礦化絲素/聚乳酸載萬古霉素復(fù)合材料的制備與改性研究*

任華杰，甘芳巾，連小潔，黃 棣，牛寶龍，李 芬，張全有，李志軍，何志敏

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系 納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心，太原 030024；2.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究所 材料強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024；3.太原理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024；4.太原理工大學(xué) 機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)院，太原 030024；5.北京奧精醫(yī)藥科技有限公司，北京 100176)

0 引 言

感染性骨缺損在臨床上一直是比較棘手的問題，傳統(tǒng)的治療方式如手術(shù)清創(chuàng)等只能控制感染而不能治愈，靜脈注射藥物容易引起全身性的反應(yīng)并且經(jīng)常導(dǎo)致感染區(qū)域的藥物濃度不足[1]。因此尋找一種藥物載體在感染局部定量釋放藥物就顯得十分重要[2-3]。

絲素蛋白是一種優(yōu)異的生物材料，由于其良好的力學(xué)性能和生物相容性，以及可以通過各種方式化學(xué)改性獲得了很多應(yīng)用[4-5]。在其蛋白大分子鏈上有一些羧基約占摩爾比1.1%，因此可以通過生物礦化原理制備礦化絲素[6]。礦化絲素有更好的生物相容性，與高分子材料復(fù)合可以在一定程度控制藥物的釋放，使得它可以更好的應(yīng)用于骨組織工程支架[7-8]。

聚乳酸作為一種可被人體吸收的生物材料獲得了很大的應(yīng)用，具有優(yōu)異的綜合性能。研究中聚乳酸的降解產(chǎn)物顯酸性，經(jīng)常導(dǎo)致無菌性炎癥，因此對聚乳酸應(yīng)用的改進(jìn)也有很多研究[9-11]。通過混入堿性物質(zhì)平衡PH來改善局部環(huán)境是一種常用的方法，羥基磷灰石在水中呈堿性，本研究將羥基磷灰石礦化的絲素蛋白與聚乳酸混合可后使用可以在一定程度上中和酸堿度，一定程度上減少無菌炎癥的發(fā)生。同時絲素蛋白礦化表面以使鈣磷鹽沉積，促進(jìn)成骨。

萬古霉素作為一種抗生素，在臨床上經(jīng)常通過靜脈注射的方式用于治療嚴(yán)重的感染，然而靜脈注射經(jīng)常會導(dǎo)致全身性的反應(yīng)并且經(jīng)常導(dǎo)致感染部位的藥物濃度不足，因此需要通過一種藥物載體使萬古霉素在感染局部定量釋放[12-13]。

在本次研究中，我們將礦化絲素與聚乳酸復(fù)合，負(fù)載萬古霉素，通過控制降溫速度控制聚乳酸的結(jié)晶過程[14-15]，得到一種性能在一定范圍可控的骨組織工程支架，并對微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)、藥物釋放、降解等性能進(jìn)行研究，期望該礦化絲素/聚乳酸載萬古霉素骨組織工程支架在感染性骨缺損中有更好的應(yīng)用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 礦化絲素/聚乳酸/萬古霉素復(fù)合材料的制備

1.1.1 礦化絲素的制備

將蠶絲放入煮沸的0.05%的碳酸鈉溶液30 min，浴比1∶20重復(fù)3次脫膠。脫膠后烘干，將烘干后的絲素蛋白用三元溶液(水：無水乙醇：無水氯化鈣=8∶2∶1)溶解，浴比1∶10。溶解后用透析袋透析得到絲素蛋白溶液。選取適量的絲素蛋白溶液使絲素蛋白的質(zhì)量為5 g，加入配置好的氯化鈣溶液(無水氯化鈣10.72 g，去離子水132.66 mL)，室溫下攪拌2 h后加入磷酸溶液(鈣∶磷=1.66磷酸6.71 g，去離子水99.02 mL)，攪拌2h。逐滴加入氫氧化鈉使溶液PH保持在10，攪拌5 h待礦化完全并且PH值不變后靜置24 h，然后離心，將離心后的沉淀凍干24 h后過篩得到粉末狀的礦化絲素，標(biāo)記為SF/HA。

