布里亞特頓金斯克區(qū)發(fā)酵乳制品中乳酸菌分離鑒定

黨娜，劉逸群，武岳，史迪，劉文俊，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室呼和浩特010018）

0 引 言

每個國家與民族都有獨具特色的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，俄羅斯布里亞特地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的品種豐富，味道鮮美，深受其它國家的喜愛[1-2]。傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的制作早已經(jīng)歷了幾千年的傳承，再加上工藝條件、環(huán)境、地理因素等的不同，使其成為了蘊涵復雜乳酸菌資源的優(yōu)良載體[3-4]。乳酸菌等多種微生物對乳制品的口味、質地、營養(yǎng)特性和儲藏特性具有很大程度的影響[5-7]。此外，乳酸菌可以改善胃腸功能、增強免疫力、緩解過敏、降血脂等[8-9]。本文對布里亞特共和國頓金斯克區(qū)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的組成與種類進行研究，不僅可以為傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌多樣性研究提供原始數(shù)據(jù)，而且能夠豐富我國的乳酸菌菌庫，同時為優(yōu)良乳酸菌篩選與工業(yè)應用提供菌株資源。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及采集

本研究所用8份樣品于2016年9月采集,采集樣品信息如表1所示。用無菌勺將樣品放入無菌螺口采樣管（0.5 g，M淀粉∶MCaCO3=50∶1），寫好樣品號立即放置在低溫保存，盡快將樣品運回實驗室[10]。

表1 俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區(qū)采集樣品信息

1.1.2 試劑與儀器

CM1175，M.R.S.BRO TH和 CM1163，M.R.S.AGAR，英國OXO ID公司。提取基因組DN A、16S rRNA基因的PCR擴增、電泳檢測用的緩沖液和試劑參考文獻[11]。儀器設備及廠家信息參考文獻[12]。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌計數(shù)及分離純化

10倍稀釋法進行梯度稀釋，乳酸菌計數(shù)和分離分別采用傾注法、涂布法[13]。計數(shù)板和涂布板培養(yǎng)條件：37℃，厭氧，48 h。計數(shù)板進行計數(shù)；從涂布板上挑選出菌落形態(tài)明顯不同的單菌落，并記錄其菌落形態(tài)，如顏色、形狀、大小等，劃線純化培養(yǎng)物[14]。經(jīng)革蘭氏染色，過氧化氫酶觸試驗，將疑似乳酸菌的純培養(yǎng)物進行保藏，以待后續(xù)試驗[15]。

1.2.2 基因組DNA提取及16S rRNA基因的PCR擴增

提取菌株基因組DNA試劑盒：TIAN am pBacteria DNA Kit（北京天根生化科技有限公司）。

PCR擴增體系：DN A tem p late（100 ng/μL）2μL，10×Bu ffer（Mg2+）5μL，d N TPs（2.5 mm o l/L）4μL，DNA r-Taq enzym e（5 U/μL）0.5μL，F(xiàn)A-27F（10mm ol/L）1.5μL，RA-1495R（10 mm o l/L）1.5μL，三蒸水35.5μL[16]。前后引物為通用引物，參考文獻[17]。

PCR擴增條件：首先94℃預變性5 min；然后94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min（30個循環(huán)）；最后72℃末端延伸10min[18]。

1.2.3 16S rRNA序列測定、同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

PCR產(chǎn)物雙向測序（上海桑尼生物技術有限公司），首先用SepMan（DNAStar 6.1）軟件整理、拼接、校準序列。然后把同源性大于99%作為種的鑒定閾值，用BLAST軟件（http://blast.ncbi.n lm.nih.gov/Blast.cgi）在數(shù)據(jù)庫（GenBank/EMBL/DDBJ）進行同源性比對[19]。最后用Mega 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹[20-21]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌計數(shù)及分離結果

由表2可知，奶酪樣品中乳酸菌數(shù)（對數(shù)值）為（7.07±0.02）m L-1及（8.01±0.08）m L-1，結果與Bao Q iuhua對四川曲拉及甘肅牦牛乳曲拉（曲拉與奶酪生產(chǎn)工藝相似）計數(shù)結果相近，平均乳酸菌數(shù)為（7.18±1.49）m L-1[14]及（7.9±0.89）m L-1[22]。乳清樣品中乳酸菌數(shù)在7.75～7.89 m L-1之間。酸牛奶及發(fā)酵乳飲料樣品活菌數(shù)在6.88～8.90 m L-1之間，滿足新酸奶國家標準。所有樣品的活菌數(shù)都處于106m L-1以上，滿足國家衛(wèi)生標準，也達到了酸奶國家標準。

