 干姜附子湯抗MI/RI 靶點(diǎn)Tab 2 Anti-MI/RI targets of dried ginger-aconite decoction

3.2.1 細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果 如表3所示，與Control 組比較，Model 組細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.01）；與Model 組比較，干姜附子湯不同濃度作用于H9C2 細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.01），且對(duì)H9C2細(xì)胞有促增殖作用，在預(yù)給藥濃度為0.25 mg·mL－1時(shí)，存活率最高。

3.2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 如圖7心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control 組比較，Model 組細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.01）；與Model 組比較，各給藥組細(xì)胞凋亡顯著減少（P＜0.01），且當(dāng)干姜附子湯濃度為0.25 mg·mL－1時(shí)，細(xì)胞凋亡率最低。

3.2.3 Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性檢測(cè)結(jié)果 如表4所示，與Control 組比較，Model 組細(xì)胞Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活力顯著降低（P＜0.01）；與Model 組比較，各給藥組Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 活力均升高（P＜0.01）。

圖3 干姜附子湯抗MI/RI 共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network of anti-MI/RI common targets of dried ginger-aconite decoction

圖4 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis of predicted targets

圖5 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis of predicted targets

表3 干姜附子湯對(duì)H9C2 細(xì)胞存活率的影響(x±s，n ＝6)Tab 3 Effect of dried ginger-aconite decoction on the survival rate of H9C2 cells (x ±s，n ＝6)

表4 干姜附子湯對(duì)H9C2 細(xì)胞MI/RI 損傷后Na＋-K＋-ATP、Ca2 ＋-Mg2 ＋-ATP 酶活性的影響(x±s，n ＝6)Tab 4 Effect of dried ginger-aconite decoction on Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-Mg2＋-ATPase after MI/RI injury in H9C2 cells (x± s，n＝6)

4 討論

圖6 干姜附子湯成分-靶點(diǎn)-通路圖Fig 6 Composition-target-pathway diagram of dried ginger-aconite decoction

圖7 干姜附子湯對(duì)H9C2 細(xì)胞MI/RI 損傷后凋亡的影響Fig 7 Effect of dried ginger-aconite decoction on the apoptosis of H9C2 cells after MI/RI injury

在心血管疾病中，缺血性心臟病是致死致殘的主要原因，通常與急性冠狀動(dòng)脈阻塞有關(guān)。臨床上的常見(jiàn)治療策略是通過(guò)溶栓或主要經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療對(duì)缺血區(qū)域進(jìn)行早期再灌注，盡管對(duì)挽救受損的心肌有效，但仍可能導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷，例如心肌震顫、心律不齊和心肌細(xì)胞死亡等[17]。因此，為了改善急性心肌梗死的臨床結(jié)局，探索MI/RI 安全有效的治療干預(yù)措施至關(guān)重要。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出干姜附子湯的活性成分16 個(gè)，預(yù)測(cè)出其治療MI/RI 的靶點(diǎn)80 個(gè)，網(wǎng)絡(luò)圖提示烏頭堿、β-谷甾醇、10-姜 酚、AKT1、IL6、TNF、MAPK3、TP53可 能是干姜附子湯治療MI/RI 的核心有效化合物和靶點(diǎn)。GO 富集分析提示干姜附子湯抗MI/RI 主要與凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控，缺乏配體的外在凋亡信號(hào)通路，線(xiàn)粒體膜電位的調(diào)節(jié)，DNA 損傷響應(yīng)的固有凋亡信號(hào)通路，脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)，這些生物過(guò)程大多與細(xì)胞凋亡有關(guān)。KEGG 富集分析提示干姜附子湯可能通過(guò)PI3K-Akt、TNF、HIF-1、甲狀腺激素、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路治療MI/RI。其中細(xì)胞調(diào)亡、PI3K-Akt、HIF-1 等信號(hào)通路均與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[18-19]。研究表明，抑制心肌細(xì)胞凋亡是治療MI/RI 的一種策略[20-25]。綜上，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)和先前的研究，本研究擬從細(xì)胞凋亡的角度出發(fā)，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)干姜附子湯治療MI/RI 的機(jī)制。

線(xiàn)粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)合成ATP 的場(chǎng)所，也是細(xì)胞凋亡的控制中心。由于心臟的高能量需求，心肌組織中含有較多的線(xiàn)粒體[26]。線(xiàn)粒體內(nèi)膜上含有大量的Na＋-K＋-ATP 酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP酶，這些酶可以維持細(xì)胞膜電位，催化ATP 分解成ADP 并釋放能量[27]。當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)，ATP 產(chǎn)生減少，Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活性降低，線(xiàn)粒體內(nèi)Ca2＋超載，氧自由基大量生成，線(xiàn)粒體膜膜電位發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28]。徐煒棉等[29]研究表明苦參堿可提高阿霉素?fù)p傷的H9C2 心肌細(xì)胞Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP 酶活性并減少H9C2 心肌細(xì)胞凋亡。霍禮超等[30]研究表明運(yùn)動(dòng)可提高胰島素抵抗大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性，胸腺細(xì)胞凋亡減少。曾先燕等[31]研究結(jié)果提示橙皮素可提高M(jìn)I/RI 損傷的H9C2 心肌細(xì)胞中Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性，并減少心肌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)干姜附子湯可顯著提高M(jìn)I/RI 損傷的H9C2 心肌細(xì)胞中的Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性并減少H9C2 細(xì)胞凋亡率，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

綜上，干姜附子湯對(duì)心肌細(xì)胞MI/RI 損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善心肌細(xì)胞能量代謝及減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。