馬鈴薯健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及其對(duì)碳源利用特征

趙衛(wèi)松，郭慶港，蘇振賀，王培培，董麗紅，胡卿，鹿秀云，張曉云，李社增，馬平

馬鈴薯健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及其對(duì)碳源利用特征

趙衛(wèi)松，郭慶港，蘇振賀，王培培，董麗紅，胡卿，鹿秀云，張曉云，李社增，馬平

河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000

【】通過研究馬鈴薯健康植株與黃萎病株的根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性的差異，明確土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與黃萎病發(fā)生之間的關(guān)系，為最終從微生物生態(tài)學(xué)的角度解釋馬鈴薯黃萎病的發(fā)生原因及其生態(tài)防控提供理論依據(jù)。以河北省壩上地區(qū)馬鈴薯健株與黃萎病株的根際土壤為研究對(duì)象，分別利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）和高通量測序（Illumina Miseq）技術(shù)檢測根際土壤中大麗輪枝菌（）ITS基因拷貝數(shù)量并分析真菌群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合冗余分析（RDA）明確真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性。同時(shí)利用Biolog-ECO平板法比較健株與黃萎病株根際土壤微生物對(duì)碳源的利用能力。馬鈴薯黃萎病的發(fā)生與土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數(shù)量存在相關(guān)性，在病株根際土壤中病原菌數(shù)量高，而在健株根際土壤中未檢測到病原菌。高通量測序分析表明，病株根際土壤真菌多樣性指數(shù)低于健康植株，但多樣性差異不顯著。在群落組成的門水平上，與健株根際土壤相比，病株根際土壤中的子囊菌門（Ascomycota）和絲孢菌門（Mortierellomycota）相對(duì)豐度上升幅度分別為20.68%和16.16%，而擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的相對(duì)豐度下降51.43%。在屬水平上，病株根際土壤中輪枝菌屬（）、青霉屬（）、維希尼克氏酵母屬（）、紅酵母屬（）和芽枝霉屬（）的相對(duì)豐度呈上升趨勢，增加倍數(shù)分別為71.96、3.62、6.11、15.38和6.24倍，而小不整球殼屬（）、、葡萄穗霉屬（）、赤霉屬（）、曲霉屬（）菌群的相對(duì)豐度下降幅度分別為45.10%、61.41%、96.87%、45.85%和44.39%。真菌群落組成與土壤養(yǎng)分的冗余分析（RDA）表明，健株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度（如小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬）與硝態(tài)氮、有機(jī)質(zhì)和pH呈正相關(guān)，而黃萎病株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度（如輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬）與無機(jī)磷和速效磷呈正相關(guān)。不同根際土壤的AWCD值表明，病株根際土壤微生物對(duì)碳源的利用能力高于健株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與健株相比，病株土壤微生物對(duì)羧酸類碳源的利用能力顯著提高，而對(duì)氨基酸類、胺類、碳水化合物類、聚合物類和雙親化合物類碳源利用能力差異不顯著。病株的根際土壤真菌多樣性降低和群落結(jié)構(gòu)改變是馬鈴薯黃萎病發(fā)生的重要特征，其中輪枝菌屬菌群的相對(duì)豐度顯著提高是最主要特征，并且真菌群落結(jié)構(gòu)受土壤養(yǎng)分影響。同時(shí)，病株根際土壤微生物對(duì)羧酸類碳源利用能力顯著提高。

馬鈴薯黃萎??；大麗輪枝菌；根際土壤；真菌群落結(jié)構(gòu)；高通量測序；土壤養(yǎng)分；Biolog技術(shù)

0 引言

【研究意義】馬鈴薯（）是我國第4大糧食作物[1]。馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是農(nóng)民增收的主要來源之一，對(duì)保障我國糧食安全具有重要意義。目前，我國是馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量最大的國家，分別占世界馬鈴薯總面積和總產(chǎn)量的25%和22%[2]。近年來，由于馬鈴薯連作導(dǎo)致土傳病害有逐年加重的趨勢，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。馬鈴薯黃萎病又稱早死病或早熟病，是典型的土傳兼種傳維管束病害，輕者減產(chǎn)20%—30%，重者損失達(dá)50%以上，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。在我國新疆、河北、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古、寧夏、黑龍江、吉林、貴州等地已有關(guān)于馬鈴薯黃萎病發(fā)生的報(bào)道[5-9]。因此，針對(duì)馬鈴薯黃萎病的防治工作至關(guān)重要。研究馬鈴薯健康植株和黃萎病株根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)，有助于揭示黃萎病發(fā)生與真菌群落兩者之間的互作關(guān)系，可為進(jìn)一步篩選對(duì)馬鈴薯黃萎病有拮抗作用的有益微生物和病害防治提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)馬鈴薯黃萎病的研究主要集中在抗性品種篩選、病原菌種類鑒定、致病力測定、病害防治技術(shù)等方面[5-10]。微生物群落結(jié)構(gòu)與植物健康狀況之間的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)，而關(guān)于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與馬鈴薯黃萎病發(fā)生之間的關(guān)系尚不清晰。研究表明，土傳病害的發(fā)生與土壤微生物區(qū)系的改變存在一定的相關(guān)性[11-13]。Gorissen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯青枯?。ú≡鷅iovar 2）的病田土壤細(xì)菌多樣性低于健康土壤，且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；祈建軍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，地黃根腐病（病原菌）發(fā)生與其根際土壤微生物呼吸、代謝熵密切相關(guān)。近年來，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，通過高通量測序技術(shù)能夠從土壤微生物群落水平分析土傳病害發(fā)生的可能主導(dǎo)因子，可以更好地理解馬鈴薯健株和病株土樣之間真菌的組成及差異，從而為馬鈴薯黃萎病防治提供更好的思路和解決方法，而另一方面Biolog技術(shù)則是從代謝功能角度研究土壤微生物群落功能多樣性的變化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管已有學(xué)者研究了馬鈴薯連作對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[15]，但黃萎病菌（大麗輪枝菌）侵染馬鈴薯對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響及其對(duì)碳源利用特征的變化情況尚缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤為研究對(duì)象，采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)研究馬鈴薯植株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，分析真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系，結(jié)合Biolog方法對(duì)不同根際土壤微生物對(duì)碳源的利用能力進(jìn)行比較，以期揭示黃萎病發(fā)生與土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的互作關(guān)系，為生防菌篩選和利用微生態(tài)調(diào)控手段防控馬鈴薯黃萎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域概況

壩上地區(qū)包括河北省圍場滿族蒙古族自治縣部分地區(qū)，地處東經(jīng)116°32′—118°14′，北緯41°35′—42°40′，是全國重點(diǎn)馬鈴薯種薯繁育和商品薯基地縣，全縣馬鈴薯年平均種植面積約2.93萬公頃。年平均氣溫在-0.5—6.0℃，平均降水量為300—560 mm，時(shí)空分布上差異較大，70%的降水集中在6—8月，無霜期區(qū)域分布差異較大。馬鈴薯黃萎病主要由土壤和種薯傳播，寄主范圍廣，流行性強(qiáng)，近年來有發(fā)生的報(bào)道[10]。

