杯碟法中藤黃微球菌的添加方式對(duì)生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶檢出限的影響

劉旸，張麗宏，房玉國(guó)，王勝男，王淼，黃艷玲

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院哈爾濱150028；2.黑龍江省標(biāo)準(zhǔn)化研究院哈爾濱150028）

0 引 言

在畜牧養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，有些不法商販為獲得更多利益，不但對(duì)患病的奶牛濫用抗生素，而且對(duì)處于治療過(guò)程中的奶牛進(jìn)行榨奶[1-2]，這就造成生鮮乳中殘留有抗生素。為達(dá)到分解殘留的抗生素目的就會(huì)采用生鮮乳中添加β-內(nèi)酰胺酶[3-5]。β-內(nèi)酰胺酶作用于抗生素產(chǎn)生的噻唑酸物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)[6-8]。雖然現(xiàn)在人們開(kāi)始重視β-內(nèi)酰胺酶的添加對(duì)生鮮乳的品質(zhì)有不良的影響，但是近幾年關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)的研究并不是很多。早在2009年我國(guó)就將β-內(nèi)酰胺酶列為違禁添加物，不得檢出[9]。關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法有很多種，但主要還是采用微生物檢測(cè)方法。其中的杯碟法因其結(jié)果準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好被列為β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[10]。

2009年衛(wèi)生部發(fā)布的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物檢驗(yàn)方法:杯碟法》和2018年實(shí)施的NY/T 3313-2018《農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測(cè)定（第一法杯碟法）》，都是采用杯碟法測(cè)定生鮮乳中的β-內(nèi)酰胺酶含量。雖然兩個(gè)方法標(biāo)準(zhǔn)中添加藤黃微球菌的方式略有不同，但是卻是國(guó)內(nèi)一直公認(rèn)的微生物檢驗(yàn)方法。2009年衛(wèi)生部發(fā)布的方法，在當(dāng)時(shí)是唯一能夠確證試劑盒檢驗(yàn)β-內(nèi)酰胺酶的方法，以避免試劑盒檢驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性的判定。2018年發(fā)布的NY/T 3313-2018雖然在標(biāo)準(zhǔn)加入“第二法膠體金快速試紙條法”檢測(cè)方法，但是在該方法中明確規(guī)定了要用“第一法杯碟法”確證后，才能上報(bào)“β-內(nèi)酰胺酶檢出”。杯碟法在所有檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的方法是成本最低的，但是也是操作起來(lái)最繁瑣的。2018年實(shí)施的NY/T 3313-2018《農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測(cè)定（第一法杯碟法）》中就是簡(jiǎn)化了藤黃微球菌的添加方式。但是兩種方法判定生鮮乳中是否添加了β-內(nèi)酰胺酶的判定方式是相同的，都是觀察A、B兩個(gè)抑菌圈的差值來(lái)判定。所以能靈敏的檢測(cè)出越低濃度的β-內(nèi)酰胺酶和清晰的觀察到抑菌圈以便于能夠準(zhǔn)確的測(cè)出A、B兩個(gè)抑菌圈的差值是很有研究意義的。國(guó)外關(guān)于這方面的研究幾乎沒(méi)有，而且在國(guó)外一直也沒(méi)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉（AR，Lot 20150615），天津市科密歐化學(xué)時(shí)間有限公司；無(wú)水磷酸二氫鉀（Sigm a-VETEC），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；無(wú)水磷酸氫二鉀，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（Sigm a），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品（D r Ehrenstorfer Gm bH）、青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品（Sigm a-Fluka），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，MEMMER T；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海光譜儀器；電子分析天平，北京賽多利斯；游標(biāo)卡尺，杭宇。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將實(shí)驗(yàn)用菌株藤黃微球菌（Micrococcus luteus,CMCC(B)28001）（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(C ICC)），接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37±1℃，培養(yǎng)18～24 h，連續(xù)傳三代備用。將活化好的藤黃微球菌，用無(wú)菌8.5%生理鹽水從斜面上洗下來(lái)，制成實(shí)驗(yàn)用菌懸液[11]。用紫外分光光度計(jì)在450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)其200倍稀釋液，吸光度值約為0.89，即終濃度為1×1010CFU/m L[10,12]。