表2 俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區(qū)樣品中乳酸菌的計數(shù)結果（對數(shù)值）

根據(jù)菌落的形態(tài)特征、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，初步將50株菌定為乳酸菌。在涂布板上菌落形狀呈圓形、大小中等，中心凸起，顏色為白色或乳白色，邊緣整齊，表面有的光滑，有的粗糙。

2.2 菌株DNA提取及16S rRNA基因擴增結果

所有菌株DN A的OD 260/280值均在1.8～2.0之間，為純的DNA。將提取的DNA濃度稀釋至100 ng/μL進行16S rRNA基因擴增。擴增產(chǎn)物用1.0%AGE（瓊脂糖凝膠電泳）檢測之后，能看到在大約1 500 bp位置處有條清晰明亮的條帶且無彌散現(xiàn)象，如圖1。

圖1 部分分離株16S rDNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建及乳酸菌鑒定結果

由圖2可知，菌株BL4-11與模式株Pediococcus acidilactici DSMZ 20284T聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Pediococcus acidilactici。菌株BL1-6與模式株Pediococcus pentosaceus ATCC 33316T聚為一類且同源性高達100%，將其鑒定為Pediococcus pentosaceus。菌株BL12-8與模式株Lactobacillus plantarum ATCC 14917T聚為一類且同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus plantarum。菌株BL16-2與模式株Lactobacillus paracasei ATCC 25302T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Lactobacillus paracasei。菌株BL23-9-1與模式株Leuconostocmesenteroides JCM6124T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Leuconostoc mesenteroides。菌株BL13-10與模式株Streptococcus thermophilus ATCC 19258T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Streptococcus thermophilus。菌株BL15-2與模式株Lactococcus lactis ATCC 19435T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Lactococcus lactis。菌株BL15-12與模式株Enterococcus italicus DSM15952T聚為一類且同源性為100%，故將其鑒定為Enterococcus italicus。菌株BL13-1與模式株Enterococcus faecalis NBRC 100480T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Enterococcus faecalis。菌株BL5-1-1與模式株Enterococcus durans NBRC 100479T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Enterococcus durans。菌株BL5-2與模式株Enterococcus faecium NBRC 100485T聚為一類且同源性為100%，因此將其鑒定為Enterococcus faecium。

圖2 布里亞特共和國頓金斯克區(qū)部分菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 優(yōu)勢菌種分析

布里亞特共和國頓金斯克區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的分離結果如表3所示。除了奶酪1（GAL1）以外，所有的樣品均分離到Lactococcus lactis，占總分離株的40%，為布里亞特共和國頓金斯克區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的優(yōu)勢菌種。其次乳清4和乳清12（TUN 4和TUN 12）中均分離到Lactobacillus plantarum，共7株，占總分離株的14%，為布里亞特共和國頓金斯克區(qū)乳清的優(yōu)勢菌。奶酪1（GAL1）、乳清4（TUN 4）、發(fā)酵乳飲料13（TOR 13）分離的菌種類別最多，都有5種。由于本次采樣酸牛奶23（SAG 23）采樣量較少且未進行全面采樣，因此其分離的菌種類別和數(shù)量會比較少，在今后的研究中需進行改善。綜上所述，布里亞特共和國頓金斯克區(qū)發(fā)酵乳制品的優(yōu)勢種為Lactococcus lactis，占總分離株的40%。