1.2 材料

供試馬鈴薯品種荷蘭15（感黃萎病品種），由圍場滿族蒙古族自治縣志偉馬鈴薯種植專業(yè)合作社提供，用于田間試驗(yàn)。

1.3 根際土壤樣品的采集

試驗(yàn)于2019年在河北省圍場滿族蒙古族自治縣牌樓鄉(xiāng)紅砬子村（東經(jīng)117°15′，北緯41°56′）進(jìn)行。馬鈴薯根際土壤取自連續(xù)種植馬鈴薯5年的地塊，土壤類型為沙壤土。具體采集方法如下：在馬鈴薯黃萎病發(fā)生時(shí)期（8月上旬），參考趙衛(wèi)松等[8]馬鈴薯黃萎病的病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，選擇馬鈴薯健康植株和黃萎病植株（發(fā)病等級(jí)為3級(jí)以上）作為研究對(duì)象，用取樣鏟分別將馬鈴薯健株和病株整個(gè)根系完整挖出，輕敲根系，與根系結(jié)合較松的土壤棄去，將與根系緊密結(jié)合的土壤用毛刷清理。健株與病株分別取4個(gè)點(diǎn)，每取樣點(diǎn)即為1份，取樣點(diǎn)間隔30 m，每取樣點(diǎn)選擇5株馬鈴薯采集根際土壤混合而成。土壤樣品裝入低溫保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm篩后一部分保存于4℃冰箱用于Biolog測定，一部分保存于-80℃冰箱，用于真菌群落結(jié)構(gòu)高通量測序分析。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的高通量測序 采用FastDNATMSPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）試劑盒提取土壤基因組DNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）檢測DNA的純度和濃度，DNA于-20℃保存?zhèn)溆?。以樣品DNA為模板，采用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì)其進(jìn)行目標(biāo)片段的ITS可變區(qū)擴(kuò)增[16]。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，引物（5 μmol·L-1）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板（20 ng·μL-1）1 μL，最后用滅菌的ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對(duì)其目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。純化后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina Miseq PE 300平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.4.2 土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數(shù)量的測定 按照1.3方法采集馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤，參考趙衛(wèi)松等[17]方法分別測定土壤中大麗輪枝菌ITS基因的拷貝數(shù)量。具體方法如下：以大麗輪枝菌基因組DNA為模板，利用大麗輪枝菌特異性引物DB19（CGGTGACATAATACTGAGAG）/DB20（GACGATGCGGATTGAACGAA）擴(kuò)增ITS部分序列。將PCR產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接、轉(zhuǎn)化于DH5感受態(tài)細(xì)胞中，提取重組質(zhì)粒，并10倍梯度稀釋后，將其作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同土壤DNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，得到不同樣本的循環(huán)閾值，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算土壤中大麗輪枝菌的拷貝數(shù)。

1.4.3 土壤養(yǎng)分的測定 參考Wang等[18]方法分別對(duì)馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤的酸堿度（pH）、硝態(tài)氮（NO3--N）、速效磷（AP）、無機(jī)磷（IP）和有機(jī)質(zhì)（OM）含量進(jìn)行測定。

1.4.4 健株與黃萎病株根際土壤的碳源利用特征比較 采用Biolog-ECO技術(shù)分析微生物群落對(duì)31種碳源（分為6大類，氨基酸類、碳水化合物類、胺類、羧酸類、聚合物類以及雙親化合物類）的代謝特征，即功能多樣性。ECO板接種液的制備：將土壤樣品在25℃條件下活化24 h，取3 g根際土加入含有27 mL滅菌的NaCl溶液（0.85 mol·L-1）的錐形瓶中180 r/min振蕩45 min。取3 mL上清液加入到27 mL NaCl溶液，混勻后再取3 mL上清液加入到27 mL NaCl溶液，最終稀釋比例為1﹕1 000，并將制備的接種液轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液槽中。利用8孔道排槍向ECO板的各孔中加入150 μL的稀釋液，每個(gè)土樣的稀釋液按方法要求設(shè)置3組平行。將接種好的微孔板放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 d使用ELxS08-Biolog微孔板讀數(shù)儀（Bio-Tek Instruments Inc，USA）進(jìn)行測定，測定波長分別為590 nm（顏色+濁度）和750 nm（濁度）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

微生物代謝活性用590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值表示，其中數(shù)值＜0.06時(shí)按0處理?？椎钠骄伾兓剩╝verage well color development，AWCD）計(jì)算方法如下[19]：AWCD = Σ（C-R）/n。式中，C為每個(gè)碳源孔的兩波段光密度差值；R為對(duì)照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)（n=31）。微生物對(duì)碳源的相對(duì)利用率，以健株和黃萎病株根際土壤處理的6類碳源AWCD值中最大的值為100%，其余以不同處理的各類碳源AWCD值與最大值的比值即為相對(duì)利用率。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理，Origin 8.6進(jìn)行作圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。采用Canoco 4.5軟件對(duì)健株和黃萎病株根際土壤真菌群落組成進(jìn)行主成分分析（PCA）及其與土壤養(yǎng)分的冗余分析（RDA），并利用CanoDraw軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 健株和黃萎病株根際土壤養(yǎng)分變化

馬鈴薯健株和黃萎病株根際土壤養(yǎng)分之間存在不同程度的差異。與健株相比，除了土壤pH不存在顯著差異外，黃萎病株根際土壤中的速效磷和無機(jī)磷含量顯著升高，而硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量顯著降低（表1）。

表1 健株與黃萎病株根際土壤養(yǎng)分變化

數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different lowercases after the data indicate significant difference (＜0.05). The same as below

2.2 健株和黃萎病株根際土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量測定

分別對(duì)采集的健株和黃萎病株根際土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量進(jìn)行測定，將每克土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數(shù)量轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，結(jié)果表明，黃萎病株根際土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數(shù)量為8.86，而健株根際土壤中未檢測到目標(biāo)病原菌。

2.3 土壤真菌多樣性分析

獲得的健株根際土壤樣本有效序列數(shù)目為67 602條，黃萎病株根際土壤樣本有效序列條目為62 390條。與健株根際土壤相比，黃萎病株根際土壤真菌多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出下降趨勢，但差異不顯著（表2）。

2.4 根際土壤真菌群落的特異性分析

通過對(duì)健株與黃萎病株根際土壤樣品中真菌群落Venn圖的比較分析，可以清晰地展現(xiàn)出根際土壤真菌群落OTU數(shù)目組成、特異性、重疊或相似性。在OTU分類水平上的特異性分析發(fā)現(xiàn)，共有真菌OTU數(shù)量為269個(gè)，其中健株根際土壤特有109個(gè)OTU，黃萎病株根際土壤特有81個(gè)OTU（圖1-A）。在屬分類水平上的特異性分析發(fā)現(xiàn)，共有真菌的屬為126個(gè)，健株根際土壤特有35個(gè)屬，黃萎病株根際土壤特有18個(gè)屬（圖1-B）。

A：OTU水平at OTU level；B：屬水平at genus level

2.5 根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

由圖2可知，健株與黃萎病株根際土壤真菌在OTU水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的85.24%和9.49%，2個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)到94.73%，說明其能夠表征真菌群落組成的特征。同時(shí)，相同處理的土壤樣品在主坐標(biāo)中位于不同的象限，表明相同處理植株間存在區(qū)別，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)健株與黃萎病株根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（=1.0000，=0.034）。