1.3.2 模擬樣品的制備

由于對(duì)于β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的研究很少[11,14]，通常采用現(xiàn)用現(xiàn)配的方式制備β-內(nèi)酰胺酶模擬樣品。將0.01 U/m L的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液用無(wú)菌無(wú)抗無(wú)β-內(nèi)酰胺酶的純牛奶[15-17]進(jìn)行定容稀釋?zhuān)謩e配制成含有 0.001、0.0005、0.00025、0.0002、0.0001、0.00005 U/m Lβ-內(nèi)酰胺酶模擬樣品[18-20]?？瞻讟悠窞闊o(wú)菌無(wú)抗無(wú)β-內(nèi)酰胺酶的純牛奶（250 m L，保質(zhì)期室溫6個(gè)月），水系為去離子純水。

1.3.3 測(cè)定用培養(yǎng)基平皿的制備

方法一：取菌懸液（1.4）1 m L加入到滅好菌的100 m L、溫度在46～50℃之間的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ中，充分混勻，菌懸液最后終濃度為1×108CFU/m L；每個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中分裝15 m L培養(yǎng)基，靜置；待凝固后，將培養(yǎng)皿平分成四區(qū)，每區(qū)中央放置滅好菌的牛津杯，待穩(wěn)定后加樣。

方法二：每個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中底層先加入10 m L滅好菌的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ，作為培養(yǎng)基基礎(chǔ)。待冷卻凝固后，上層再加入加入5 m L含有濃度為1×108CFU/m L的菌懸液的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ（配制方法參考方法一），靜置；待凝固后，將培養(yǎng)皿平分成四區(qū)，每區(qū)中央放置滅好菌的牛津杯，待穩(wěn)定后加樣[21]。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取8.0 g無(wú)水磷酸二氫鉀、2.0 g無(wú)水磷酸氫二鉀，溶解于水中，用鹽酸（0.1 m ol/L）調(diào)節(jié)pH至6.0，定容至1 L，于121℃高壓滅菌15 min，為磷酸鹽緩沖液。用配制好的磷酸鹽緩沖液將β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品、青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.1 U/m L、1 m g/m L、0.1 m g/m L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)《NY/T 3313-2018生乳中β-內(nèi)酰胺酶的測(cè)定（第一法杯碟法）》中“試樣測(cè)定”的規(guī)定，在1 m L水系、空白、添加β-內(nèi)酰胺酶模擬樣品中加入β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液、青霉素G標(biāo)準(zhǔn)溶液體系，添加方式如表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液體系的添加

將培養(yǎng)皿于37℃，培養(yǎng)22 h后，按照標(biāo)準(zhǔn)中“試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理”進(jìn)行判定。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定之前，應(yīng)先確定水系及空白試驗(yàn)結(jié)果成立。然后再根據(jù)模擬樣品中β-內(nèi)酰胺酶濃度的不同，在測(cè)量抑菌圈進(jìn)行判定[22-23]。

2.1 結(jié)果的判定

當(dāng)水系、空白試驗(yàn)結(jié)果滿足如下條件時(shí)，樣品結(jié)果應(yīng)按以下規(guī)則進(jìn)行判定：

（1）若B和D均產(chǎn)生抑菌圈，且C的抑菌圈小于D的抑菌圈，差異≥3mm時(shí)：A的抑菌圈小于B的抑菌圈，滿足抑菌圈差異≥3mm時(shí)，該結(jié)果判定為檢出β-內(nèi)酰胺酶；2次平行測(cè)定同時(shí)滿足A的抑菌圈與B的抑菌圈差異＜3mm時(shí)，該結(jié)果判定為未檢出β-內(nèi)酰胺酶。

