優(yōu)化阿魏酸印跡微球的制備條件及其分子識別性能

董 雁，張夏紅，李錦輝

(1．龍巖學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建 龍巖 364012； 2．固體廢棄物資源化利用福建省高校工程研究中心，福建 龍巖 364012)

1 引 言

阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)，是肉桂酸的一種衍生物，化學(xué)名為4-羥基3-甲氧基肉桂酸，是植物中的天然活性物質(zhì)。人們最早在植物的種子以及葉子中發(fā)現(xiàn)阿魏酸。阿魏酸在中草藥、蔬菜和水果中含量很大，尤其是在活血化瘀中藥植物如升麻、川芎、當(dāng)歸、阿魏等中含量較高。阿魏酸具有抗氧化、抑菌消炎、抗血栓、抗癌、抗輻射和提高膜穩(wěn)定性等藥理作用[1]，因此廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、農(nóng)藥、保健品及化妝品中。阿魏酸在植物當(dāng)中的含量一般在0.03%左右。目前一般采用紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等辦法對其進(jìn)行測量[2-4]。過去多采用活性炭、大孔樹脂、陰離子交換樹脂、生物質(zhì)等固體吸附劑對阿魏酸粗提取液進(jìn)行分離[5]。這些方法存在選擇性差，分離效果差，成本高等缺點。

分子印跡技術(shù)(MIT)于20世紀(jì)30年代起源于免疫學(xué)，是近些年來興起的一種交叉學(xué)科技術(shù)[6]。它利用交聯(lián)劑、功能單體和模板分子，在特定的條件下聚合得到產(chǎn)物。這種聚合物通常具有與模板分子相應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)，形成的吸附位點能夠與模板分子相匹配，形成在三維尺度上和模板分子相契合并且對其具有良好選擇、“記憶”的空穴?！坝洃洝笨昭ㄅc模板分子無論是在空間結(jié)構(gòu)、作用位點及大小上都高度“契合”，具有特異識別功能，對模板分子能夠快速、高效、特異性地選擇吸附。MIT具有對模板分子優(yōu)異的識別能力以及更強(qiáng)的穩(wěn)定性，促使其在臨床藥物檢測與分析、分離技術(shù)、仿生傳感器等諸多方面具有十分良好的應(yīng)用前景[7-14]。

本研究采用沉淀聚合法，以阿魏酸為模板分子，偶氮類的偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，丙烯酰胺為功能單體，乙烯-丙烯酸共聚物的乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，制備對模板分子具有特異識別功能的阿魏酸印跡聚合物微球(MIPs)。研究模板分子、功能單體與交聯(lián)劑以及引發(fā)劑等反應(yīng)物之間的最佳反應(yīng)比例、反應(yīng)時間，及其選擇吸附性。該方法操作簡單，生成的MIPs球粒徑均勻，有望為阿魏酸的分離和提純提供新途徑。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

氮氣，阿魏酸(FA，AR)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，肉桂酸(AR)，偶氮二異丁腈(AIBN，CP)，乙腈(AR)，甲醇(AR)，乙酸(AR)和丙烯酰胺(AM，CP)。

STA449F3同步熱分析儀，S-3400N掃描電子顯微鏡(SEM)，UNIC-2000紫外可見分光光度計(UV-Vis)和IS10 傅立葉紅外光譜儀(FTIR)。

2.2 實驗方法

2.2.1制備MIPs 準(zhǔn)確稱取0.25 mmol FA作為模板分子放入錐形瓶中，并加入60 mL的乙腈以及1 mmol功能單體AM，在(20±5)℃下超聲振蕩1 h，使反應(yīng)物充分作用。將錐形瓶取出放置在4 ℃冰箱中，靜置，12 h過夜。之后取出錐形瓶，在碘量瓶中依次加入6.25 mmol的交聯(lián)劑EDMA、36.6 mg的引發(fā)劑AIBN，在(20±5)℃下超聲振蕩5 min，后充N210 min，密封。然后，將錐形瓶置于恒溫水浴鍋中在60 ℃的溫度下反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后，取出沉淀物(即未洗脫的MIPs)進(jìn)行抽濾，將沉淀物用100 mL甲醇/乙酸混合溶液(V甲醇/V乙酸=6∶4)于90 ℃的恒溫水浴中在索氏提取器中洗脫24 h，以將模板分子(FA)和未參與反應(yīng)的物質(zhì)脫除。洗脫后抽濾，并用甲醇洗去多余的乙酸，得到白色粉末狀產(chǎn)物。烘干白色粉末狀產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物為MIPs，置干燥器中備用。