2.6 根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.6.1 門水平根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化 將豐度＜1%的歸為其他，門水平下健株與黃萎病株根際土壤真菌群落組成的研究結(jié)果表明（圖3），獲得的優(yōu)勢菌群包括子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和絲孢菌門（Mortierellomycota），其平均相對(duì)豐度分別介于68.43%—82.58%、13.75%—28.30%和2.83%—3.28%。與健株根際土壤相比，黃萎病株的子囊菌門和絲孢菌門的相對(duì)豐度上升，上升幅度分別為20.68%和16.16%；而擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度下降，下降幅度為51.43%。

圖2 健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析

2.6.2 屬水平根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化 將處理中至少1組相對(duì)豐度＞1%進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，豐度＜1%、未能鑒定或未培養(yǎng)的菌群歸為其他，屬水平下健株與黃萎病株根際土壤真菌群落組成的研究結(jié)果表明（圖4），獲得的優(yōu)勢菌群為小不整球殼屬（）、、輪枝菌屬（）、鐮孢菌屬（）、鏈格孢屬（）、刺盤孢屬（）、被孢霉屬（）、葡萄穗霉屬（）、腐質(zhì)霉屬（）、赤霉屬（）、曲霉屬（）、青霉屬（）、維希尼克氏酵母屬（）、紅酵母屬（）和芽枝霉屬（），其平均相對(duì)豐度分別介于15.40%—28.05%、10.59%—27.46%、0.47%—37.42%、10.49%—10.75%、2.37%—6.10%、2.24%—3.89%、2.83%—3.28%、0.14%—4.45%、1.14%—1.61%、0.86%—1.59%、0.71%—1.27%、0.30%—1.38%、0.19%—1.37%、0.07%—1.12%和0.14%—1.00%。與健株根際土壤相比，黃萎病株根際土壤中輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬的相對(duì)豐度呈上升趨勢，增加倍數(shù)分別為71.96、1.57、0.74、0.16、0.42、3.62、6.11、15.38和6.24倍；而小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬菌群的相對(duì)豐度呈下降趨勢，下降幅度分別為45.10%、61.41%、96.87%、45.85%和44.39%。

表2 健株和黃萎病株根際土壤真菌Alpha多樣性

圖3 門水平真菌群落組成相對(duì)豐度變化

采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)健株和黃萎病株根際土壤真菌屬水平物種差異進(jìn)行分析（圖5），結(jié)果表明健株和黃萎病株根際土壤真菌平均相對(duì)豐度較高的前15個(gè)菌群中，存在顯著差異的菌群包括小不整球殼屬（=0.0308）、（=0.0034）、輪枝菌屬（=0.0002）、鏈格孢屬（=0.0016）、葡萄穗霉屬（=0.0053）、曲霉屬（=0.0237）、紅酵母屬（=0.0205）、芽枝霉屬（=0.0426）；不存在顯著差異的菌群包括赤霉屬（=0.0530）、鐮孢菌屬（=0.9101）、刺盤孢屬（=0.3880）、被孢霉屬（=0.4321）、腐質(zhì)霉屬（=0.4792）、青霉屬（=0.0876）、維希尼克氏酵母屬（=0.0850）。

圖4 屬水平真菌群落組成相對(duì)豐度變化

X軸代表不同的分組，不同顏色的箱子表示不同的分組，Y軸代表某一物種在不同分組中的平均相對(duì)豐度

2.7 真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分含量的冗余分析

屬水平土壤優(yōu)勢真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性分析表明（圖 6），2個(gè)坐標(biāo)軸總共解釋93.5%的真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分含量的關(guān)系，能夠較好地反映土壤養(yǎng)分含量對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。進(jìn)一步分析表明，健株與黃萎病株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度對(duì)土壤養(yǎng)分的響應(yīng)不同。其中，健株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度（如小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬）與硝態(tài)氮、有機(jī)質(zhì)和pH呈正相關(guān)，而黃萎病株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度（如輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬）與無機(jī)磷和速效磷呈正相關(guān)。

綠色圓形代表健株根際土壤（1—4），紅色圓形代表黃萎病株根際土壤（5—8） The green circle represents rhizosphere soil of healthy plants, the red circle represents rhizosphere soil of diseased plants

2.8 健株與黃萎病株根際土壤微生物AWCD變化

AWCD 值提供了不同根際土壤微生物對(duì)相同碳源利用的差異性，反映了微生物對(duì)碳源的利用能力，從功能代謝方面表示微生物群落結(jié)構(gòu)功能多樣性。由圖7可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，健株和黃萎病株根際土壤微生物活性不斷升高，自1 d起AWCD值迅速升高，7 d后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。進(jìn)一步對(duì)健株和黃萎病株根際土壤微生物的AWCD值分析發(fā)現(xiàn)，黃萎病株根際土壤微生物的AWCD值在不同時(shí)間均高于健株根際土壤。

2.9 健株和黃萎病株根際土壤微生物對(duì)碳源利用特征

由圖8可知，健株和黃萎病株根際土壤微生物對(duì)氨基酸類、羧酸類和碳水化合物類物質(zhì)具有較高的利用率，達(dá)到70%以上，其次為聚合物類和胺類，對(duì)雙親類化合物的利用率最低。健株根際土壤微生物對(duì)氨基酸類、羧酸類、胺類、碳水化合物類、聚合物類和雙親化合物類的相對(duì)利用率分別為72.94%、79.63%、30.32%、82.44%、37.66%和12.02%；而黃萎病株根際土壤微生物對(duì)上述6類碳源的相對(duì)利用率分別為74.09%、100%、31.28%、83.24%、40.99%和12.35%。差異顯著性分析表明，黃萎病株根際土壤微生物對(duì)羧酸類相對(duì)利用率顯著高于健株（＜0.05），而對(duì)其他5類碳源的相對(duì)利用率差異不顯著。

圖7 健株與黃萎病株根際土壤微生物AWCD變化

3 討論

3.1 作物病害發(fā)生與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系

土壤微生物群落不僅是植株根際的重要組成部分，而且在植物生長發(fā)育及病害防治方面具有重要作用[20]。土壤微生物多樣性是維持土壤生態(tài)功能的基礎(chǔ)，其對(duì)維持土壤健康和抑制植物病害至關(guān)重要。吳照祥等[21]認(rèn)為土壤健康狀況不能簡單地以真菌群落生物多樣性來表示，其他指標(biāo)（如真菌的組成及豐度）也能夠用于指示土壤健康狀況。許多研究表明土壤微生物群落多樣性和組成與土傳病害的發(fā)生存在一定的聯(lián)系，豐富的微生物群落會(huì)提高土壤對(duì)土傳病害的抑制能力，但二者關(guān)系比較復(fù)雜[22-23]。

