藥效學(xué)結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選甘露飲的提取工藝

杜嘉玲，廖昌軍，馬婧，簡(jiǎn)銳（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610083）

甘露飲出自《太平惠民和劑局方》，為傳統(tǒng)中藥方劑，臨床上主要用來(lái)治療各種口腔疾病，如口腔潰瘍、齒齦腫爛等[1-7]，目前臨床應(yīng)用以湯劑為主。由于湯劑煎煮麻煩、不方便攜帶，導(dǎo)致患者依從性差，已經(jīng)不能滿足患者的用藥需求[8-11]。中藥顆粒劑作為一種常用中藥劑型，具有攜帶方便、穩(wěn)定性好、吸收快的優(yōu)點(diǎn)。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法是由析因設(shè)計(jì)加軸點(diǎn)和中心點(diǎn)組成的方法，近年來(lái)在藥學(xué)制劑工藝優(yōu)化和處方篩選中的應(yīng)用十分廣泛[12-13]。本研究旨在通過(guò)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選甘露飲的提取工藝路線，并在此基礎(chǔ)上以噴干粉的粉末得率為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定噴干粉中有效成分的轉(zhuǎn)移率，從而保證制劑的質(zhì)量和藥效，為甘露飲顆粒劑研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套（天津市工興電器廠）；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA 科技有限公司）；B290 型噴霧干燥器（瑞士步琦實(shí)驗(yàn)室儀器公司）；KH3200E 型超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子天平、千分之一電子天平（北京賽多利斯有限公司）。

1.2 試藥

生地黃（批號(hào)：1812205）、熟地黃（批號(hào)：18122504）、麥門冬（批號(hào)：181128）、天門冬（批號(hào)：18072302）、石斛（批號(hào)：18031307）、茵陳（批號(hào)：180713）、枳殼（批號(hào)：18081002）、蜜制枇杷葉（批號(hào)：18030609）、甘草（批號(hào)：180201）[四川禾一天然藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢驗(yàn)質(zhì)量均符合2015年版《中國(guó)藥典》一部各藥材項(xiàng)下規(guī)定]；熊果酸（批號(hào)：180926，純度：99.6%）、柚皮苷（批號(hào)：181119，純度：99.8%）、甘草酸（批號(hào)：180202，純度：99.2%）、綠原酸（批號(hào)：181010，純度：99.8%）、麥角甾苷（批號(hào)：181113，純度：99.3%）、黃芩苷（批號(hào)：180921，純度：99.9%）對(duì)照品（四川省食品藥品檢定研究所）。甲醇（色譜純，格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），氫氧化鈉、無(wú)水乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠25 只，其中雌鼠13 只，雄鼠12 只，體質(zhì)量180 ～220 g（成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥效學(xué)結(jié)合初步篩選甘露飲提取工藝路線

2.1.1 甘露飲處方組成 甘露飲出自《太平惠民和劑局方》，方劑組成：生地黃、熟地黃、麥門冬、天門冬、石斛各15 g，枳殼、茵陳、蜜制枇杷葉各10 g，甘草片6 g，處方中藥飲片總質(zhì)量為121 g。

2.1.2 甘露飲提取工藝路線設(shè)計(jì)與提取物制備中藥方劑經(jīng)過(guò)上千年的臨床應(yīng)用，已經(jīng)證明其配伍的合理性，甘露飲方劑目前臨床主要用于口腔潰瘍的治療，口腔潰瘍的形成必然伴有炎癥，因此溶劑對(duì)方劑中抗炎成分的提取率會(huì)直接影響藥效。通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，共設(shè)計(jì)4 條提取工藝路線，提取時(shí)間均為2 h，提取次數(shù)為2 次，提取完成后，將各組提取液旋蒸濃縮至以生藥計(jì)含量為1 g·mL－1，詳細(xì)提取工藝路線設(shè)計(jì)見表1。