除不加入FA外，非印跡聚合物微球(NMIPs)制備的操作步驟與印跡聚合物相同。

2.2.2聚合物結(jié)構(gòu)形貌及結(jié)構(gòu)表征 采用SEM對微球的表面進(jìn)行觀察；用溴化鉀壓片法測定，在4000～400 cm-1范圍內(nèi)測定FA、MIPs、NMIPs及未洗脫的MIPs紅外光譜，并進(jìn)行分析。

2.2.3熱分析法 用同步熱分析儀在N2氣氛下，對MIPs的熱穩(wěn)定性進(jìn)行測試,升溫速率控制在15 K/min，升溫至800 ℃。

2.2.4MIPs的吸附性能研究 準(zhǔn)確稱取0.09 g的FA溶于乙腈中配置成濃度為0.9 g/L的FA標(biāo)準(zhǔn)乙腈溶液。分別稱取第2.2.1節(jié)中制備的MIPs置于小燒杯中，準(zhǔn)確量取15 mL FA標(biāo)準(zhǔn)乙腈溶液到裝有MIPs的小燒杯中，在室溫下超聲震蕩后，放置24 h離心分離。取1 mL離心后上層清液定容到25 mL的容量瓶。用乙腈為溶劑，在λ=320 nm測量其吸光度，按照圖1及式(1)計算出相對吸附量Q(mg/g)[15]。

(1)

式中：C0為FA標(biāo)準(zhǔn)乙腈溶液的初始濃度，g/L；C為吸附后溶液中FA的濃度，g/L；V0為溶液的體積，L；m為MIPs的質(zhì)量，g。

圖1 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)與吸光度(A)線性圖Fig.1 Standard curve of ferulaic acid

2.2.5MIPs的選擇吸附性能 選取結(jié)構(gòu)與FA相似的肉桂酸為底物，采用靜態(tài)平衡吸附法研究聚合物的選擇吸附性[16]。稱取2份MIPs置于由相同質(zhì)量配制成的FA、肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)乙腈溶液中超聲震蕩放置24 h，離心后取上清液1 mL于25 mL容量瓶中用乙腈定容。根據(jù)式(1)、(2)分別計算MIPs對FA和肉桂酸的特異性吸附量。

Q=QMIPs-QNIPs

(2)

FA和肉桂酸結(jié)構(gòu)式見圖式1。

圖式1 肉桂酸和阿魏酸的結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Structure of cinnamic acid and ferulaic acid

3 結(jié)果與討論

3.1 MIPs和NMIPs的微觀形貌觀察

從圖2可見，在相同的時間、溫度及攪拌速率的條件下制得的MIPs與NMIPs，大小較均勻，球形度較好，外觀無明顯差異。MIPs和NMIPs在放大5000倍的電鏡下形貌固然相似，但是MIPs形狀更圓潤，粒徑分布均勻性較NMIPs好。其原因可能是FA會與AM形成氫鍵，使MIPs具有更多印跡“空穴”。這些“空穴”源于為FA“專屬定制”的，因而空穴的三維網(wǎng)絡(luò)空間大小及形狀與FA完全契合，F(xiàn)A所含的特征基團(tuán)與MIPs空穴內(nèi)的表面基團(tuán)高度互補，致使MIPs對模板分子具有強(qiáng)大的“記憶力”。

圖2 聚合物的電鏡掃描圖片 (a)MIPs，(b)NMIPsFig.2 SEM images of (a) MIPs and (b) NMIPs

圖3 (a)阿魏酸，(b)未洗脫MIPs，NMIPs和MIPs的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectrogram of (a)FA and (b) No elution MIPs, NMIPs and MIPs

