聚多巴胺涂層表面PEG聚合物刷微圖案的制備

王永成，趙海利，謝林生，馬玉錄，沙 金

(華東理工大學(xué)機(jī)械與動力工程學(xué)院，上海 200237)

1 前 言

表面聚合物刷作為實現(xiàn)材料表面多功能化的重要手段，在智能表面[1-2]、防污涂層[3-4]、生物功能化表面[5-6]和電子[7]等多領(lǐng)域都有著重要作用。表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合SI-ATRP(surface-initiated atom transfer radical polymerization)具有單體范圍廣、反應(yīng)條件耐受性強(qiáng)、聚合物刷化學(xué)組成及分子結(jié)構(gòu)可調(diào)等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于表面聚合物刷微圖案的制備[8-9]。自1995年Matyjaszewski等[10]提出ATRP反應(yīng)技術(shù)以來，ATRP反應(yīng)的發(fā)展經(jīng)歷了反向ATRP、正向反向共存ATRP[11]、引發(fā)劑持續(xù)再生活化ATRP[12]、電子轉(zhuǎn)移生成活化劑ATRP[13]、電子轉(zhuǎn)移再生活化劑ATRP[14]、電化學(xué)調(diào)控ATRP[15]以及光誘導(dǎo)ATRP[16-19]等階段，其中光誘導(dǎo)ATRP以其反應(yīng)過程溫和、高效且聚合過程“開”和“關(guān)”可控而受到了廣泛的關(guān)注。

傳統(tǒng)ATRP引發(fā)劑的接枝通常是通過將羥基或胺基功能化的基底浸泡在硅氧烷引發(fā)劑的溶液中來完成。馬康等[20]將食人魚溶液處理得到的羥基化硅片基底浸泡在配制好的引發(fā)劑溶液中反應(yīng)24 h，實現(xiàn)了表面引發(fā)劑接枝的硅片基底。雖然該方法可在交聯(lián)聚苯乙烯、乙烯-丙烯酸共聚物、聚偏氟乙烯、聚(醚酮)等材料表面實現(xiàn)引發(fā)劑接枝，但對于有機(jī)溶劑和試劑敏感的基體材料并不適用。因此，氣相附著法、微接觸印刷法和逐層沉積法等被開發(fā)并用于溶劑敏感基體材料表面的引發(fā)劑接枝。其中，利用聚多巴胺(PDA)涂層來輔助引發(fā)劑接枝的方法得到了廣泛關(guān)注。利用PDA的仿生原理，PDA涂層制備過程簡單且適用于各種類型基質(zhì)表面的改性，輔助引發(fā)劑接枝可以在一定程度上規(guī)避基材選擇對表面引發(fā)劑接枝的束縛。同時PDA涂層表面富含的氨基官能團(tuán)，能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附，具有良好的生物相容性，因此在材料表面仿生功能化應(yīng)用領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[21-22]。

聚乙二醇(PEG)具有優(yōu)異的生物相容性和非特異性抗蛋白吸附特性，被廣泛地應(yīng)用于生物細(xì)胞黏附控制[20,23]。本文作者以PDA涂層表面PEG聚合物刷微圖案的制備為研究對象，通過烷基溴官能化多巴胺的自氧化聚合形成PDA涂層；采用光催化SI-ATRP反應(yīng)，以低聚乙二醇甲基丙烯酸酯OEGMA(oligo(ethylene glycol) methacrylate)為聚合單體，CQ為光氧化還原催化劑，PDA涂層為中間層，在多種基底表面上制備具有優(yōu)異抗蛋白吸附特性的PEG聚合物刷微圖案?，F(xiàn)階段光誘導(dǎo)ATRP的光催化劑主要采用金屬催化劑，由于具有多重價態(tài)的金屬催化劑，易與PDA表面鄰苯二酚螯合，導(dǎo)致PDA表面一定量的金屬催化劑沉積，因此研究采用樟腦醌(CQ)這種非金屬光催化劑在PDA表面引發(fā)ATRP反應(yīng)[24]。通過X射線光電子能譜(XPS)技術(shù)對PDA涂層及其表面生長的PEG聚合物刷進(jìn)行化學(xué)組成分析；通過橢圓偏光儀和AFM表征PDA涂層及其表面生長的PEG聚合物刷的厚度和表面形貌；通過激光共聚焦顯微鏡對材料表面熒光染色的表征來驗證異硫氰酸熒光素(FITC)染色牛血清蛋白在PEG聚合物刷微圖案表面的吸附情況；通過光學(xué)顯微鏡觀察不同基底表面制備PEG聚合物刷微圖案的形貌。該項研究進(jìn)一步拓展了光催化SI-ATRP在不同基體材料表面制備聚合物刷微圖案的應(yīng)用，同時為PEG聚合物刷微圖案技術(shù)在藥物運輸、生物傳感以及細(xì)胞篩選方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

