2個生態(tài)型三葉青塊根主要藥用成分動態(tài)檢測與比較

王盼，康華靖，胡軼娟，徐尉城，周鈺鴻，陳子林*

(1.磐安縣中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展促進中心，浙江 磐安 322300；2.浙江省大盤山國家級自然保護區(qū)管理局，浙江 磐安 322300；3.溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 溫州 325006；4.浙江省中醫(yī)藥研究院 藥用資源研究中心，浙江 杭州 310007)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，又名三葉崖爬藤、金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠，為葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬(Tetrastigma)多年生蔓生藤本。全草均可入藥，以地下塊根和果實的藥用效果最好。三葉青是我國特有珍稀中藥植物?！侗静菥V目》記載“三葉崖爬藤，性味苦、辛、涼，清熱解毒、活血祛風”?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，三葉青對于高熱、肺炎、肝炎、胃炎等諸多嚴重感染性疾病均有顯著療效[1]。尤其是其體內(nèi)所含的三葉青黃酮、β-谷甾醇、多糖等能很好地抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡[2-4]，且無毒副作用[5]。目前三葉青提取物已在臨床上廣泛用于抗癌、抗艾滋病毒，治療血液病、心腦血管疾病、肝炎、病毒性腦膜炎等[6]，是目前公認的“植物抗生素”。

三葉青主要分布于我國浙江、福建、廣西、云南等地，于2018年2月入選新“浙八味”[7]。三葉青喜陰涼濕潤氣候，尤其是對光照生長環(huán)境要求苛刻，自然條件下生長速度緩慢，加上無節(jié)制的人為采挖，在自然條件下已瀕臨滅絕[1]。因此，三葉青被列入浙江省首批農(nóng)作物種質(zhì)資源保護名錄品種。目前，三葉青需求呈大幅增長趨勢，然而，三葉青種植周期相對較長，栽培技術(shù)方面的基礎研究較少。近年來各地均開展人工栽培馴化，不同種源的三葉青外觀性狀、藥理活性、產(chǎn)量及價格差異懸殊。

本文通過對2個生態(tài)型三葉青塊根的含水量、醇溶性浸出物、槲皮素、山奈酚和總黃酮含量等主要藥用成分進行動態(tài)檢測，以期為三葉青高產(chǎn)栽培，優(yōu)良種質(zhì)篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

三葉青塊根取自金華金葫蘆珍稀藥材開發(fā)有限公司種植基地2個生態(tài)型三葉青，其中近根部莖的表皮呈紫褐色(簡稱褐紫藤三葉青，標注為A)，另一生態(tài)型的三葉青藤的表面顏色均為青色(簡稱青色藤三葉青，標注為B)。

1.2 測定方法

1.2.1 水分含量測定

塊根挖回后放置于實驗室搪瓷盤中，陰干2周后，取供試品2.0 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，打開瓶蓋在100～105 ℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱定重量，再在上述溫度干燥1 h，冷卻，稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過5 mg為止。

1.2.2 醇溶性浸出物含量測定

三葉青藥材粉碎，過二號篩，混合均勻，取樣品約2.0 g，稱定重量，置250 mL的燒瓶中，精密加70%乙醇50 mL，塞緊，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過。精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。

1.2.3 槲皮素、山奈酚含量測定

取干燥的三葉青藥材，經(jīng)粉碎后過4號篩，取2.5 g樣品，精密稱定，用25 mL甲醇(內(nèi)含2%鹽酸)加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并過濾的甲醇定容至50 mL容量瓶中，進樣分析前樣品溶液用0.45 μm濾膜過濾，即得供試樣品溶液。精密吸取以上供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按標準曲線計算供試品溶液中槲皮素、山奈酚含量。其中色譜條件為色譜柱YMCODS柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫30 ℃，以甲醇-0.2%磷酸(55∶45)為流動相；流速1.0 mL·min-1；檢測波長為360 nm，槲皮素、山奈酚的理論塔板數(shù)均大于10 000，分離度均大于1.5。

1.2.4 總黃酮含量測定

精密稱取干燥至恒重蘆丁對照品10.02 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，備用。取三葉青樣本粉碎后過50目篩，取0.5 g置圓底燒瓶中，精密稱定，加甲醇50 mL，加熱回流提取2次，每次1 h，取出放冷，濾過，濾液揮干，殘渣用適量甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻備用。精密吸取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，精密加入5% 亞硝酸鈉溶液l.0 mL，搖勻，放置6 min，再精密加入10% 硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，精密加入氫氧化鈉試液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，于500 nm 處測定吸收度。以吸收度值A為縱坐標，蘆丁對照品的濃度(mg·L-1)為橫坐標，繪制標準曲線，構(gòu)建黃酮濃度與吸光度關(guān)系的回歸方程。

精密吸取供試品溶液6.0 mL，置25 mL容量瓶中，其余操作同“標準曲線的制備”，于500 nm處測定吸收度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