目前，關(guān)于土傳病害導(dǎo)致的土壤微生物群落多樣性發(fā)生改變存在不同的觀點(diǎn)。一部分學(xué)者認(rèn)為，健株根際土壤中真菌多樣性顯著高于感病土壤，群落組成發(fā)生改變[24-25]。劉海洋等[26]對(duì)棉花黃萎病不同發(fā)病程度根際土壤真菌群落的研究表明，重病棉田土壤中真菌多樣性低于輕病或健康棉田；李忠奎等[27]研究表明，煙草黑脛病和根結(jié)線蟲病的土壤真菌多樣性低于健康煙田，感病煙田土壤病原菌數(shù)量增加是導(dǎo)致多樣性下降的主要因素之一，并且在根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面存在明顯差異；Shang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，健康蘭州百合根際土壤真菌多樣性高于根腐病發(fā)病土壤，發(fā)病根際土壤中除了鐮孢菌屬豐度較高外，輪枝菌屬、絲核菌屬、青霉屬和的相對(duì)豐度也較高。

圖8 健株和黃萎病株根際土壤微生物對(duì)6類碳源的相對(duì)利用率

另一部分學(xué)者認(rèn)為，健株和感病植株的根際土壤真菌多樣性差異不顯著，但真菌群落組成存在差異[21,29-30]。宋旭紅等[29]研究表明，黃連根腐病株及健株根際土壤真菌多樣性差異不顯著，在病株土壤中子囊菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門的相對(duì)豐度顯著高于健株土壤，而接合菌門、球囊菌門和Neocallimastigomycota的相對(duì)豐度則顯著低于健株土壤；在屬水平上，病株土壤中鐮孢菌屬的相對(duì)豐度顯著高于健株土壤。吳照祥等[21]研究認(rèn)為，健株和感病植株的根際土壤真菌多樣性差異不顯著，健株根際土壤中火絲菌屬（）和被孢霉屬的相對(duì)豐度顯著高于感病植株根際土壤，尖鐮孢和周刺座霉屬的相對(duì)豐度則顯著低于感病植株土壤。本研究結(jié)果表明，馬鈴薯健株根際和黃萎病發(fā)病植株根際土壤真菌多樣性差異不顯著，健株根際土壤的小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬和曲霉屬的相對(duì)豐度顯著高于感病植株根際土壤，而感病植株根際土壤中輪枝菌屬、鏈格孢屬、紅酵母屬和芽枝霉屬的相對(duì)豐度顯著高于健株土壤。LUAN等[30]報(bào)道棉花枯萎病和黃萎病株根際土壤中鐮孢菌屬和輪枝菌屬數(shù)量較多，而在健康棉花根際土中木霉屬（）等有益菌的數(shù)量顯著高于發(fā)病棉花。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測序發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯黃萎病株根際土壤輪枝菌屬含量（或相對(duì)豐度）顯著高于健株根際土壤，相對(duì)豐度是健株根際土壤的71.96倍，表明馬鈴薯黃萎病的發(fā)生與輪枝菌屬含量的大幅度增加密切相關(guān)，獲得了與LUAN等[30]相似的研究觀點(diǎn)。此外，鏈格孢屬菌群是引起馬鈴薯早疫病的病原菌，在病株根際土壤中相對(duì)豐度顯著高于健株土壤；刺盤孢屬和鐮孢菌屬分別是引起馬鈴薯炭疽病和枯萎病的病原菌，其相對(duì)豐度在馬鈴薯健株與病株根際土壤中差異不顯著；而在健株根際土壤中曲霉屬的相對(duì)豐度顯著高于病株根際土壤。由此推測，在拮抗微生物資源篩選方面，可以通過有針對(duì)性地篩選曲霉屬菌群作為候選拮抗微生物菌群來抑制黃萎病。

此外，少數(shù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，病株根際土壤真菌多樣性高于健株土壤，且真菌群落組成發(fā)生改變。臍橙黃龍病株根際土壤真菌多樣性高于健康土壤，且菌群中子囊菌門、擔(dān)子菌門和球囊菌門與病害發(fā)生存在顯著的相關(guān)性[31]。綜合分析認(rèn)為，作物病害發(fā)生與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系非常復(fù)雜，但均顯著改變土壤微生物群落組成，尤其是病株根際土壤中增加了病原菌的數(shù)量或相對(duì)豐度。

3.2 健株、病株根際土壤養(yǎng)分含量與植物病害發(fā)生的關(guān)系

陳杰等[15]研究表明，馬鈴薯連作種植的病株土壤中速效磷和速效鉀含量均低于健株土壤，銨態(tài)氮含量在健株土壤低于病株土壤，推測可以通過增加磷、鉀肥的施用量及同時(shí)適當(dāng)減少氮肥用量來提高馬鈴薯植株的抗病性，減少土傳病害的發(fā)生；李忠奎等[27]研究表明，健康煙株根際土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、全磷、有效磷、全鉀、速效鉀含量顯著高于易感病煙田；白霜等[32]研究發(fā)現(xiàn)，新疆棉花黃萎病株土壤有機(jī)質(zhì)、可溶性總鹽含量均高于健株，棉花病株與健株土壤pH無明顯差異，棉花黃萎病病害發(fā)生與棉花土壤有機(jī)質(zhì)、可溶性總鹽含量密切相關(guān)；段春梅等[33]對(duì)黃瓜枯萎病株與健株土壤養(yǎng)分進(jìn)行比較，結(jié)果表明病株土壤中的速效磷、速效鉀含量分別較健株降低了16.3%和16.8%，病株和健株土壤中速效氮、有機(jī)質(zhì)、水溶性鹽分含量及pH無差異，說明土壤速效磷、速效鉀含量與黃瓜枯萎病發(fā)生有一定關(guān)系。本研究結(jié)果表明，馬鈴薯黃萎病的發(fā)生與根際土壤速效磷和無機(jī)磷含量存在正相關(guān)性，病株與健株根際土壤pH無明顯差異。進(jìn)一步推測，健株與病株根際土壤養(yǎng)分與植物病害發(fā)生的關(guān)系可能因病害和作物種類的不同而存在區(qū)別。綜合分析健株和病株根際土壤真菌群落組成與土壤養(yǎng)分之間的關(guān)系，可為合理施肥改善土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低土傳病害的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

土壤有機(jī)質(zhì)在維持土壤質(zhì)量中起著關(guān)鍵作用[34]。Shen等[35]研究表明，土壤微生物組成與土壤有機(jī)質(zhì)相關(guān)性最高，并且土壤有機(jī)質(zhì)與香蕉枯萎病的發(fā)生和鐮孢菌屬的相對(duì)豐度存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明土壤有機(jī)質(zhì)對(duì)病害具有潛在抑制作用；Liu等[36]研究表明，土壤中鐮孢菌對(duì)馬鈴薯枯萎病及其產(chǎn)量造成影響，鐮孢菌屬的相對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)和總氮量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Leon等[37]研究表明，土壤有機(jī)質(zhì)含量與菜豆根腐病發(fā)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Davis等[38]研究發(fā)現(xiàn)，土壤中有機(jī)質(zhì)含量高能夠使馬鈴薯黃萎病發(fā)病率下降。本研究結(jié)果表明，馬鈴薯健株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和豐度與有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮含量存在正相關(guān)性，而與速效磷和無機(jī)磷含量存在負(fù)相關(guān)性（圖6）。因此，通過人工施肥等措施改變根際土壤硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量、降低速效磷和無機(jī)磷的含量，從而調(diào)整病原菌和有益真菌的比例，對(duì)今后預(yù)防或降低馬鈴薯黃萎病的發(fā)生具有重要意義。