1.1.2 復(fù)合材料的制備

將分子量為12萬的聚乳酸溶解在1，4-二氧六環(huán)中(4g聚乳酸40ml的1,4-二氧六環(huán))，攪拌4 h待其完全溶解，然后加入4 g制備好的礦化絲素，攪拌30 min，待混合均勻后加入0.4 g萬古霉素再攪拌2 h，將一部分倒入室溫下的模具(室溫25 ℃)然后轉(zhuǎn)移到-20 ℃冰箱冷凍2 h，緩慢冷凍得到結(jié)晶態(tài)的聚乳酸，標(biāo)記為SF/HA/PLA1，另一部分倒入預(yù)先在-20 ℃冰箱中冷凍24 h的模具，然后轉(zhuǎn)移到-20 ℃冰箱，快速冷凍，得到非結(jié)晶態(tài)的聚乳酸，標(biāo)記為SF/HA/PLA2，冷凍2 h，將冷凍好的材料凍干后得到礦化絲素/聚乳酸/載萬古霉素的復(fù)合材料。

1.2 樣品的性能及表征

1.2.1 抗壓強(qiáng)度測試

采用Instron-5544壓機(jī)測試材料的力學(xué)性能。將材料制成直徑9 mm，高15 mm的圓柱體，在拉壓機(jī)下進(jìn)行抗壓強(qiáng)度測試，壓縮速度2 mm/min，最大壓縮10 mm，獲得該材料的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

1.2.2 表面微觀形貌表征

使用掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司的SM-7100F)觀察材料的表面形貌。首先將材料粘附到導(dǎo)電膠上，然后噴金放入電鏡下觀察。當(dāng)觀察樣品的表面形態(tài)時，將電壓調(diào)節(jié)至5 kV。

1.2.3 孔隙率

用液體置換法測量材料的孔隙率，樣品的重量以W1表示，將其浸入異丙醇中，并通過一系列的抽空-再加壓循環(huán)將其壓入材料的孔中。此時，將材料取出，并將其質(zhì)量測量為W2。將一定量的異丙醇倒入燒杯中，讀取體積V1，將浸泡在異丙醇中的材料放入燒杯中，讀取體積V2，材料的孔隙率為(W2-W1)/ρ(V2-V1)×100%。

1.2.4 X射線衍射分析

測試前將樣品制成粉末狀，使用DX-2700射線衍射儀(昊源儀器公司)分析樣品的結(jié)晶度。

1.2.5 藥物釋放及降解性能

將SF/PLA1與SF/PLA2各取3個重復(fù)樣后稱重，然后放入離心管。樣品均為直徑9 mm高15 mm的圓柱。加入5 mL PBS后，將其放在37 ℃的恒溫振蕩器中緩慢振蕩，每兩天更換一次PBS并收集，用紫外分光光度計測量其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出PBS中萬古霉素的濃度，從而計算出萬古霉素的質(zhì)量，由此得到藥物釋放曲線。

將降解30 d的材料稱重記為m1，與材料的初始重量m2對比，得到材料降解30 d的降解率降解率的計算公式為：(m2-m1)/m2×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 礦化絲素的制備

礦化絲素SF/HA材料的微觀形貌如圖1所示。其中圖1(a)為三元溶液溶解的絲素蛋白制備的礦化絲素的SEM圖，(c)為對該方法制備的礦化絲素的多張電鏡照片統(tǒng)計的粒徑分布，可以看出三元溶液溶解的絲素蛋白制備的礦化絲素粒徑大約分布在5～20 μm，從(b)中可以看出制備的SF/HA外觀形貌為白色粉末狀，本身沒有強(qiáng)度，需要與別的高分子材料復(fù)合才能更好地應(yīng)用于骨組織工程。