槲皮素、山奈酚對照品，蘆丁對照品(中國藥品生物制檢定所)，甲醇、異丙醇均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。所有檢測均由浙江中醫(yī)藥大學實驗室測試完成。所有測量均3次重復求其平均值。Excel 10.0完成作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 含水量

通過不同月份晾干后三葉青塊根水分含量動態(tài)測量(圖1)表明，1—7月三葉青塊根含水量整體波動不大，且相對較高(含水量大于11.0%)；8—12月，三葉青塊根含水量整體呈下降趨勢，整體含水量低于11.0%。從整年數(shù)據(jù)來看，2個樣品在5月和9月出現(xiàn)波峰，推測與期間植物塊根的快速膨大生長有關(guān)。

圖1 不同月份三葉青陰干后含水量

2.2 浸出物含量

由圖2可知，三葉青的浸出物含量全年相對穩(wěn)定，整體在8%～10%波動。三葉青A樣品的浸出物含量高于B樣品。樣品A全年平均值為9.14%，樣品B為8.52%。經(jīng)檢驗，兩者無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同月份三葉青浸出物含量

2.3 槲皮素和山奈酚含量

通過對2個生態(tài)型三葉青塊根槲皮素和山奈酚含量的測量發(fā)現(xiàn)，其含量波動較大。樣品B的槲皮素含量在上半年(1—6月)整體高于樣品A，而樣品B的山奈酚含量上半年則整體低于樣品A(圖3，圖4)。另外，從圖3可以看出，2個樣品的槲皮素含量在冬季(12—3月)較高。從圖4可以看出，A樣品山奈酚含量整體較高，尤其在1—5月，A樣品山奈酚含量顯著高于B樣品；在下半年B樣品山奈酚含量整體呈上升趨勢，而A樣品山奈酚含量則呈W形狀波動。

圖3 不同月份三葉青槲皮素含量

圖4 不同月份三葉青山奈酚含量

2.4 總黃酮含量

從圖5可以看出，A樣品的總黃酮含量在相同時間點整體高于B樣品。A樣品的三葉青塊根總黃酮量在秋冬季相對較高，不同月份波動較大；而B樣品總黃酮含量在春夏季比較穩(wěn)定，且含量相對較低，在秋冬季上升比較明顯。

圖5 不同月份三葉青總黃酮含量

3 小結(jié)

浙江主產(chǎn)的三葉青有褐紫藤三葉青和青色藤三葉青2個生態(tài)型品種。民間及育種者往往認為褐紫藤生態(tài)型品質(zhì)更佳[8]，然而兩者之間的詳細比較鮮見報道。為此，本文選用褐紫藤三葉青(A樣品)和青色藤三葉青(B樣品)進行成分動態(tài)檢測。結(jié)果表明，2個生態(tài)型的含水量和浸出物含量變化基本一致，而槲皮素、山奈酚和總黃酮含量差異較大。這表明2個生態(tài)型三葉青塊根在藥用成分上存在差異。

三葉青作為民間抗腫瘤用藥，尚無法定標準對其質(zhì)量進行控制。迄今相關(guān)研究僅針對已采收樣品進行分析，通過測定單一組分或者單一類成分的含量作為評價和控制其質(zhì)量的方法，具有片面性和不確定性[9]。通過對三葉青醇溶性浸出物的測定可知，A樣品醇溶性浸出物全年平均含量為9.14%，B樣品醇溶性浸出物全年平均含量為8.52%。由此可見，A樣品整體達到相關(guān)規(guī)定，而B樣品略低于規(guī)定標準。通過測定，從槲皮素含量來看，B樣品在3月達到峰值，為0.071 mg·g-1，B樣品在12月最高，達到0.084 mg·g-1；從山奈酚含量來看，A樣品在春冬季較高，而B樣品在秋冬季相對較高。2種含量變化趨勢不一致。本試驗結(jié)果表明，三葉青塊根中的總黃酮含量全年波動雖然較大，但樣品A的含量整體高于樣品B，尤其是在冬季，其差異較為顯著。從醇溶性浸出物、槲皮素、山奈酚和總黃酮含量4個指標整體來看，A樣品略優(yōu)于B樣品。因此，認為在后續(xù)的三葉青質(zhì)量標準控制研究中可將總黃酮含量測定作為質(zhì)量控制的主要指標。這與吉慶勇等[10]的觀點相一致。

三葉青喜涼爽氣候，耐旱，忌積水，在25 ℃左右生長健壯，冬季氣溫降至10 ℃時生長停滯。12月A樣品水含量只有9.75%，B樣品水含量只有8.92%，都不足10%，此時三葉青植物體內(nèi)的水分含量全年最低，且此時三葉青塊根有效成分含量較高，品質(zhì)較好。因此，建議三葉青在冬至與驚蟄期間進行采挖。