表3 布里亞特共和國頓金斯克區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的分離結果

3 討 論

本文對俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區(qū)的傳統(tǒng)奶酪樣品進行乳酸菌分離鑒定，分離株分別歸屬于Enterococcus、Lactobacillus、Leuconostoc等菌屬，這與楊彥榮的結果符合，楊彥榮等[16]研究的卡爾梅克傳統(tǒng)奶酪中乳酸菌分別歸屬于Enterococcus、Lactobacillus和Leuconostoc3個菌屬。不同的環(huán)境條件下，傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪的菌群組成是不同的：Aydemir等[23]研究的奶酪優(yōu)勢菌為Lactobacillus casei和 Lactobacillus plantarum；Do lci等[24]研究的Castelm agno PDO奶酪優(yōu)勢菌為Lactobacillus plantarum和Lactobacillus paracasei；Coppo la R等[25]研究的Caciocavallo奶酪優(yōu)勢菌為Lactobacillus pentosus和Lactobacillus coryneformis subsp.Torquens；Coppo la S等[26]研究的Mozzarella奶酪優(yōu)勢菌為Streptococcus thermophilus；PIRAINO P等[27]研究的奶酪優(yōu)勢菌還有Lactobacillus fermentum。本研究從酸牛乳中分離出的乳酸菌被鑒定為 3個屬Lactococcus、Enterococcus和 Leuconostoc，其中 Lactococcus lactis為該地區(qū)酸牛乳中的優(yōu)勢種。卿蔓君[28]研究內(nèi)蒙古東部地區(qū)發(fā)酵酸牛乳中發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactis subsp.lactis、和 Leuconostocmesenteroides subsp.Mesenteroides為其中的優(yōu)勢菌株。雷霞[29]研究內(nèi)蒙古伊敏河岸、海拉爾河岸牧區(qū)發(fā)酵乳發(fā)現(xiàn)乳酸菌歸屬于4個屬，Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus和 Leuconostoc，其 中Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis subsp.lactis為該地區(qū)傳統(tǒng)乳中的優(yōu)勢菌群。本研究乳清中分離到的乳酸菌被鑒定為4個屬（Lactococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Pediococcus）5個種，其中Lactobacillus plantarum為該地區(qū)乳清中的優(yōu)勢種，其次是Lactococcus lactis。本研究發(fā)酵乳飲料中分離到的乳酸菌被鑒定為5個屬（Lactococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Steptococcus）6個種，其中Lactococcus lactis為該地區(qū)發(fā)酵乳飲料中的優(yōu)勢種，這與呼斯楞的結果相符合，呼斯楞[30]運用與本文一樣的研究方法得出內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)液體發(fā)酵乳制品中的優(yōu)勢菌種為Lactococcus lactis。海拔、氣候、溫度、大氣壓、陽光等各種環(huán)境因素的差異以及乳制品的制作工藝條件和制作環(huán)境等因素也影響成品的菌群結構，在所有因素的綜合作用下，不同地區(qū)的不同乳制品都具有了獨特性[7,31]。

目前在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中涉及的乳酸菌屬有Lactococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Leuconostoc、Streptococcus、Bifidobacterium[32]。布里亞特共和國頓金斯克區(qū)8份發(fā)酵乳制品中分離到的50株乳酸菌鑒定為6個菌屬，包括上述的前5個乳酸菌屬（沒有分離到Bifidobacterium），還有Enterococcus。Enterococcus一直存在于眾多的發(fā)酵乳制品中，在乳制品中經(jīng)常會分離到Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium，Enterococcus durans也經(jīng)常在奶制品中分離出來，但在發(fā)酵過程中的應用仍存在爭議。有研究表明，Lactococcus和Streptococcus這兩個菌屬的某些菌株有助于乳制品的酸化、凝乳以及酪蛋白水解過程[33]。Streptococcus thermophilus可以對乳酸發(fā)酵的生態(tài)環(huán)境進行改善，而且可以降低膽固醇水平[34]。Lactococcus lactis具有快速酸化以及凝乳的能力，能夠通過促進乳酸的形成進而增強乳制品的風味及質地[7,35]。Leuconostoc與Enterococcus能夠對乳制品的味道和質地產(chǎn)生影響[36]。Lactobacillus中瑞士乳桿菌憑借其蛋白水解能力可以減少某些乳制品，如奶酪等的苦味[37]。

4 結 論

本文從俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區(qū)采集的8份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品中乳酸菌數(shù)（對數(shù)值）為（6.88±0.19）m L-1至（8.90±0.30）m L-1，乳酸菌活菌數(shù)都比較高。采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法分離得到50株菌株，然后通過16S rDNA序列分析方法將其鑒定為Lactococcus，Lactobacillus，Enterococcus，Pediococcus，Leuconostoc，Streptococcus，共6個屬，11個種。其中，Lactococcus lactis分離到20株，占總菌株的40%，為布里亞特共和國頓金斯克區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的優(yōu)勢菌種。