2 實 驗

2.1 主要原料

多巴胺(DA)：純度>98%；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)：純度>95%；低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA)：分子量500；樟腦醌(CQ)：純度>98%。N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)：純度>99%；異硫氰酸熒光素(FTIC)：純度>90%。BSA牛血清蛋白：純度>96%；PBS緩沖溶液(pH=7.3)；2-溴異丁酰溴(BIBB)：純度>98%；三乙胺、二甲基甲酰胺(DMF)：化學(xué)純；硅片：100 nm氧化層，尺寸1.0 cm×1.0 cm。

2.2 PEG聚合物刷的制備

2.2.1烷基溴官能化聚多巴胺黏附 在Schlenk瓶中，將多巴胺(200 mg，1.05 mmol)充分溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF，10 mL)中。進(jìn)行30 min氮氣脫氣處理后，在氮氣氛圍下向反應(yīng)溶液中緩慢滴加2-溴異丁酰溴(BIBB，0.022 mL，0.175 mmol)和三乙胺(0.025 mL，0.175 mmol)，并攪拌混合3 h。后將該混合液轉(zhuǎn)移到燒杯中，加入三羥甲基氨基甲烷(Tris)(240 mg，2.0 mmol)和去離子水(50 mL)，并以200轉(zhuǎn)/分的速度連續(xù)攪拌混合液。將經(jīng)表面清洗處理后的硅片、玻璃片和聚苯乙烯薄片浸沒在上述混合液中并在黑暗條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，取出硅片、玻璃片和聚苯乙烯薄片并依次用乙醇和去離子水沖洗并用氮氣吹干，密封保存。上述PDA涂層黏附過程如圖1(a)所示。

圖1 (a) 引發(fā)劑接枝示意圖； (b) 激光輻照過程及(c)光調(diào)控SI-ATRP反應(yīng)制備PEG聚合物刷示意圖Fig.1 (a) Scheme of the initiator grafting on silicon substrate; (b) laser illumination apparatus setup; (c) patterned PEGMA brushes fabricated via laser-mediated SI-ATRP

2.2.2光調(diào)控表面引發(fā)OEGMA單體聚合 在Schlenk瓶中配制OEGMA/CQ/DMF反應(yīng)溶液。將脫氣處理后的反應(yīng)單體溶液滴加到經(jīng)過烷基溴官能化PDA涂層處理后的基底表面，并在基底上覆蓋蓋玻片(125μm)以隔絕空氣，隨后將基底置于功率為60 mW/cm2的數(shù)字微鏡裝置(DMD)激光源(波長455 nm)下輻照反應(yīng)10 min。試驗采用的激光輻照裝置及PEG聚合物刷的聚合過程示意圖如圖1(b)和1(c)所示。