（2）若A和B均不產(chǎn)生抑菌圈，應(yīng)將樣品稀釋后再重新進(jìn)行測(cè)定。

2.2 抑菌圈的測(cè)量

由表2、表3可知，方法一與方法二的水系都成立，空白樣品也都為β-內(nèi)酰胺酶未檢出，可見(jiàn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定體系成立。陽(yáng)性對(duì)照分別選用了添加β-內(nèi)酰胺酶時(shí)，最接近“A的抑菌圈小于B的抑菌圈，滿足抑菌圈差異≥3mm”這個(gè)條件的濃度，即方法一β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性添加濃度為0.00025 U/m L，方法二β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性添加濃度為0.0001 U/m L。但是可以看出方法一的抑菌圈邊緣比較模糊，在用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量時(shí)，不好測(cè)定。方法二的抑菌圈的邊緣就很清晰，測(cè)量方便，便于肉眼觀察。在相同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間的條件下，方法一的藤黃微球菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的情況比方法二也較稀疏。

表2 方法一水系與空白實(shí)驗(yàn)的判定

表3 方法二水系與空白實(shí)驗(yàn)的判定

2.3 檢出限的測(cè)定

在水系成立、空白樣品成立的前提下，同時(shí)進(jìn)行方法一和方法二的檢出限的比對(duì)，如表4所示。

表4 方法一與方法二的檢出限的比對(duì)

方法一的β-內(nèi)酰胺酶檢出限在0.0002～0.00025 U/m L之間，方法二的β-內(nèi)酰胺酶檢出限在0.00005～0.0001 U/m L之間，由此可見(jiàn)方法二的靈敏度明顯高于方法一的靈敏度。但是方法一的藤黃微球菌添加方式相比于方法二操作簡(jiǎn)單。

通過(guò)比對(duì)研究，兩種藤黃微球菌的添加方式，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢出限和實(shí)際觀察測(cè)量抑菌圈有影響。通過(guò)分析，方法一中藤黃微球菌在15 m L培養(yǎng)基里，處于培養(yǎng)基內(nèi)部，呈分散的狀態(tài)，要克服瓊脂的張力的作用；同時(shí)藤黃微球菌是好氧菌，其耗氧量也受到影響，造成藤黃微球菌在相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的不夠充分，在培養(yǎng)基中含量較少，是造成抑菌圈的邊緣模糊的主要原因。方法二中菌懸液5 m L的培養(yǎng)基覆蓋在10 m L的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，相比于方法一培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)含量減少了2/3，但下層的10 m L的培養(yǎng)基也會(huì)為上層菌懸液提供營(yíng)養(yǎng)，菌懸液只要克服5 m L培養(yǎng)基的張力，而且處于培養(yǎng)基上層，幾乎不影響藤黃微球菌微球菌耗氧量。所以在相同實(shí)驗(yàn)條件下，方法二的藤黃微球菌在培養(yǎng)基中能夠充分生長(zhǎng)，菌含量濃度較大，抑菌圈更加清晰。在相同的培養(yǎng)條件下對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的靈敏度更高，反應(yīng)時(shí)間更短，檢出限更準(zhǔn)確。

3 結(jié) 論

β-內(nèi)酰胺酶是明令禁止添加到生鮮乳中的違禁添加物，雖然杯碟法中藤黃微球菌這兩種添加方式對(duì)β-內(nèi)酰胺酶檢出限的區(qū)別很小，但是對(duì)生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)有深遠(yuǎn)意義。

因?yàn)榘凑辙r(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求，β-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間為18～22 h。如果在相同時(shí)間內(nèi)藤黃微球菌生長(zhǎng)的越充分，抑菌圈越清晰，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的靈敏度越高，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢出更加準(zhǔn)確。此外，對(duì)于各檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)在參加β-內(nèi)酰胺酶能力驗(yàn)證或該項(xiàng)目考核時(shí)，對(duì)于樣品制備和郵寄過(guò)程中產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶樣品衰減的問(wèn)題，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的正確性也具有一定影響[24]。同理，對(duì)于乳品企業(yè)采用快速試紙條初篩出β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性的樣品，要第一時(shí)間采用杯碟法進(jìn)行確認(rèn)，以免快速試紙條的假陽(yáng)性造成的錯(cuò)判。含有β-內(nèi)酰胺酶的生鮮乳樣品由于溫度的變化，存放的時(shí)間長(zhǎng)短，以及冷凍樣品反復(fù)凍融的影響，都會(huì)增加β-內(nèi)酰胺酶衰減的風(fēng)險(xiǎn)。所以，提高β-內(nèi)酰胺酶的檢出靈敏度，對(duì)乳制品安全也具有重要意義。