吳茱萸不同產(chǎn)地加工方法HPLC指紋圖譜及多成分含量比較*

王先菊，李 瑋，杜洪志，張 敏，劉亞琴，邱亞磊

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode.)Huang或疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實(shí)，其味辛、苦，性熱，歸肝、脾、胃、腎經(jīng)。具有助陽止瀉、降逆止嘔、散寒止痛的功效。在中醫(yī)臨床以及中成藥生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，主要治療厥陰頭痛、五更泄瀉、嘔吐吞酸、腹部脹痛等相關(guān)病癥[1]。產(chǎn)地加工是中藥飲片形成的重要環(huán)節(jié)，產(chǎn)地加工過程關(guān)系到飲片質(zhì)量的好壞，亦與療效息息相關(guān)，且產(chǎn)地加工是監(jiān)管的薄弱環(huán)節(jié)[2-3]，因此產(chǎn)地加工過程的控制就顯得尤為重要。經(jīng)廣泛查閱文獻(xiàn)，吳茱萸產(chǎn)地加工方法不一，目前主要有曬干、陰干、烘干等方法，由于各地產(chǎn)地加工方法不同，且缺乏具體的工藝參數(shù)，導(dǎo)致市面上吳茱萸藥材的質(zhì)量參差不齊。因此本文通過對(duì)比對(duì)不同產(chǎn)地加工方法吳茱萸的HPLC指紋圖以及進(jìn)行多成分含量測(cè)定，為吳茱萸產(chǎn)地加工方法及工藝提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽默飛高效液相色譜儀(型號(hào)：UltiMate3000，賽默飛)；日本島津高效液相色譜儀(型號(hào)：LC-20AT，日本島津)；三用紫外儀(型號(hào)：ZF-2型，上海市安亭電子儀器廠)；千分之一電子天平(型號(hào)：JT5003，余姚市金諾天平儀器公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號(hào)：HH-2，常州澳華儀器有限公司)；萬分之一電子分析天平(型號(hào)：ME204E，上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，十萬分之一電子分析天平(型號(hào)：AUW220D，蘇州島津儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(型號(hào)：LDP-150，浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司)；真空干燥箱(型號(hào)：DZ-2BC，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 材料

分別收集12批我國(guó)不同地區(qū)的吳茱萸藥材，見表1，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室魏升華教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth的近成熟果實(shí)。去氫吳茱萸堿對(duì)照品(批號(hào)：67909-49-3)、檸檬苦素對(duì)照品(批號(hào)：1180-71-8)、吳茱萸堿對(duì)照品(批號(hào)：518-17-2)、吳茱萸次堿對(duì)照品(批號(hào)：84-26-4)、吳茱萸新堿對(duì)照品(批號(hào)：15266-38-3)，均購(gòu)于貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，以上對(duì)照品均供含量檢測(cè)用。

表1 吳茱萸藥材樣品來源

甲醇(色譜純，天津科密歐公司)；乙腈(色譜純，天津科密歐公司)；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 陰干法

將吳茱萸鮮藥材置于陰涼通風(fēng)處陰干，去除殘余的枝葉、果柄及雜質(zhì)。

2.1.2 曬干法

將吳茱萸鮮藥材置于太陽下曬干，去除殘余的枝葉、果柄及雜質(zhì)。

2.1.3 烘干法

將吳茱萸藥材置于不同干燥箱內(nèi)40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃烘干，去除殘余的枝葉、果柄及雜質(zhì)。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取吳茱萸樣品粉末0.3 g，置50 mL 具塞錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，以0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素、去氫吳茱萸堿、吳茱萸新堿，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，封存，備用。

2.4 色譜條件

Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相0.02%磷酸水(A)-乙腈(B)，柱溫25 ℃，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫60 min(0～10 min，95%～74%A；10～20 min，74%A；20～21 min，74%～45%A；21～37 min，45%A；37～45 min，45%～10%A；45～60 min，10%A)。

2.5 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系

精密吸取吳茱萸混合對(duì)照品溶液1 μL、4 μL、7 μL、10 μL、13 μL、16 μL、19 μL注入高效液相色譜儀中，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿回歸方程分別為：y=65.598x-1.4687(r=0.9999)、y=9.3915x-0.0159(r=0.9999)、y=134.85x-6.4854(r=0.9997)、y=116.29x-2.4592(r=0.9999)、y=62.485x-2.2224(r=0.9999)，結(jié)果表明去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿線性范圍分別在0.2 ～ 3.8 μg、1.016 ～19.304 μg、0.26 ～4.94 μg、0.154 ～2.926 μg、0.224～4.256 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取吳茱萸同一供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿含量的RSD值分別為2.39%、0.76%、0.83%、0.64%、1.01%，表明實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別在 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿含量的RSD值分別為1.40%、1.67%、0.36%、0.59%、1.09%。表明吳茱萸供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次的吳茱萸藥材粉末6份，每份約0.3 g，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿含量的RSD值分別為1.27%、1.21%、0.37%、0.72%、1.22%，表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取6份已知含量的吳茱萸藥材粉末，每份約0.15 g，加入適量對(duì)照品制備溶液，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿含量的平均加樣回收率分別為100.79%、99.82 %、102.54%、99.66%、99.69%，RSD 值分別為1.79%、2.02%、1.56%、1.13%、1.44%。表明該方法準(zhǔn)確可行。