2.3 PEG聚合物刷的蛋白吸附測試

將100μL BSA/H2O(100 mg/mL)溶液、100μL FITC/DMF(10 mg/mL)溶液與900μL Na2CO3-NaHCO3(pH=9.0，0.1 mol/L)緩沖溶液充分混合，得到濃度為10 mg/mL的FITC-BSA溶液。然后，在4℃避光條件下使該混合溶液連續(xù)反應(yīng)12 h以完成FITC對BSA的熒光標(biāo)記。接著用PBS緩沖溶液將FITC-BSA溶液稀釋至2 mg/mL，隨后將表面接枝有PEG聚合物刷的硅片浸入FITC-BSA/PBS溶液中。避光條件下靜置3 h后，將樣品取出并用PBS溶液沖洗三次，后置于PBS溶液中密封保存。所有操作過程都應(yīng)該盡可能地避免光照。

2.4 表征與測試

使用光學(xué)顯微鏡(Axioskop 40A)觀察PEG聚合物刷微圖案的光學(xué)顯微圖像。采用原子力顯微鏡(Solver P47-PRD)表征PDA涂層及PEG聚合物刷的表面形貌。采用XPS(PHI 5000)表征PDA涂層和PEG聚合物刷表面化學(xué)組成。采用變角度光譜橢圓偏光儀(RISE Zenith V)表征PEG聚合物刷的厚度，采用Filmwizard軟件按照PDA涂層和聚合物刷層兩層模型進(jìn)行擬合，其中PDA涂層的折射率為1.73，PEG聚合物刷層的折射率為1.46。采用激光共聚焦顯微鏡觀察PEG聚合物刷微圖案的蛋白吸附熒光圖像。

3 結(jié)果與討論

3.1 PDA涂層表面及PEGMA聚合物刷表面的化學(xué)組成

圖2(a)為烷基溴官能化PDA涂層表面(BIBB∶dopamine=1∶2，1∶6)以及接枝PEG聚合物刷(Si-g-PEGMA)硅片表面的XPS全掃描譜圖。在PDA涂層表面的XPS全掃描譜圖中，C1s(285ev)和O1s(533ev)譜峰對應(yīng)于涂層表面的苯環(huán)、烷基及羥基等基團(tuán)。在PEG聚合物刷表面的XPS全掃描譜圖中，C1s(285ev)和O1s(533ev)譜峰對應(yīng)于表面的烷基鏈及乙二醇重復(fù)單元。Br3d(70ev)譜峰對應(yīng)于PDA涂層中的烷基溴，N1s(400ev)譜峰對應(yīng)于聚多巴胺分子鏈上的N原子。在表面生長PEG聚合物刷后，Si2s和Si2p 2/3的峰強(qiáng)度大大降低，且C1s與O1s的峰強(qiáng)比增加，這主要是由于PEG聚合物刷層相較于聚多巴胺涂層擁有更高的C/O元素比例。圖2(b)中的(I)和(II)分別為BIBB與DA的摩爾比為1∶2及1∶6時PDA涂層的Br3d元素譜峰。由圖可知，當(dāng)引發(fā)劑中BIBB與DA摩爾比為1∶6時，PDA涂層表面烷基溴官能團(tuán)密度(譜峰面積2130.65)高于BIBB與DA摩爾量為1∶2時的表面烷基溴官能團(tuán)密度(譜峰面積為1896.72)，表明在制備PDA涂層時，通過調(diào)節(jié)BIBB的量可以調(diào)控PDA涂層的烷基溴官能化密度，且在BIBB與DA摩爾比為1∶6時，烷基溴官能化密度達(dá)到一個較高水平。圖2(c)為BIBB與DA摩爾比為1∶6時PDA涂層的C1s高分辨率分峰譜圖，其中288.3、285.9和284.6eV處譜峰分別對應(yīng)O-C=O，C-O/C-Br/C-N和C-C/C-H，相應(yīng)的譜峰強(qiáng)度比例分別為7.88%，40.10%和52.02%。目前，BIBB與DA反應(yīng)形成烷基溴官能化PDA涂層的機(jī)理尚無定論。Zhu B C以及Wang W C等人[25-26]認(rèn)為聚多巴胺涂層形成過程中BIBB主要與多巴胺鄰苯二酚中的酚羥基反應(yīng)，而Wen J Y等人[27]則認(rèn)為部分BIBB同時與多巴胺中的氨基反應(yīng)。圖2(c)中XPS C1s分峰分析顯示O-C=O基團(tuán)與C-N/C-O/C-Br基團(tuán)的譜峰面積比為0.197∶1，即所得聚多巴胺涂層中O-C=O基團(tuán)與C-N/C-O的摩爾比為0.25∶1。由于反應(yīng)條件中BIBB與DA用量的摩爾比為0.167∶1，可以認(rèn)為在本實驗反應(yīng)過程中BIBB同時與DA中的酚羥基及氨基反應(yīng)。圖2(d)為BIBB與DA摩爾比為1∶6時PEG聚合物刷層的C1s高分辨率分峰譜圖，其中288.3、285.9和284.6eV處譜峰對應(yīng)O-C=O，C-O/C-Br和C-C/C-H，相應(yīng)的譜峰強(qiáng)度比例分別為2.99%，47.61%和49.4%，與BIBB與DA摩爾比為1∶6時PDA涂層的C1s分峰譜圖相比，PEG聚合物刷層中O-C=O基團(tuán)比例顯著降低，這主要是由于PEG聚合物刷中含有豐富的C-O和C-H基團(tuán)所致。