3.3 健株與病株根際土壤微生物對(duì)碳源利用能力分析

Biolog微生物鑒定方法是測定土壤微生物群落功能代謝多樣性的一種有效手段，通過測定不同碳源的平均吸光值，能夠反映微生物對(duì)各類碳源的利用情況。國內(nèi)外利用該方法在研究土壤微生物代謝功能多樣性方面開展了大量的工作[39-42]。張麗娟等[43]研究表明，大蒜根腐病株和健株根際土壤微生物對(duì)碳源有不同的利用強(qiáng)度，健康大蒜根際土壤微生物對(duì)碳水化合物和聚合物類碳源利用能力較高，病株根際土壤微生物對(duì)胺類和羧酸類碳源利用程度較高；顧美英等[44]研究核桃健株和腐爛病株根際土壤微生物對(duì)碳源的利用情況，結(jié)果表明健株土壤微生物對(duì)碳水化合物類和氨基酸類碳源有較強(qiáng)的利用能力，而腐爛病株根際土壤微生物利用碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源能力下降；吳照祥等[21]研究發(fā)現(xiàn)，三七健株和根腐病株根際土壤微生物對(duì)碳源利用能力無顯著差異。本研究結(jié)果表明，與馬鈴薯健株根際土壤相比，黃萎病株的根際土壤微生物顯著提高了對(duì)羧酸類碳源的利用能力，而對(duì)碳水化合物類、氨基酸類等碳源的利用能力差異不顯著。在10個(gè)羧酸類碳源方面，健株與病株對(duì)碳源利用能力的強(qiáng)弱和種類發(fā)生改變，健株根際土壤微生物利用強(qiáng)弱順序表現(xiàn)為4-羥基苯甲酸＞-羥基丁酸＞D-葡萄胺酸＞衣康酸＞D-半乳糖內(nèi)酯＞D-半乳糖醛酸＞丙酮酸甲酯＞D-蘋果酸＞2-羥基苯甲酸＞-丁酮酸，而病株根際土壤微生物利用強(qiáng)弱順序表現(xiàn)為4-羥基苯甲酸＞-羥基丁酸＞D-蘋果酸＞D-半乳糖醛酸＞D-葡萄胺酸＞2-羥基苯甲酸＞D-半乳糖內(nèi)酯＞衣康酸＞-丁酮酸＞丙酮酸甲酯，且病株對(duì)相同碳源的利用能力強(qiáng)于健株。在6個(gè)氨基酸類碳源方面，健株與病株對(duì)碳源利用的強(qiáng)弱順序均表現(xiàn)為L-天冬酰胺酸＞L-苯基丙氨酸＞L-精氨酸＞L-絲氨酸＞甘氨酰-L-谷氨酸＞L-蘇氨酸，兩者利用能力差異不顯著。在3個(gè)胺類碳源方面，健株與病株的利用強(qiáng)弱順序均表現(xiàn)為N-乙酰-D-葡萄糖胺＞苯乙基胺＞腐胺，病株利用能力高于健株，但差異不顯著。在7個(gè)碳水化合物類碳源方面，健株根際土壤微生物利用強(qiáng)弱順序表現(xiàn)為-D-乳糖＞肝糖＞D-纖維二糖＞D-甘露醇＞i-赤藻糖醇＞-甲基-D-葡萄糖苷＞D-木糖，而病株根際土壤微生物利用強(qiáng)弱順序?yàn)镈-纖維二糖＞-D-乳糖＞肝糖＞D-甘露醇＞i-赤藻糖醇＞D-木糖＞-甲基-D-葡萄糖苷。在3個(gè)聚合物類碳源方面，健株根際土壤微生物利用強(qiáng)弱順序表現(xiàn)為吐溫40＞吐溫80＞-環(huán)式糊精，而病株根際土壤微生物利用強(qiáng)弱順序表現(xiàn)為吐溫80＞吐溫40＞-環(huán)式糊精，病株對(duì)相同碳源的利用能力強(qiáng)于健株。在2個(gè)雙親化合物類碳源方面，健株與病株對(duì)碳源利用的強(qiáng)弱順序均表現(xiàn)為葡萄糖-1-磷酸鹽＞D, L--磷酸甘油。

Biolog-ECO技術(shù)能快速反映微生物群落功能多樣性的變化特征。Biolog-ECO生態(tài)板中的31種碳源物質(zhì)可分為氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、胺類、聚合物類以及雙親化合物類，其中碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類物質(zhì)是植物根系分泌物的主要成分。因此，在借助Biolog方法研究健康與發(fā)病植株根際土壤微生物功能多樣性時(shí)，應(yīng)將碳源代謝利用情況與植物根系分泌物聯(lián)系起來，以完善該技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用。已有研究表明，病原菌侵入寄主后會(huì)改變植株生理代謝，導(dǎo)致根系分泌物中一些成分及含量發(fā)生變化，從而可能導(dǎo)致健康植株與發(fā)病植株根際微生物數(shù)量、種類以及對(duì)碳源的利用能力明顯不同[45-46]。本研究采用Biolog技術(shù)探明了健株與黃萎病株根際土壤微生物代謝活動(dòng)的差異，從微生物群落功能多樣性方面探索黃萎病發(fā)生的可能原因。

此外，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過研究根際土壤微生物群落，為探索土壤中存在拮抗微生物提供了新的線索[47]。本研究通過高通量測序技術(shù)分別獲得了健株與黃萎病株根際土壤特異的真菌菌群。將不能分離鑒定或平均相對(duì)豐度＜1%的歸為其他，在健株根際土壤特異的菌群包括，（2.13%）、（2.66%）、瓣菌屬（，2.66%）、（3.19%）、（4.26%）、盤菌屬（，4.26%）。在黃萎病株根際土壤特異的菌群包括，（83.83%）和（1.14%）。因此，通過高通量測序了解健株與黃萎病株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，從馬鈴薯健株根際土壤特異菌群中篩選馬鈴薯黃萎病新的拮抗菌，是篩選生防菌并構(gòu)建具備拮抗功能的健康馬鈴薯微生物菌群的潛在資源。

4 結(jié)論

黃萎病株根際土壤真菌多樣性指數(shù)降低，且大麗輪枝菌的數(shù)量大于健株根際土壤。健株與黃萎病株根際土壤的優(yōu)勢真菌群落相對(duì)豐度對(duì)土壤養(yǎng)分的響應(yīng)不同，健株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度（如小不整球殼屬、、葡萄穗霉屬、赤霉屬、曲霉屬）與硝態(tài)氮、有機(jī)質(zhì)和pH呈正相關(guān)，黃萎病株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度（如輪枝菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬、被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、青霉屬、維希尼克氏酵母屬、紅酵母屬和芽枝霉屬）與土壤無機(jī)磷和速效磷含量呈正相關(guān)。健株與病株根際土壤優(yōu)勢群落的相對(duì)豐度與土壤養(yǎng)分含量表現(xiàn)相反的趨勢。此外，與健株相比，病株根際土壤微生物對(duì)羧酸類碳源的利用能力顯著提高，最終揭示黃萎病發(fā)生與土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的互作關(guān)系。

[1] JING R, LI H Y, HU X P, SHANG W J, SHEN R Q, GUO C J, GUO Q Y, SUBBARAO K V. Verticillium wilt caused byandin potato in northern China. Plant Disease, 2018, 102(10): 1958-1964.