表1 甘露飲提取工藝路線Tab 1 Extraction route of Ganluyin

2.1.3 動(dòng)物分組及造模 SD 大鼠隨機(jī)分為5 組：模型組、工藝Ⅰ、工藝Ⅱ組、工藝Ⅲ組、工藝Ⅳ組（n＝5），實(shí)驗(yàn)前稱重并對(duì)各組大鼠進(jìn)行編號(hào)。造模前大鼠禁食12 h，各組大鼠經(jīng)腹腔注射約0.5 mL 10%水合氯醛（300 mg·kg－1）麻醉后，均在左側(cè)黏膜接受氫氧化鈉片灼燒，灼燒時(shí)間約35 s，氫氧化鈉片大小約為3 mm×3 mm。氫氧化鈉燒灼口腔內(nèi)壁黏膜導(dǎo)致口腔內(nèi)壁黏膜破損進(jìn)而形成潰瘍，待潰瘍形成后，各組均采用灌胃給藥，劑量為10 mL·kg－1（人每日給藥劑量為2 g·kg－1，按照人與大鼠給藥劑量進(jìn)行換算大鼠給藥劑量），模型組灌胃給予10 mL·kg－1蒸餾水，不同提取工藝組給予10 mL·kg－1提取濃縮液，同時(shí)注意在給藥灌胃時(shí)小心避免灌胃針刮蹭到口腔潰瘍面，導(dǎo)致潰瘍加重影響實(shí)驗(yàn)。以上各組大鼠每日給藥1 次，連續(xù)給藥直至所有組別的大鼠潰瘍愈合。各組大鼠自造模之日起和給藥后每日觀察大鼠口腔潰瘍愈合情況，記錄各組大鼠愈合天數(shù)，并在給藥前后給藥后第2、5、7、10日對(duì)大鼠稱重，并采取尾靜脈采血法收集大鼠全血約0.3 mL于EP 管中。血樣先室溫靜置30 min，然后3000 r·min－1離心15 min，收集上層血清[6]。按照ELISA 試劑盒的指導(dǎo)說(shuō)明，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm 條件下檢測(cè)各組大鼠血清炎癥因子含量。各組大鼠觀察和檢測(cè)所得數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行單因素方差分析[14]。

2.1.4 口腔潰瘍藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果 大鼠在接受氫氧化鈉片灼燒復(fù)制口腔潰瘍后，均能耐受至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。造模前大鼠口腔黏膜光滑平整無(wú)破損，造模后大鼠口腔黏膜呈紅腫或破損，隨著潰瘍逐漸形成，潰瘍處變黃，到最后逐漸痊愈形成瘢痕。20 d 左右所有組別的大鼠口腔潰瘍基本痊愈。各組痊愈天數(shù)、體質(zhì)量變化、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等變化結(jié)果見表2～4。

表2 各組痊愈天數(shù)比較分析結(jié)果 (n ＝5，± s)Tab 2 Recovery days in each group (n ＝5，± s)

表2 各組痊愈天數(shù)比較分析結(jié)果 (n ＝5，± s)Tab 2 Recovery days in each group (n ＝5，± s)

注（Note）：與模型組比較，*P ＜0.05；與工藝Ⅰ組比，#P ＜0.05； 與工藝Ⅱ組比，&P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05；compared with the groupⅠ，#P ＜0.05； compared with the group Ⅱ，&P ＜0.05）。

組別 平均痊愈天數(shù)/d模型組 20.2±0.83工藝Ⅰ 15.2±0.83工藝Ⅱ 14.8±0.83工藝Ⅲ 9.8±0.80*#&工藝Ⅳ 9.8±0.83*#&

表3 各組口腔潰瘍大鼠體質(zhì)量變化 (n ＝5，± s)Tab 3 Mass changes in canker sores of rats in each group(n ＝5，± s)

表3 各組口腔潰瘍大鼠體質(zhì)量變化 (n ＝5，± s)Tab 3 Mass changes in canker sores of rats in each group(n ＝5，± s)

注（Note）：與模型組比較，*P ＜0.05；與工藝Ⅰ組比，#P ＜0.05；與工藝Ⅱ組比，&P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05；compared with the groupⅠ，#P ＜0.05； compared with the group Ⅱ，&P ＜0.05）。

組別 ΔW/g第2日 第5日 第7日 第10日模型組 7.18±0.23 5.10±0.25 9.02±0.27 10.94±0.89工藝Ⅰ 6.86±0.50 5.90±0.12 10.96±0.69 17.96±0.28工藝Ⅱ 7.34±0.30 6.34±0.33 12.5±0.50 18.81±0.22工藝Ⅲ 7.10±0.15 7.78±0.36 18.32±0.54 29.88±0.68*#&工藝Ⅳ 7.18±0.19 8.22±0.50 18.30±0.91 30.72±2.37*#&

工藝Ⅲ、Ⅳ組藥效學(xué)顯著優(yōu)于工藝Ⅰ、Ⅱ組，表明采用60%的乙醇提取效果更好，工藝Ⅲ、Ⅳ組比較藥效學(xué)沒有顯著差異，Ⅳ組提取方法操作更簡(jiǎn)便，所以選擇工藝Ⅳ進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 評(píng)價(jià)指標(biāo) 選擇每一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法得到的濃縮藥液經(jīng)噴霧干燥所得的粉末取得率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算公式為：