圖2 (a)聚多巴胺涂層(BIBB∶DA=1∶2、1∶6)及PEG聚合物刷層的XPS全掃描譜圖；(b)聚多巴胺涂層(BIBB∶DA=1∶6 (Ⅰ)和1∶2(II))的XPS高分辨Br3d譜圖；(c)聚多巴胺涂層(BIBB∶DA=1∶6)的XPS高分辨C1s譜圖；(d)PEGMA聚合物刷層的XPS高分辨C1s譜圖Fig.2 (a) XPS survey scan spectra of Si-g-Initiator (BIBB∶Dopamine=1∶2, 1∶6) and Si-g-PEGMA; (b) high resolution Br3d spectra of Si-g-initiator (BIBB∶Dopamine=1∶6 (Ⅰ) and 1∶2 (II)); (c) high resolution C1s spectra of Si-g-initiator (BIBB∶Dopamine=1∶6); (d) high resolution C1s spectra of Si-g-PEGMA

3.2 BIBB用量對PDA涂層厚度及表面粗糙度的影響

圖3(a)為不同BIBB用量下烷基溴官能化PDA涂層的厚度變化曲線。由圖可知，PDA涂層的黏附厚度隨BIBB與DA摩爾比的增大而逐漸減小，在摩爾比達(dá)到1∶1時PDA涂層黏附厚度趨向于零。這主要是由于BIBB與DA中的鄰苯雙酚官能團(tuán)及氨基官能團(tuán)反應(yīng)，抑制了多巴胺在材料表面的自氧化聚合進(jìn)程，降低了PDA與材料表面間的共價或非共價相互作用。此外，當(dāng)BIBB與DA的摩爾比小于1∶6時，PDA涂層黏附厚度隨著BIBB使用量的增加而迅速減小。圖3(b)、(c)、(d)分別為BIBB與DA的摩爾比分別為1∶2、1∶6和1∶8時的PDA涂層表面三維相貌圖。隨著BIBB用量的降低，PDA涂層表面粗糙度呈整體增大趨勢，當(dāng)BIBB與多巴胺摩爾比為1∶6時的PDA涂層表面擁有最高的均方根粗糙度(RMS=29.5 nm)。

圖3 (a)不同BIBB與DA摩爾比下聚多巴胺涂層的厚度生長曲線；不同摩爾比時的表面三維形貌圖像：(b)BIBB∶DA=1∶2，(c)BIBB∶DA=1∶6和(d)BIBB∶DA=1∶8Fig.3 (a)The thickness of polydopamine as function of molar ratio of BIBB and Dopamine, as determined by ellipsometry; additional three-dimensional AFM height images of the polydopamine with different molar ratio of BIBB and Dopamine at: (b) BIBB∶DA=1∶2, (c) BIBB∶DA=1∶6 and (d) BIBB∶DA=1∶8