2.6 含量測(cè)定結(jié)果

按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別測(cè)定不同產(chǎn)地加工方法吳茱萸樣品中去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿的含量，以此來判斷不同產(chǎn)地加工方法對(duì)吳茱萸藥材中去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿含量的影響。測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 吳茱萸不同加工方法樣品含量測(cè)定表

2.7 吳茱萸指紋圖譜方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn)

取吳茱萸樣品粉末依照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，并記錄指紋圖譜，通過指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，進(jìn)行峰匹配，所得圖譜之間的相似度在0.991～0.999之間，均大于0.900，符合指紋圖譜的要求。表明該儀器精密度良好。

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取吳茱萸樣品粉末依照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，并記錄指紋圖譜，通過指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，進(jìn)行峰匹配，所得圖譜之間的相似度在0.944～1.000之間，均大于0.900，可見其符合指紋圖譜的要求。表明24 h內(nèi)樣品溶液的成分穩(wěn)定。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取吳茱萸樣品粉末6份，依照2.2項(xiàng)下方法制備供試品平行溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，并記錄指紋圖譜。通過指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，進(jìn)行峰匹配，所得圖譜之間相似度在0.995～1.000之間，均大于0.900，可見其符合指紋圖譜的要求。表明此方法重復(fù)性良好。

2.8 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定

使用“1.2”項(xiàng)下12批吳茱萸藥材為材料，按“2.2項(xiàng)”下的方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄HPLC指紋圖譜，見圖1；取2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖3。然后將12批藥材的指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)》2012版(國(guó)家藥典委員會(huì))，進(jìn)行色譜峰匹配，并生成對(duì)照指紋圖譜，見圖2。

圖1 12批吳茱萸藥材HPLC指紋圖譜共有模式

通過對(duì)12批吳茱萸藥材指紋圖譜進(jìn)行比較，標(biāo)定了10個(gè)指紋圖譜中的共有峰見圖2，與混合對(duì)照品的指紋圖譜圖3進(jìn)行比對(duì)定性，確認(rèn)了3號(hào)峰為去氫吳茱萸堿、5號(hào)峰為檸檬苦素、6號(hào)峰為吳茱萸堿、7號(hào)峰為吳茱萸次堿、10號(hào)峰為吳茱萸新堿。并選擇6號(hào)峰吳茱萸堿作為參照峰，其在吳茱萸藥材指紋圖譜中保留時(shí)間適宜，峰形較穩(wěn)定，另外吳茱萸堿也是吳茱萸藥材的主要成分之一，對(duì)照品易于購(gòu)買，因此選定吳茱萸堿為參照峰。

圖2 對(duì)照指紋圖譜

圖3 混合對(duì)照品圖

2.8.1 吳茱萸藥材相似度的計(jì)算

以“2.8”項(xiàng)下建立的共有模式為參照?qǐng)D譜計(jì)算1～12批樣品的相似度。從相似度數(shù)據(jù)表1和圖1中可以看出不同地區(qū)的吳茱萸藥材相似度在0.294～0.995之間，差異較大，說明不同產(chǎn)地的吳茱萸所含化學(xué)成分差異較大。

表3 12批吳茱萸藥材指紋圖譜相似度分析結(jié)果

2.8.2 吳茱萸不同產(chǎn)地加工方法樣品指紋圖譜與共有模式的比較

將吳茱萸不同產(chǎn)地加工方法樣品測(cè)定的HPLC指紋圖譜導(dǎo)入指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，進(jìn)行色譜峰自動(dòng)匹配，并與建立的共有模式進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表4。

表4 不同加工方法吳茱萸樣品HPLC指紋圖譜相似度分析結(jié)果

結(jié)果表明，不同加工方法的吳茱萸樣品指紋圖譜相似度均在0.900以上，相似度良好，說明不同加工方法的吳茱萸樣品整體化學(xué)成分具有高度的一致性。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)建立了12批吳茱萸藥材HPLC指紋圖譜的共有模式，以共有模式為參照?qǐng)D譜計(jì)算1～12批吳茱萸藥材的相似度，結(jié)果表明，1～12批樣品的相似度差異較大，說明不同產(chǎn)地的吳茱萸藥材相似度差異較大，即產(chǎn)地對(duì)吳茱萸的化學(xué)成分影響較大。吳茱萸不同產(chǎn)地加工方法藥材相似度均在0.900以上，表明不同產(chǎn)地加工方法的吳茱萸藥材整體化學(xué)成分類型相對(duì)穩(wěn)定。然而經(jīng)過不同產(chǎn)地加工方法加工后主要成分含量發(fā)生明顯變化，溫度逐漸升高時(shí)，各成分的含量均有明顯下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)表明，在50 ℃烘干時(shí)，吳茱萸各成分綜合含量最高，為吳茱萸的產(chǎn)地加工方法提供了依據(jù)。綜上，不同產(chǎn)地加工方法吳茱萸藥材，整體化學(xué)成分具有高度的一致性，但各成分內(nèi)在含量有差異，在進(jìn)行產(chǎn)地加工時(shí)，吳茱萸中含有揮發(fā)油類成分，因此不建議采用高溫進(jìn)行加工。應(yīng)注意控制溫度，以50 ℃烘干為宜。