[2] 徐進(jìn), 朱杰華, 楊艷麗, 湯浩, 呂和平, 樊明壽, 石瑛, 董道峰, 王貴江, 王萬興, 熊興耀, 高玉林. 中國馬鈴薯病蟲害發(fā)生情況與農(nóng)藥使用現(xiàn)狀. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(16): 2800-2808.

XU J, ZHU J H, YANG Y L, TANG H, Lü H P, FAN M S, SHI Y, DONG D F, WANG G J, WANG W X, XIONG X Y, GAO Y L. Status of major diseases and insect pests of potato and pesticide usage in China. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(16): 2800-2808. (in Chinese)

[3] ROWE R C, POWELSON M L. Potato early dying: management challenges in a changing production environment. Plant Disease, 2002, 86(11): 1184-1193.

[4] WIGGINS B E, KINKEL L L. Green manures and crop sequences influence potato diseases and pathogen inhibiting activity of indigenous streptomycetes. Phytopathology, 2005, 95(2): 178-185.

[5] 陳愛昌, 魏周全, 馬永強(qiáng), 鄧成貴. 甘肅省馬鈴薯黃萎病病原分離與鑒定. 植物病理學(xué)報(bào), 2013, 43(4): 418-420.

CHEN A C, WEI Z Q, MA Y Q, DENG C G. Isolation and identification of the pathogens causing potato verticillium wilt in Gansu. Acta Phytopathologica Sinica, 2013, 43(4): 418-420. (in Chinese)

[6] 王麗麗, 蔡超, 羅明, 顧愛星, 王慧, 李克梅. 馬鈴薯黃萎病研究現(xiàn)狀. 生物安全學(xué)報(bào), 2017, 26(1): 30-38.

WANG L L, CAI C, LUO M, GU A X, WANG H, LI K M. Research advances of verticillium wilt of potato. Journal of Biosafety, 2017, 26(1): 30-38. (in Chinese)

[7] 景瑞, 趙方杰, 劉一凡, 商文靜, 沈瑞清, 郭青云, 胡小平. 寧夏馬鈴薯黃萎病病原菌分離鑒定及寄主范圍測定. 植物病理學(xué)報(bào), 2019, 49(1): 11-19.

JING R, ZHAO F J, LIU Y F, SHANG W J, SHEN R Q, GUO Q Y, HU X P. Isolation and identification of potato verticillium wilt pathogen in Ningxia and its host range. Acta Phytopathologica Sinica, 2019, 49(1): 11-19. (in Chinese)

[8] 趙衛(wèi)松, 李社增, 鹿秀云, 郭慶港, 王培培, 蘇振賀, 張曉云, 馬平. 防治馬鈴薯黃萎病芽胞桿菌種子處理劑的研制及應(yīng)用. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2019, 35(5): 759-767.

ZHAO W S, LI S Z, LU X Y, GUO Q G, WANG P P, SU Z H, ZHANG X Y, MA P. Development and application ofspp. seed-treating agent against potato verticillium wilt. Chinese Journal of Biological Control, 2019, 35(5): 759-767. (in Chinese)

[9] 趙曉軍, 張鍵, 張貴, 張園園, 周洪友, 趙君. 馬鈴薯黃萎病病原菌營養(yǎng)親和群、生理小種、交配型鑒定以及致病力差異分析. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2018, 45(6): 1212-1219.

ZHAO X J, ZHANG J, ZHANG G, ZHANG Y Y, ZHOU H Y, ZHAO J. Identification of the vegetative compatibility groups (VCGs), races, mating types, and pathogenicity differentiation of pathogenic bacteria of potato verticillium wilt. Journal of Plant Protection, 2018, 45(6): 1212-1219.(in Chinese)

[10] 李社增, 周洪友, 鹿秀云, 年冠臻, 郭慶港, 趙衛(wèi)松, 東保柱, 申建芳, 王培培, 張曉云, 閆磊, 馬平. 中國七省(自治區(qū))馬鈴薯黃萎病病情及優(yōu)勢病原菌致病力分析. 植物病理學(xué)報(bào), 2018, 48(5): 656-665.

LI S Z, ZHOU H Y, LU X Y, NIAN G Z, GUO Q G, ZHAO W S, DONG B Z, SHEN J F, WANG P P, ZHANG X Y, YAN L, MA P. Occurrence of potato verticillium wilt and analysis of pathogenicity differentiation of the major pathogen in seven provinces of China. Acta Phytopathologica Sinica, 2018, 48(5): 656-665. (in Chinese)

[11] GORISSEN A, VAN OVERBEEK L S, VAN ELSAS J D. Pig slurry reduces the survival ofbiovar 2 in soil. Canadian Journal of Microbiology, 2004, 50(8): 587-593.

[12] VAN BRUGGEN A H C, SEMENOV A M, VAN DIEPENINGEN A D, DE VOS O J, BLOK W J. Relation between soil health, wave-like fluctuations in microbial populations, and soil-borne plant disease management. European Journal of Plant Pathology, 2006, 115(1): 105-122.

[13] YANG C H, CROWLEY D E, MENGE J A. 16S rDNA finger printing of rhizosphere bacterial communities associated with healthy andinfected avocado roots. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 35(2): 129-136.

[14] 祈建軍, 姚槐應(yīng), 李先恩, 薛梅, 馬小軍. 磷脂脂肪酸法分析地黃根際土壤微生物多樣性. 土壤, 2008, 40(3): 448-454.

QI J J, YAO H Y, LI X E, XUE M, MA X J. Analysis of soil microbial diversity inrhizosphere with phospholipid fatty acid method. Soils, 2008, 40(3): 448-454. (in Chinese)

[15] 陳杰, 郭天文, 譚雪蓮, 朱渭兵, 魏曉麗, 王東勝, 薛泉宏. 馬鈴薯連作地健康株與病株根區(qū)土壤微生態(tài)特性比較. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39(11): 2055-2064.

CHEN J, GUO T W, TAN X L, ZHU W B, WEI X L, WANG D S, XUE Q H. Comparison of microecological characterization in rhizosphere soil between healthy and diseased plants in continuous cropping potato fields.Acta Agronomica Sinica, 2013, 39(11): 2055-2064. (in Chinese)

[16] ADAMS R I, MILETTO M, TAYLOR J W, BRUNS T D. Dispersal in microbes: fungi in indoor air are dominated by outdoor air and show dispersal limitation at short distances. The ISME journal, 2013, 7(7): 1262-1273.

[17] 趙衛(wèi)松, 郭慶港, 李社增, 王亞嬌, 鹿秀云, 王培培, 蘇振賀, 張曉云, 馬平. 西蘭花殘?bào)w還田對(duì)棉花黃萎病防治效果及其對(duì)不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(24): 4505-4517.