圖4 不同條件下PEG聚合物刷厚度變化曲線：(a)不同BIBB與DA摩爾比條件下；(b)不同OEGMA與CQ摩爾比條件下；(c)不同曝光時間條件下Fig.4 Thickness of PEGMA brushes on PDA coating: (a) different molar ratio of BIBB and DA, (b) different molar ratio of OEGMA and CQ and (c) different exposure time

3.3 反應(yīng)條件對PEG聚合物刷厚度的影響

圖4(a)為烷基溴官能化PDA涂層中不同BIBB含量對所得PEG聚合物刷厚度的影響曲線。由圖可知，PEG聚合物刷厚度隨著BIBB與DA摩爾比的變化呈先上升后下降的趨勢，并在BIBB與DA的摩爾比為1∶6時達(dá)到最大值。該趨勢與前述PDA涂層表面XPS的表征結(jié)果一致，表明表面烷基溴官能團(tuán)密度對聚合物刷生長有著重要的影響，較高的表面烷基溴官能團(tuán)密度更有利于PEG聚合物刷的生長，這是因為較高的烷基溴官能團(tuán)密度利于提高表面聚合物刷的接枝密度，進(jìn)而有助于所得聚合物刷厚度的增加。圖4(b)為反應(yīng)溶液中不同OEGMA/CQ摩爾比條件下所得PEG聚合物刷的厚度變化曲線。由圖可知，當(dāng)OEGMA與催化劑CQ摩爾比為200時，所得PEG聚合物刷層厚度達(dá)到最大；當(dāng)OEGMA與催化劑CQ摩爾比小于200時，相同反應(yīng)時間PEG聚合物刷厚度隨催化劑CQ濃度的增加而增大；當(dāng)OEGMA與催化劑CQ摩爾量之比大于200時，相同反應(yīng)時間PEG聚合物刷厚度隨催化劑CQ濃度的增加而減小。這是由于過低的催化劑濃度不利于自由基的生成，從而抑制了聚合物刷的生長速率，進(jìn)而影響所得聚合物刷的厚度；而過高的催化劑濃度雖然能在一定程度上提高聚合反應(yīng)速率，但會促使單體溶液向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制表面聚合反應(yīng)的進(jìn)行。因此，過高或者過低的催化劑濃度都不利于PDA涂層表面PEG聚合物刷的生成。圖4(c)為不同光照時間條件下PEG聚合物刷厚度變化曲線。由圖可見，PEG聚合物刷厚度隨光照時間的增加而不斷增大，但厚度增長速率呈現(xiàn)減小趨勢，光照時間達(dá)60 min后PEG聚合物刷厚度幾乎不再增長。這是由于DMD激光照射引發(fā)ATRP反應(yīng)會使單體溶液中的溶劑揮發(fā)速度加快，隨著反應(yīng)的進(jìn)行單體溶液會逐漸轉(zhuǎn)變成凝膠狀，從而終止或減緩了表面ATRP反應(yīng)進(jìn)程。此外，烷基溴官能化聚多巴胺涂層表面溴官能團(tuán)密度較常見自組裝單分子層(SAM)引發(fā)體系低，這也造成所得PEG聚合物刷厚度較其它文獻(xiàn)中的厚度數(shù)值要薄。

3.4 PEG聚合物刷微圖案的蛋白吸附

圖5為吸附有FITC-BSA的硅片表面的激光共聚焦圖像。其中圖5(a)是表面黏附有PDA涂層的硅片樣品的激光共聚焦圖像，由圖可知PDA涂層表面具有明顯的熒光現(xiàn)象；圖5(b)是PDA涂層表面接枝有PEG聚合物刷的硅片樣品的激光共聚焦圖像，與PDA涂層相比，表面覆蓋PEG聚合物刷硅片樣品的激光共聚焦圖像背景更為深暗且無明顯的熒光現(xiàn)象；圖5(c)是PDA涂層表面接枝有圓形PEG聚合物刷微圖案的硅片樣品的激光共聚焦圖像，由圖可知，在圓形PEG聚合物刷微圖案區(qū)域顏色較為深暗且熒光現(xiàn)象不明顯，而聚合物刷微圖案未生長覆蓋的區(qū)域具有明顯的熒光現(xiàn)象。這是由于PEG聚合物刷中乙二醇重復(fù)單元具有良好的親水性能，因此所得PEG聚合物刷具有優(yōu)異的非特異性抗蛋白吸附特性，能夠阻擋FTIC-BSA在表面的黏附。實驗結(jié)果表明PDA涂層表面圖案化的PEG聚合物刷具有良好非特異性抗蛋白吸附作用，可有效阻止牛血清蛋白在硅片表面的吸附。