3.2 紅外光譜分析

圖3給出FA、未洗脫MIPs、NMIPs及MIPs的紅外光譜圖。從圖可見，F(xiàn)A與其他三種聚合物的紅外光譜圖存在顯著區(qū)別。圖3(a)中，F(xiàn)A的羥基的吸收峰在3432 cm-1處，羧基結(jié)構(gòu)上-C=O的特征吸收在1693 cm-1處出現(xiàn)，在1625和1514 cm-1處出現(xiàn)的是苯環(huán)的吸收峰。從圖3(b)上可見，AM骨架上的-C=O伸縮振動峰在1724 cm-1處，C-H伸縮振動峰在2958 cm-1處，伯胺基團(tuán)上的N-H伸縮振動峰在3447 cm-1處出現(xiàn)。未洗脫MIPs中含有FA，F(xiàn)A的苯環(huán)骨架的振動峰在1625 cm-1，然而，NMIPs及MIPs在此處都無吸收峰，這說明NMIPs和MIPs中不存在模板分子FA，F(xiàn)A已經(jīng)被完全除去。圖3(b)中還可以知，MIPs的吸收峰相較于NMIPs的吸收峰更為尖銳，這意味著NMIPs表面可能有更多的游離-OH，這可能是由于氫鍵存在直接會影響羥基的振動，從而造成NMIPs的吸收譜較MIPs的寬。

3.3 熱重分析

將MIPs和NMIPs完全干燥后的樣品在STA-449 F3同步熱分析儀中，N2氛圍下進(jìn)行熱重實驗，測量分析聚合物的穩(wěn)定性。

從圖4可見，在0～102 ℃，隨著溫度升高M(jìn)IPs和NMIPs二者質(zhì)量均呈下降趨勢，這可能與溫度上升，聚合物中存在的少量水分蒸發(fā)有關(guān)。在102～281 ℃，曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢，說明在該溫度范圍內(nèi)微球質(zhì)量保持相對穩(wěn)定；在281～450 ℃，MIPs和NMIPs質(zhì)量有明顯的下降趨勢，尤其在281～355 ℃，MIPs失重率比NMIPs失重率的下降速率大。造成這種現(xiàn)象的原因可能是MIPs表面存在大量的“記憶”空穴，在此溫度條件下微球的破壞主要發(fā)生在表面，使得MIPs表面結(jié)構(gòu)較NMIPs更疏松，即在此溫度區(qū)間MIPs的熱穩(wěn)定性比NMIPs的低。在340～396 ℃，MIPs與NMIPs的質(zhì)量下降速率基本相同。在396～450 ℃，NMIPs的質(zhì)量下降速率大于MIPs的質(zhì)量下降速率，這可能與在此溫度區(qū)間微球的破壞發(fā)生在微球內(nèi)部，從而減緩了高溫對微球的破壞作用，使得微球質(zhì)量減小的速率有所減緩有關(guān)。在450～800 ℃溫度區(qū)間，隨著溫度升高，MIPs和NMIPs的失重率下降不多，表明微球基本完全燃燒，MIPs的失重率可達(dá)98.51%，NMIPs的失重率達(dá)98.32%。

圖4 聚合物的TG曲線Fig.4 TG curves of polymers

3.4 不同反應(yīng)條件對MIPs吸附性能的影響

3.4.1AIBN用量對吸附性量的影響 從圖5可以看出，隨著AIBN用量增多MIPs的吸附量持續(xù)上升，當(dāng)AIBN用量達(dá)到0.0366 g時MIPs的吸附量在該實驗條件下達(dá)到最大值129.20 mg/g，之后隨著引發(fā)劑用量增加其吸附量呈下降趨勢。其原因是：在吸附量達(dá)到最大值之前，引發(fā)劑用量的不足使反應(yīng)不完全，只有部分反應(yīng)物參與反應(yīng)，但隨著引發(fā)劑用量的增加，生成的自由基逐漸增多，聚合速度加快，得到的MIPs增多，吸附量也增加；達(dá)0.0366 g到后，在功能單體用量固定的情況下，引發(fā)劑用量增加，反而會形成一些結(jié)構(gòu)不完整的印跡位點，致使MIPs的吸附性能下降。