圖1 礦化絲素微觀形貌

2.2 SF/HA/PLA的力學(xué)強(qiáng)度測試

PLA是常用的醫(yī)用高分子材料，SF/HA/PLA的力學(xué)性能受PLA影響，高分子鏈段的堆砌結(jié)構(gòu)直接影響SF/HA/PLA的力學(xué)性能，PLA的結(jié)晶過程如圖2所示。其中圖2(a)為熔融狀態(tài)下的聚乳酸，大分子鏈段有很強(qiáng)的運(yùn)動能力，彼此之間的空間很大。隨著溫度降低，大分子鏈段的運(yùn)動能力減弱，彼此空間減小，整個體系能量降低，此時為無定型堆積PLA，如圖(b)所示。溫度再緩慢降低，整個體系能量進(jìn)一步減少，大分子鏈段的堆砌程度更加緊密，成為一種更加緊密的無定型堆積PLA，如圖(c)所示。溫度進(jìn)一步降低，大分子鏈段以結(jié)晶的方式堆砌，使整個體系處于能量最低狀態(tài)，如(d)所示。溫度過快降低，會使高分子以圖(b)或(c)的形式堆砌，得不到充分結(jié)晶的材料。在熔融狀態(tài)降溫與在溶液中降溫有類似的結(jié)晶過程，因此在本次研究中采用緩慢降溫與快速降溫兩種方式分別得到了微觀組成結(jié)晶狀態(tài)的SF/HA/PLA1(圖3a)與無定型堆砌狀態(tài)的SF/HA/PLA2(圖3b)，這種不同的堆砌結(jié)構(gòu)造成了他們力學(xué)性能的不同。

圖2 聚乳酸高分子結(jié)晶示意圖(a)熔融態(tài)PLA；(b)無定型堆積PLA；(c)更加緊密的無定型堆積PLA；(d)結(jié)晶態(tài)PLA

力學(xué)壓縮測試是可以評估材料植入人體后的最大受力程度，從圖3(d),(e)可以看出SF/HA/PLA1是脆性的，在到達(dá)最大抗壓強(qiáng)度1MPa之后斷裂，而SF/HA/PLA2是韌性的，在壓縮完成后仍可以保持完整。大分子鏈段的堆砌結(jié)構(gòu)對高分子材料的力學(xué)性能影響較大，從圖3 ℃中可以看出在材料破碎之前，結(jié)晶型材料SF/HA/PLA1的彈性模量一直高于非結(jié)晶型材料SF/HA/PLA2，這與其它高分子的性能相似，壓縮時應(yīng)力集中于結(jié)晶區(qū)，從而有更大的彈性模量。但是非結(jié)晶型材料SF/HA/PLA2在應(yīng)變0～70%內(nèi)都能承受較大的應(yīng)力。對其力學(xué)性能的研究有望拓寬聚乳酸基復(fù)合材料的臨床應(yīng)用。

圖3 SF/HA/PLA的結(jié)構(gòu)示意圖和力學(xué)測試(a)(b)分別為SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的微觀結(jié)構(gòu)示意圖；(c)為 SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的應(yīng)力應(yīng)變圖；(d)(e)分別為 SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2壓縮前后對比

2.3 SF/HA/PLA的微觀形貌

SF/HA/PLA的微觀形貌如圖4所示。其中(a)是SF/HA/PLA1的微觀形貌，(b)是SF/HA/PLA2的微觀形貌。(a，b)都是多孔的，他們的孔隙率分別為(80.16±1.2)%和(82.36±1.69)%?？资怯扇軇?,4-二氧六環(huán)凍干之后形成的，這就說明可以通過控制溶質(zhì)溶劑的比例來控制材料的孔隙率，在一定范圍內(nèi)改變材料的孔隙率可以使其更好地應(yīng)用于骨修復(fù)。圖4(a 和b)為相同放大倍數(shù)下的圖像，從圖中可以看出SF/HA/PLA1的孔徑大小明顯大于SF/HA/PLA2，而且通過多組電鏡照片計算測量得出SF/HA/PLA1的孔徑主要分布在60-90μm，而SF/HA/PLA2的孔徑主要分布在10-20μm，如圖4c，d所示。這是由于SF/HA/PLA2在冷卻凝固成型時速度較快，溶劑1,4-