2.2.2 因素水平選擇 選擇液料比（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取次數(shù)（X3）作為考察對(duì)象，每個(gè)因素均設(shè)5 個(gè)水平，3 個(gè)因素，見表5。

表4 各組大鼠TNF-α 含量水平變化(n ＝5，± s，ng·L－1)Tab 4 Level change of TNF-α in each group (n ＝5，± s，ng·L－1)

表4 各組大鼠TNF-α 含量水平變化(n ＝5，± s，ng·L－1)Tab 4 Level change of TNF-α in each group (n ＝5，± s，ng·L－1)

注（Note）：與模型組比較，*P ＜0.05；與工藝Ⅰ組比，#P ＜0.05；與工藝Ⅱ組比，&P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05；compared with the groupⅠ，#P ＜0.05； compared with the group Ⅱ，&P ＜0.05）。

組別 TNF-α 含量 TNF-β 含量第2日 第5日 第7日 第10日 第2日 第5日 第7日 第10日模型組 154.10±19.21 143.21±17.20 132.17±15.34 119.87±15.01 101.23±14.29 91.47±10.68 85.73±9.85 80.46±8.76工藝Ⅰ 146.13±13.21 130.53±11.21 112.17±9.85 99.47±8.63 94.38±11.23 81.56±9.65 69.33±7.32 57.42±6.58工藝Ⅱ 143.08±10.57 131.28±9.87 113.65±10.12 96.58±7.65 91.04±9.57 83.74±8.53 68.45±6.58 60.44±5.68工藝Ⅲ 135.48±10.74 105.88±7.63 89.27±8.56 57.51±6.38*** 80.89±7.58 65.77±8.50 51.36±6.12 39.45±4.27***工藝Ⅳ 130.43±7.83 101.94±6.54 78.62±5.99 51.38±4.78*** 76.58±9.23 57.33±7.36 47.56±6.21 35.28±3.17***

表5 因素與水平Tab 5 Factor and level

2.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 實(shí)驗(yàn)方案由軟件Dsign-Expert.V8.0.6 生 成。 以500 mL 60%乙醇為溶劑提取，提取液旋蒸濃縮至以生藥計(jì)含量為1 g·mL－1。分別取濃縮藥液進(jìn)行噴霧干燥[15]。收集干燥粉末，稱重并記錄數(shù)據(jù)，按照“2.2.1”下公式計(jì)算粉末取得率。具體實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表6。

2.2.4 模型擬合 采用軟件Desing-Expert.V8.0.6對(duì)表7中的數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，通過(guò)模型擬合建造出數(shù)學(xué)模型，模型擬合的優(yōu)劣用方差分析來(lái)評(píng)價(jià)，選出最佳的擬合模型。

表6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 6 Design and results

數(shù)學(xué)模型：Y＝8.67972＋0.83836X1＋0.022492X2＋2.17233X3＋5.45061×104X1X2＋0.32322X1X3－6.6571X2X3－0.14747X12－ 8.45938E-005X22－1.68130X32

根據(jù)表7模型P值為0.0002，表明模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型成立。液料比和提取次數(shù)P＜0.0001，表明液料比和提取次數(shù)對(duì)粉末取得率的影響差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。決定系數(shù)為0.9251，接近于1。校正決定系數(shù)為0.8477，表明該模型能解釋84.77%效應(yīng)面值的變化。預(yù)測(cè)決定系數(shù)為0.8474，表明該模型能預(yù)測(cè)解釋84.74%的效應(yīng)面值變化。模型的精密度為21.657，精密度合格。經(jīng)過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法得到最佳提取條件為液料比4∶1，提取時(shí)間180 min，提取1 次。二次多項(xiàng)式回歸模型等高線和3D 圖見圖1和2。

表7 二次多項(xiàng)式模型方差分析Tab 7 Variance of quadratic polynomial model

圖1 二次多項(xiàng)式回歸模型等高線Fig 1 Contour of the quadratic polynomial regression model

圖2 二次多項(xiàng)式回歸模型3D 圖Fig 2 3D figure of quadratic polynomial regression model

2.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 使用模型預(yù)測(cè)得到最佳提取條件，預(yù)測(cè)粉末取得率為13.0379%。按照優(yōu)化預(yù)測(cè)得到的最佳提取條件，以500 mL 60%乙醇為溶劑進(jìn)行提取，再分別對(duì)所得藥液旋蒸濃縮后進(jìn)行噴霧干燥，收集粉末，稱重并記錄數(shù)據(jù)，按照“2.2.1”項(xiàng)下公式計(jì)算粉末取得率并記錄數(shù)據(jù)。