圖5 AIBN對MIPs吸附性能的影響Fig.5 Influences of Different Amounts of AIBN on Adsorption property of MIPs

圖6 功能單體AM的相對用量對MIPs的吸附性能的影響Fig.6 Influences of different amounts of functional monomer on adsorption property of MIPs

3.4.2功能單體AM用量對吸附性能的影響 由圖6可以看出，隨著功能單體AM用量的增加，MIPs的吸附量上升。當(dāng)AM量超過0.07 g后，吸附量達(dá)到最大值為128.460 mg/g。之后，隨著AM用量增加，吸附量反而降低。原因或許是在AM用量較少時，絕大多數(shù)的模板分子未能參與反應(yīng)，少量的AM與FA形成絡(luò)合物，起初所形成的MIPs量少，且MIPs中具契合模板分子“空穴”數(shù)目也很少，吸附量不高；隨著AM用量的增加，MIPs中具有契合模板分子 “空穴”增多，對FA的吸附量顯著增加，直到最佳值。但是，由于模板分子數(shù)量有限，要形成有效的“空穴”過量的功能單體反而會造成一定干擾，促使MIPs的識別能力變差，從而使吸附量降低[17]。

3.4.3EDMA量對吸附量的影響 從圖7可見，MIPs吸附量隨著EDMA量的增加先表現(xiàn)為上升的趨勢，當(dāng)交聯(lián)劑用量達(dá)到1.24 g后，MIPs的吸附量達(dá)到最大值128.91 mg/g，之后隨著交聯(lián)劑用量增加吸附量而呈現(xiàn)下降趨勢。開始時吸附量增加，可能與使用的交聯(lián)劑較少，使得制備的MIPs不具有很好的交聯(lián)度，微球的物理性能較差，以及在制備及洗脫過程中對印跡空穴造成破壞，使得微球中FA空穴的結(jié)構(gòu)不完整，吸附性能低有關(guān)。隨著交聯(lián)劑的增加，其交聯(lián)度逐漸提高，吸附量增加，達(dá)到吸附飽和狀態(tài)后再加入交聯(lián)劑，則會使微球交聯(lián)度密度提高，導(dǎo)致微球結(jié)構(gòu)過于緊密從而給洗脫帶來困難，反而導(dǎo)致微球的吸附性能下降。

圖7 交聯(lián)劑的相對用量對MIPs吸附性能的影響Fig.7 Influences of different amounts of functional monomer on adsorption property of MIPs

3.4.4反應(yīng)時間對吸附量的影響 從圖8可見，MIPs的吸附量隨著反應(yīng)時間的增加而提高，當(dāng)反應(yīng)24 h時達(dá)最大值，之后基本穩(wěn)定。其原因是MIPs和空穴數(shù)量也會隨著反應(yīng)時間增加，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到24 h時，反應(yīng)基本完成，空穴數(shù)量不再增加，吸附趨于穩(wěn)定。

圖8 不同反應(yīng)時間對MIPs吸附性能的影響Fig.8 Influences of different reaction time on adsorption property of MIPs

3.5 MIPs選擇吸附性能的研究

采用與FA結(jié)構(gòu)類似的肉桂酸作為競爭底物，采用動態(tài)平衡吸附法，研究MIPs對模板分子FA的選擇識別性能。按式(3)計算MIPs對底物的特異性吸附量：

Q=QMIPs-QNMIPs

(3)

式中：QMIPs和QNMIPs分別為MIPs與NMIPs對底物的最大吸收量，將 MIPs對Fa的選擇因子α定義為1，其它底物(肉桂酸)的選擇因子α定為MIPs對其它底物特異性吸附量與對FA的比值[18-19]。其中當(dāng)α越接近于1則說明MIPs對底物的選擇吸收性越好。