圖4 SF/HA/PLA的微觀形貌(a)(b)分別為SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的微觀形貌；(c)(d)分別為 SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的孔徑分布(n=30)

二氧六環(huán)結(jié)晶的晶核在較小的情況下就已凝固，而SF/HA/PLA1冷卻凝固較慢，溶劑有足夠的時間使晶核長大，從而造成了不同的孔徑大小，這也說明我們可以通過類似的控制體系凝固速率的辦法來在一定程度上控制材料的孔徑大小，使其更好地應(yīng)用于臨床骨缺損修復(fù)。

2.4 SF/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的結(jié)晶性

XRD圖像中峰的高低可以表示材料結(jié)晶程度的高低，SF/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的XRD圖像如圖5所示。

圖5 SF/HA和SF/HA/PLA的XRD

從圖5中可以看到在30～40°之間是羥基磷灰石的峰，通過對比可以看出在15～ 20°之間的峰屬于聚乳酸，SF/HA/PLA1的峰明顯高SF/HA/PLA2的峰，這就說明SF/HA/PLA1的結(jié)晶度高于SF/HA/PLA2；同時結(jié)晶度的高低也可以從力學(xué)測試中看出，一般高分子的結(jié)晶度和力學(xué)性能是有較大的關(guān)聯(lián)，結(jié)晶度的增加使材料變脆變硬。當(dāng)材料冷卻凝固成型過程中，SF/HA/PLA1的聚乳酸有較長的時間充分結(jié)晶(溶劑結(jié)晶導(dǎo)致聚乳酸從溶劑中析出堆砌)，SF/HA/PLA2的聚乳酸在較短時間及較快的冷卻速度下傾向于形成無定型堆積。這也與聚乳酸的結(jié)晶規(guī)律一致，降溫速率越慢形成的聚乳酸結(jié)晶度越高。結(jié)晶度的不同導(dǎo)致兩種相同的材料表現(xiàn)出不同的性能。

2.5 藥物釋放及降解性能

兩種不同的堆砌結(jié)構(gòu)必然導(dǎo)致加載于其中的小分子藥物釋放行為不同，如圖6(d)所示。結(jié)晶區(qū)的藥物分子更難釋放出來，而無定型堆積則較容易就將小分子藥物釋放出來。結(jié)晶是最致密的一種結(jié)構(gòu)，藥物釋放行為單一，無定型堆積則可以通過控制不同的堆積密度來控制藥物的釋放，參考圖2高分子結(jié)晶示意圖。

圖6 SF/HA/PLA的藥物釋放、降解率和微觀結(jié)構(gòu)示意圖(a)SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的藥物釋放圖；(b)SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2藥物累計釋放圖；(c)SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的降解圖；(d)SH/HA/PLA1和SF/HA/PLA2的藥物釋放示意圖

圖6中(a)為SF/HA/PLA1與SF/HA/PLA2的藥物釋放圖，(b)圖為累計釋放。在26 d的時候SF/HA/PLA1藥物釋放結(jié)束，SF/HA/PLA2的結(jié)束時間為30 d。從圖中可以看出在12 d之前SF/HA/PLA2的藥物釋放量小于SF/HA/PLA1，在12 d之后高于SF/HA/PLA1。從(b)圖中可以更加直觀的看出SF/HA/PLA2的累計釋放量一直低于SF/HA/PLA1，延長了藥物的釋放周期?？赡芤?yàn)榻Y(jié)晶型材料中殘留藥物無法徹底釋放出來，而且材料的孔徑結(jié)構(gòu)也會在一定程度影響藥物釋放，如圖4所示，SF/HA/PLA1主要分布的孔徑大于SF/HA/PLA2的孔徑。

圖6(c)為兩種材料在PBS中一個月的降解率，其中SF/HA/PLA1的降解率在5.5%左右，SF/HA/PLA2的降解率在7.8%左右。這說明材料的降解與材料的堆積致密程度有一定關(guān)系，致密的堆積結(jié)構(gòu)更難降解。