由表8結(jié)果可知，實(shí)際粉末取得率與預(yù)測(cè)粉末取得率平均偏差小于2%，證明預(yù)測(cè)最佳提取條件在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中穩(wěn)定可行。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 8 Validation experiment

2.3 噴干粉轉(zhuǎn)移率測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸對(duì)照品適量，置于量瓶中，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、0.5、1.0、1.0、0.5、0.5 mg·mL－1的 對(duì)照品儲(chǔ)備液，待用。

2.3.2 樣品溶液制備 將工藝Ⅳ組提取液濃縮后按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行噴霧干燥[15]，精密稱取樣品粉末0.150 g，甲醇溶解，定容至5 mL，超聲10 min，冷卻至室溫，補(bǔ)充甲醇減失量，即得樣品溶液。

2.3.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 sepax MGE-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量5 μL，流速為1 mL·min－1，流動(dòng)相為乙腈（B）和0.1%磷酸水（A），洗脫梯度如表9。將空白溶劑（甲醇）及“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，見圖3。由結(jié)果可知，6 種成分所得峰能達(dá)到基線分離，峰形較好且穩(wěn)定，其他成分對(duì)檢測(cè)沒有干擾。

表9 HPLC 的梯度洗脫程序Tab 9 Gradient elution procedure for HPLC

2.3.4 線性范圍考察 分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量配制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取5 μL，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表10，6 種成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 轉(zhuǎn)移率測(cè)定 將甘露飲處方按照工藝Ⅳ進(jìn)行提取濃縮，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，提取濃縮液和樣品溶液均平行制備3 份，按照“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄濃縮液和樣品溶液中各有效成分的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算噴干粉中有效成分的轉(zhuǎn)移率，計(jì)算公式見公式（2）。結(jié)果綠原酸、麥角甾苷酸、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率分別為89.54%、70.29%、94.27%、95.35%、82.47%、80.37%。甘露飲中有效成分的轉(zhuǎn)移率均在70%以上，轉(zhuǎn)移率較好。

3 討論

圖3 空白溶劑（A）、混合對(duì)照品溶液（B）和樣品溶液（C）HPLC 圖Fig 3 HPLC chromatogram of the blank solution（A），the mixed control solution（B）and sample solution（C）

表10 甘露飲方劑中6 種有效成分線性關(guān)系Tab 10 Linearity of 6 active components in Ganluyin

在提取工藝優(yōu)化過(guò)程中，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用得比較成熟的方法，但是存在實(shí)驗(yàn)精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性差，選擇的實(shí)驗(yàn)取值僅僅是接近最佳取值，無(wú)法精確找到最佳點(diǎn)，不能靈敏地考察各因素間的交互作用，而星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是集數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)于一體，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精密度高等特點(diǎn)；并且可對(duì)未知結(jié)果的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，比正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更具優(yōu)勢(shì)，適用于多因素、多水平的實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究領(lǐng)域[16-17]。

在優(yōu)化甘露飲提取工藝時(shí)，采用效應(yīng)面優(yōu)化法需同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，由于前期實(shí)驗(yàn)已確定最佳提取溶劑為60%乙醇，故本次實(shí)驗(yàn)選擇液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素進(jìn)行考察。模型擬合中采用噴霧干燥粉末取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而沒有用有效成分轉(zhuǎn)移率來(lái)考察，主要是因?yàn)橛行С煞趾繙y(cè)定采用梯度洗脫色譜條件，每一個(gè)樣品需要分析100 min，耗時(shí)較長(zhǎng)，而前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選了烘干、減壓干燥、冷凍干燥和噴霧干燥等方法，通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)采用噴霧干燥得到的噴干粉中有效成分轉(zhuǎn)移率較好。同時(shí)濃縮液和噴干粉中6 種有效成分轉(zhuǎn)移率均大于70%，轉(zhuǎn)移率較高，分析原因可能是采用噴霧干燥的方法，干燥溫度較低，干燥時(shí)間短，有效避免了提取液中有效成分的損失。

本文通過(guò)藥效學(xué)結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選甘露飲方的提取工藝，采取HPLC 分別對(duì)甘露飲濃縮液和噴干粉中6 種有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，并計(jì)算干燥前后有效成分的轉(zhuǎn)移率，為甘露飲進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。