由表1可以看出，MIPs對FA的特異吸附量為175.467 mg/g，大于對其結(jié)構(gòu)類似肉桂酸的吸附量(113.360 mg/g)，這表明MIPs對模板分子FA具有良好的選擇性，MIPs中的“空穴”與FA匹配，表現(xiàn)出很高的吸附性。由于肉桂酸與FA結(jié)構(gòu)較為相似，因此MIPs對肉桂酸也表現(xiàn)出一定程度的吸附。但由于肉桂酸與FA結(jié)構(gòu)略有不同，不能完全匹配FA的印跡“空穴”，因此MIPs對肉桂酸表現(xiàn)為較低的吸附性。由表1還可以看出，NMIPs對FA的吸附量為100.529 mg/g，對肉桂酸的吸附量為98.269 mg/g，非常接近，說明NMIPs對FA及其結(jié)構(gòu)類似物不具有選擇性。

3.6 MIPs等溫靜態(tài)吸附曲線

采用等溫靜態(tài)平衡吸附法研究吸附性能。在實驗過程中配置濃度0.1～1.6 mg/mL一系列濃度梯度的阿魏酸乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，將MIPs與NMIPs分別在這一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附24 h后，測定溶液中阿魏酸濃度，得到靜態(tài)吸附曲線，如圖9所示。

圖9 MIPs與NMIPs的靜態(tài)吸附曲線Fig.9 Static adsorption curve of MIPs and NMIPs

從圖可見，在0.1～1.6 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著FA溶液濃度的增大，MIPs與NMIPs的吸附量都得到提高，然而，在較高濃度下MIPs的吸附量顯著高于NMIPs。這表示MIPs和NMIPs在空間結(jié)構(gòu)上存在明顯的差異。MIPs中加入了模板分子FA，因此存在與FA分子匹配的“記憶空穴”，而NMIPs中未加入模板分子，因此不具備與FA分子匹配的“記憶空穴”，MIPs吸附能力遠(yuǎn)大于大于NMIPs。

采用Scatchard模型研究MIPs對模板分子的結(jié)合特性。Scatchard方程[20]為：

(4)

其中，Qmax為結(jié)合位點的最大表觀結(jié)合量(mg/g)，Kd為結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)(mg/mL)，C為FA在上層清液中的平衡濃度(mg/mL)。

以Q/C對Q做圖可以得到Scatchard分析圖，見圖10。

圖10 MIPs的Scatchard分析曲線Fig.10 Scatchard Plots of MIPs

從圖可見，Q/C對Q整體呈非線性關(guān)系，表明MIPs對FA的結(jié)合位點是不等價的。當(dāng)Q分別為21.610～128.721 mg/g和128.721～175.467 mg/g時，Q/C與Q呈線性關(guān)系。以Q/C對Q作圖，根據(jù)式(4)以可以求得高親和位點的離解常數(shù)為Kd1=0.187 mg/mL，Qmax1=195.572 mg/g；低親和位點的離解常數(shù)Kd2=0.354 mg/mL，Qmax2=248.724 mg/g。這顯示0.1～1.6 mg/mL濃度范圍內(nèi)MIPs對FA存在不同的結(jié)合位點，具有不均一性[21]，可能是由于模板分子FA結(jié)構(gòu)中存在的-COOH和-OH能同時與AM發(fā)生絡(luò)合，導(dǎo)致在交聯(lián)反應(yīng)以后形成了兩種顯著差異性的結(jié)合位點。如圖11所示。

圖11 阿魏酸印跡示意圖Fig.11 Chemical process to imprint polymer with ferulaic acid

4 結(jié) 論

采用沉淀聚合法制備了MIPs，通過篩選反應(yīng)條件，結(jié)構(gòu)及性能表征，以及吸附性能的測試，得到如下結(jié)論:

1．制備MIPs最佳的反應(yīng)條件是AM用量為0.07 g，EGMA為1.24 g，AIBN用量為0.0366 g，反應(yīng)時間為24 h。所制備的MIPs粒徑均一，球形度好。

2．MIPs對模板分子FA具有較高的選擇吸附性，NMIPs對底物的識別不具備選擇性。通過Scatchard分析得到高親和位點的離解常數(shù)為Kd1=0.187 mg/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax1=195.572 mg/g；低親和位點的離解常數(shù)Kd2=0.354 mg/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax2=248.724 mg/g。MIPs與NMIPs的熱穩(wěn)定性相差不大。