圖5 FITC-BSA吸附處理后硅片的激光共聚焦圖像：(a)表面帶有PDA涂層覆蓋的硅片；(b)表面帶有PDA涂層及生長PEG聚合物刷覆蓋的硅片；(c)表面帶有PDA涂層及接枝圓形PEG聚合物刷微圖案的硅片F(xiàn)ig.5 Laser confocal images of silicon substrate after FTIC-BSA protein absorption procedure: (a) initiator full-covered silicon substrate; (b) PEGMA brushes full-covered silicon substrate and (c) circle micropatterned PEGMA brushes

3.5 多基底材料表面PEG聚合物刷微圖案的制備

圖6分別為在硅片表面、玻璃表面以及聚苯乙烯表面制備PEGMA聚合物刷微圖案的光學(xué)顯微圖像。利用PDA涂層作為中間層，成功地在多種基底上制備出圖案化聚合物刷，所得PEG聚合物刷微圖案邊界清晰，在硅片表面接枝覆蓋均勻，能夠較為精確地實現(xiàn)各種復(fù)雜微圖案結(jié)構(gòu)。這表明PDA涂層可以使聚合物刷的接枝在一定程度上擺脫由基底材料不同所帶來的限制,這極大地拓寬了聚合物刷在材料表面改性中的應(yīng)用，對進(jìn)一步推動聚合物刷的研究在表面改性領(lǐng)域的擴(kuò)展有著重大且深遠(yuǎn)的意義。

圖6 不同基底PDA涂層表面圖案化PEG聚合物刷的光學(xué)顯微圖像：(a)硅片；(b)玻璃片；(c)聚苯乙烯片F(xiàn)ig.6 Optical images of micropatterned PEG brushes on (a) silicone substrate, (b) glass substrate and (c) polystyrene substrate

4 結(jié) 論

利用SI-ATRP反應(yīng)，以聚多巴胺涂層作為中間層，以樟腦醌作為光氧化還原催化劑，在多種基底材料表面實現(xiàn)了具有優(yōu)異抗蛋白吸附特性的PEG聚合物刷微圖案的制備。對聚多巴胺涂層表面的XPS表征證實了由多巴胺與BIBB體系制備的PDA涂層表面具有較高的烷基溴官能團(tuán)密度，同時當(dāng)BIBB與多巴胺摩爾比為1∶6時，聚多巴胺涂層表面的烷基溴官能團(tuán)密度達(dá)到最大值。對不同反應(yīng)條件下制得的聚合物刷厚度表征證明：(1)PDA涂層表面較高的烷基溴官能團(tuán)密度更有利于PEG聚合物刷的生長；(2)PEG聚合物刷生長的最優(yōu)催化劑用量為當(dāng)催化劑用量與聚合單體用量的摩爾量之比為1∶200；(3)在一定時間內(nèi)，增加曝光時間可以增加PEG聚合物刷接枝厚度。此外，F(xiàn)ITC-BSA蛋白吸附實驗表明在PDA涂層表面制備圖案化PEG聚合物刷能夠較好地在材料表面自定義區(qū)域?qū)崿F(xiàn)非特異性抗蛋白吸附特性。利用聚多巴胺涂層作為中間層，可以使聚合物刷接枝在一定程度上擺脫由基底材料不同所帶來的限制。該研究為拓展PEG基聚合物刷在微流控芯片、細(xì)胞篩選及生物傳感器上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)與技術(shù)路線。