3 結(jié) 論

絲素蛋白是一種生物相容性很好的生物材料，通過化學(xué)改性可以應(yīng)用在很多領(lǐng)域。納米羥基磷灰石礦化的絲素蛋白在骨組織工程有一定的研究。絲素蛋白可控的降解性能可以調(diào)節(jié)與新骨的形成的速度[16]；但同時也可以通過不同的制備方法控制絲素蛋白的微觀尺寸來進(jìn)一步控制它的降解行為。納米羥基磷灰石在被人體吸收的同時為新骨的形成提供鈣和磷，促進(jìn)新骨的生長。這些優(yōu)勢使得礦化絲素在骨組織工程中有一定的應(yīng)用價值。

礦化膠原/聚乳酸復(fù)合材料作為一種骨修復(fù)材料在臨床上有很多應(yīng)用，這是一種生物相容性非常好的材料，有跟人體骨相似的微觀結(jié)構(gòu)，在治療骨缺損時有非常好的療效。然而非人源性的膠原會引起免疫排斥反應(yīng)，同時它的降解速度過快，經(jīng)常在新骨還未形成便已完全降解，導(dǎo)致手術(shù)失敗。我們制備的礦化絲素/聚乳酸是希望減少這一免疫排斥反應(yīng)。同時由于本研究的礦化絲素/聚乳酸材料通過改變聚乳酸結(jié)晶態(tài)可以使降解速率得以調(diào)節(jié)，有望在后續(xù)研究中與新骨的形成速度匹配，得到更好的療效。

將萬古霉素加載到礦化絲素/聚乳酸復(fù)合材料上可以治療感染性骨缺損，這種復(fù)合體系可以在感染部位30 d內(nèi)持續(xù)釋放藥物，不僅提高了藥物的利用效率同時也減少了靜脈注射帶來的全身性反應(yīng)。這種體系是一種更加合理的藥物控釋方式。通過控制溫度來控制聚乳酸的堆積致密程度也可以應(yīng)用于其他以聚乳酸為基的藥物控釋體系中，如聚乳酸微球、薄膜等包裹藥物的控釋體系，本研究采用的控制降溫速率的辦法就是為了改變聚乳酸的堆積致密程度，來調(diào)節(jié)藥物釋放行為。在后面的研究中我們可以通過調(diào)節(jié)絲素蛋白的提取方法、聚乳酸的分子量等一系列的方法來控制萬古霉素的釋放行為，使萬古霉素的釋放更好的滿足臨床治療感染的需求。

聚乳酸作為礦化絲素/聚乳酸/萬古霉素復(fù)合材料的基體材料，其性能很大程度上影響復(fù)合材料的力學(xué)性能。聚乳酸結(jié)晶態(tài)是最致密的一種堆積方式，然而結(jié)晶態(tài)的高分子脆性和剛度都比較大，容易破碎，也不容易加工。非結(jié)晶態(tài)的聚乳酸韌性大，不容易破碎，也更容易加工，在壓縮到90%的時候可以承受壓力42.57 MPa，由于壓縮強(qiáng)化，在壓縮到某一個狀態(tài)時會與人體密質(zhì)骨的力學(xué)強(qiáng)度相匹配可拓寬聚乳酸復(fù)合材料在骨組織工程中的應(yīng)用。

SF/HA/PLA的微觀形貌還受多種因素影響，溶劑結(jié)晶晶體的大小決定了孔徑的大小，而晶體的大小又由整個體系凝固時間決定，凝固時間越長，晶體越大，孔徑也就越大，通過控制降溫速度可以控制整個體系的結(jié)晶時間。這就說明我們可以通過這種方式來在一定程度控制材料的微觀孔結(jié)構(gòu)，來使其更好的滿足細(xì)胞粘附、遷移、增值的需求。

研究通過生物礦化原理制備了礦化絲素并于聚乳酸復(fù)合負(fù)載萬古霉素。通過降溫速率的改變控制聚乳酸的結(jié)晶過程，得到微觀孔結(jié)構(gòu)、藥物釋放行為、力學(xué)性能及降解速率不同的兩種材料，拓寬了礦化絲素/聚乳酸復(fù)合材料在骨科臨床上的應(yīng)用。