ZHAO W S, GUO Q G, LI S Z, WANG Y J, LU X Y, WANG P P, SU Z H, ZHANG X Y, MA P. Control efficacy of broccoli residues on cotton verticillium wilt and its effect on soil bacterial community at different growth stages. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(24): 4505-4517. (in Chinese)

[18] WANG C, ZHENG M M, SONG W F, WEN S L, WANG B R, ZHU C Q, SHEN R F. Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in Southern China. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 113: 240-249.

[19] GARLAND J L, MILLS A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57(8): 2351-2359.

[20] WAGG C, DUDENHOFFER J H, WIDMER F, VAN DER HEIJDEN M G A. Linking diversity, synchrony and stability in soil microbial communities. Functional Ecology, 2018, 32(5): 1280-1292.

[21] 吳照祥, 郝志鵬, 陳永亮, 曾燕, 郭蘭萍, 黃璐琦, 王勇, 陳保冬. 三七根腐病株根際土壤真菌群落組成與碳源利用特征研究. 菌物學(xué)報(bào), 2015, 34(1): 65-74.

WU Z X, HAO Z P, CHEN Y L, ZENG Y, GUO L P, HUANG L Q, WANG Y, CHEN B D. Characterization of fungal community composition and carbon source utilization in the rhizosphere soil ofsuffering from root-rot disease. Mycosystema, 2015, 34(1): 65-74. (in Chinese)

[22] GAMLIEL A, AUSTERWEIL M, KRITZMAN G. No-chemical approach to soilborne pest management—organic amendments. Crop Protection, 2000, 19(8/10): 847-853.

[23] BULLUCK L R, BROSIUS M, EVANYLO G K, RISTAINO J B. Organic and synthetic fertility amendments influence soil microbial, physical and chemical properties on organic and conventional farms. Applied Soil Ecology, 2002, 19(2): 147-160.

[24] BAKKER M G, GLOVER J D, MAI J G, KINKEL L L. Plant community effects on the diversity and pathogen suppressive activity of soil streptomycetes. Applied Soil Ecology, 2010, 46(1): 35-42.

[25] BRUSSAARD L, DE RUITER P, BROWN G G. Soil biodiversity for agricultural sustainability. Agriculture, Ecosystems and Environment, 2007, 121(3): 233-244.

[26] 劉海洋, 王偉, 張仁福, 熱西達(dá)·阿不都熱合曼, 姚舉. 黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤中的真菌群落特征分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(3): 455-465.

LIU H Y, WANG W, ZHANG R F, RAXIDA A, YAO J. Fungal community structure of cotton-field soil under different incidences of cotton verticillium wilt. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(3): 455-465. (in Chinese)

[27] 李忠奎, 凌愛芬, 李紅麗, 陳娟, 朱顯俊, 王勇, 陳玉藍(lán), 王巖. 基于多樣性測序?qū)】蹬c易感病煙田根際土壤微生物群落分析. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 53(6): 918-925.

LI Z K, LING A F, LI H L, CHEN J, ZHU X J, WANG Y, CHEN Y L, WANG Y. Analysis of rhizosphere soil microbial communities in healthy and susceptible tobacco fields based on diversity sequencing. Journal of Henan Agricultural University, 2019, 53(6): 918-925. (in Chinese)

[28] SHANG Q H, YANG G, WANG Y, WU X K, ZHAO X, HAO H T, LI Y Y, XIE Z K, ZHANG Y B, WANG R Y. Illumina-based analysis of the rhizosphere microbial communities associated with healthy and wilted Lanzhou lily (var.) plants grown in the field. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 32(6): 95.

[29] 宋旭紅, 譚均, 李隆云, 王鈺, 伍曉麗. Illumina高通量測序揭示黃連根腐根際土壤真菌群落組成及多樣性. 中草藥, 2018, 49(22): 5396-5403.

SONG X H, TAN J, LI L Y, WANG Y, WU X L. Illumina high-throughput sequencing reveals fungal community composition and diversity in root rot ofin rhizosphere soil. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2018, 49(22): 5396-5403. (in Chinese)

[30] LUAN F G, WANG L, LIU Y N, LOU Y Y, ZHANG H Y, ZHANG L L. Analysis of culturable fungal diversity in rhizosphere soil of healthy and diseased cotton in Southern Xinjiang. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6(47): 7357-7364.

[31] 涂祖新, 張莉莉, 賀偉華, 占智高, 王金昌. 贛南臍橙黃龍病株與健康株的根際土壤真菌群落多樣性比較. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 44(2): 333-341.

TU Z X, ZHANG L L, HE W H, ZHAN Z G, WANG J C. Fungi diversity in the soil around the healthy and huanglongbing-diseased roots ofOsbeck in Southern Jiangxi Province.Journal of Anhui Agricultural University, 2017, 44(2): 333-341. (in Chinese)

[32] 白霜, 薛泉宏, 趙邑塵, 曹書苗, 同延安, 王曉輝, 徐萬里. 新疆棉區(qū)不同含鹽土壤棉花健株與黃萎病株根區(qū)放線菌研究. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) , 2009, 37(7): 183-190.

BAI S, XUE Q H, ZHAO Y C, CAO S M, TONG Y A, WANG X H, XU W L. Study on actinomycetic ecology between healthy and diseased plants’ rhizosphere with different salt contents in Xinjiang. Journal of Northwest A&F University (Natural Science Edition), 2009, 37(7): 183-190. (in Chinese)

[33] 段春梅, 薛泉宏, 呼世斌, 趙娟, 魏樣, 王玲娜, 申光輝, 陳秦. 連作黃瓜枯萎病株、健株根域土壤微生物生態(tài)研究. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 38(4): 143-150.

DUAN C M, XUE Q H, HU S B, ZHAO J, WEI Y, WANG L N, SHEN G H, CHEN Q. Microbial ecology of fusarium wilt infected and healthy cucumber plant in root zone of continuous cropping soil. Journal of Northwest A&F University (Natural Science Edition), 2010, 38(4): 143-150. (in Chinese)

[34] BAUSENWEIN U, GATTINGER A, LANGER U, EMBACHER A, HARTMANN H P, SOMMER M, MUNCH J, SCHLOTER M. Exploring soil microbial communities and soil organic matter: variability and interactions in arable soils under minimum tillage practice. Applied Soil Ecology, 2008, 40(1): 67-77.

[35] SHEN Z Z, PENTON C R, Lv N, XUE C, YUAN X F, RUAN Y Z, LI R, SHEN Q R. Banana fusarium wilt disease incidence is influenced by shifts of soil microbial communities under different monoculture spans. Microbial Ecology, 2018, 75(1): 739-750.

[36] LIU X, ZHANG J L, GU T Y, ZHANG W M, SHEN Q R, YIN S X, QIU H Z. Microbial community diversities and taxa abundances in soils along a seven-year gradient of potato monoculture using high throughput pyrosequencing approach.PLoS ONE, 2014, 9(1): e86610.

[37] LEON M C C, STONE A, DICK R P. Organic soil amendments: impacts on snap bean common root rot () and soil quality. Applied Soil Ecology, 2006, 31(3): 199-210.

[38] DAVIS J R, HUISMAN O C, EVERSON D O, SCHNEIDER A T. Verticillium wilt of potato: a model of key factors related to disease severity and tuber yield in Southeastern Idaho. American Journal of Potato Research, 2001, 78: 291.

[39] ASCHI A, AUBERT M, RIAH-ANGLET W, NELIEU S, DUBOIS C, AKPA-VINCESLAS M, TRINSOUTROT-GATTIN I. Introduction of faba bean in crop rotation: Impacts on soil chemical and biological characteristics. Applied Soil Ecology, 2017, 120: 219-228.

[40] ZHANG H, XU W X, LI Y B, LYU J L, CAO Y F, HE W X. Changes of soil microbial communities during decomposition of straw residues under different land uses. Journal of Arid Land, 2017, 9(5): 666-677.

[41] JIANG L L, HAN G M, LAN Y, LIU S N, GAO J P, YANG X, MENG J, CHEN W F. Corn cob biochar increases soil culturable bacterial abundance without enhancing their capacities in utilizing carbon sources in biolog eco-plates. Journal of Integrative Agriculture, 2017, 16(3): 713-724.

[42] RUTGERS M, WOUTERSE M, DROST S M, BREURE A M, MULDER C, STONE D, CREAMER R E, WINDING A, BLOEM J. Monitoring soil bacteria with community-level physiological profiles using BiologTMECO-plates in the Netherlands and Europe. Applied Soil Ecology, 2016, 97: 23-35.

[43] 張麗娟, 茆軍, 張志東, 謝玉清. 新疆大蒜根腐型病害根際土壤微生物群落多樣性初探. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 50(11): 2109-2117.

ZHANG L J, MAO J, ZHANG Z D, XIE Y Q. Study of microbial community diversity in rhizosphere soil from garlic infected by root rot disease. Xinjiang Agricultural Sciences, 2013, 50(11): 2109-2117. (in Chinese)

[44] 顧美英, 徐萬里, 張志東, 唐光木, 唐琦勇, 雇玉忠, 宋素琴, 古麗尼沙·沙依木, 楊波, 馮雷. 不同腐爛病發(fā)病程度核桃根區(qū)土壤微生物多樣性分析. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 55(6): 1107-1116.

GU M Y, XU W L, ZHANG Z D, TANG G M, TANG Q Y, GU Y Z, SONG S Q, GULINISHA S, YANG B, FENG L. Analysis of soil microbial diversity in root zone of walnut orchard with different levels of rot disease. Xinjiang Agricultural Sciences, 2018, 55(6): 1107-1116. (in Chinese)

[45] 苗則彥, 趙奎華, 劉長遠(yuǎn), 梁春浩, 林鳳. 健康與罹病黃瓜根際微生物數(shù)量及真菌區(qū)系研究. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2004, 12(3): 156-157.

MIAO Z Y, ZHAO K H, LIU C Y, LIANG C H, LIN F. Rhizosphere microorganism quantity and fungal flora of healthy and infected cucumber plants by. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2004, 12(3): 156-157. (in Chinese)

[46] 韓雪, 吳鳳芝, 潘凱. 根系分泌物與土傳病害關(guān)系之研究綜述. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2006, 2(22): 316-318.

HAN X, WU F Z, PAN K. Review on the relation between the root exudates and soil-spread disease. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2006, 2(22): 316-318. (in Chinese)

[47] BERENDSEN R L, PIETERSE C M J, BAKKER P A H M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plants Science, 2012, 17(8): 478-486.

Characterization of fungal community structure in the rhizosphere soil of healthy and diseased-verticillium wilt potato plants and Carbon source utilization

ZHAO WeiSong, GUO QingGang, SU ZhenHe, WANG PeiPei, DONG LiHong, HU Qing, LU XiuYun, ZHANG XiaoYun, LI SheZeng, MA Ping

Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Centre of Hebei Province/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Baoding 071000, Hebei

【】The objective of this study is to research the differences of the structure and functional diversity of fungal community in the rhizosphere soil of healthy and diseased potato plants, and to clarify the relationship between the structure of soil fungal community and the occurrence of verticillium wilt, so as to provide a theoretical basis for the final explanation of the causes of potato verticillium wilt and ecological control from the perspective of microbial ecology.【】The rhizosphere soil of healthy and diseased plants of verticillium wilt of potato was collected from Bashang area in Hebei Province. The number of ITS gene copies ofwas determined by real-time quantitative PCR, and the structure of soil fungal communities was measured by high-throughput sequencing (Illumina MiSeq). The quantity ofand the community of soil fungi were analyzed. The redundancy analysis (RDA) was used to determine the correlation between fungal community structure and soil nutrient. Meanwhile, the utilization capacity of rhizosphere soil microorganisms of healthy and diseased plants to carbon source was compared by Biolog-Eco plate method.【】The occurrence of verticillium wilt of potato was related to the ITS gene copy number ofin soil. The ITS gene copy number of pathogens was high in rhizosphere soil of diseased plants, but not detected in healthy plants. Illumina MiSeq analysis showed that the diversity index of fungi in rhizosphere soil of diseased plants was lower than that of healthy plants, but the diversity difference was not significant. Compared with the rhizosphere soil of healthy plants, at phylum level, the relative abundance of Ascomycota and Mortierellomycota was increased by 20.68% and 16.16%, respectively, while that of Basidiomycota was decreased by 51.43%. At genus level, the average relative abundance of,,,andin rhizosphere soil of diseased plants was increased by 71.96, 3.62, 6.11, 15.38 and 6.24 times, respectively, while that of,,,,was decreased by 45.10%, 61.41%, 96.87%, 45.85% and 44.39%, respectively. RDA of fungal community composition and soil nutrient showed that the relative abundance of dominant communities in rhizosphere soil of healthy plants (such as,,,and) was positively correlated with nitrate nitrogen (NO3--N), organic matter (OM) and pH, while the relative abundance of dominant communities in rhizosphere soil of diseased plants (such as,,,,,,,and) was positively correlated with inorganic phosphorus (IP) and available phosphorus (AP). The AWCD values of rhizosphere soil of healthy and diseased plants indicated that the utilization ability of microorganisms to carbon source in rhizosphere soil of diseased plants was higher than that of healthy plants. Further analysis showed that, compared with the healthy plants, the utilization ability of rhizosphere soil microorganisms to carboxylic acids carbon source was significantly improved, while the utilization ability to amino acids, amines, carbohydrates, polymers and miscellaneous was not significantly different.【】The decrease of fungal diversity and the change of community structure in rhizosphere soil of healthy and diseased plants are the important characteristics of potato verticillium wilt. The significant increase of relative abundance ofis the most important characteristic, and the structure of fungal community is affected by soil nutrient. At the same time, the utilization of carboxylic acids carbon source is significantly increased by rhizosphere soil microorganisms of diseased plants.

potato verticillium wilt;; rhizosphere soil; fungal community structure; Illumina MiSeq; soil nutrient; Biolog technique

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.006

2020-04-16；

2020-05-19

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0200601）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)） 科研專項(xiàng)（201503109）、河北省農(nóng)林科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（1-02-03）

趙衛(wèi)松，Tel：0312-5927076；E-mail：zhaoweisong1985@163.com。通信作者馬平，Tel：0312-5915678；E-mail：pingma88@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）