油菜高油酸種質(zhì)的創(chuàng)建及高油酸性狀遺傳與生理特性的分析

龍衛(wèi)華，浦惠明，高建芹，胡茂龍，張潔夫，陳松

油菜高油酸種質(zhì)的創(chuàng)建及高油酸性狀遺傳與生理特性的分析

龍衛(wèi)華，浦惠明，高建芹，胡茂龍，張潔夫，陳松

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014

【】創(chuàng)建高油酸（high oleic，HO）油菜新種質(zhì)，探明HO新種質(zhì)中高油酸性狀的遺傳模式，明確HO新種質(zhì)油酸含量變化的生理特性，為培育HO油菜新品種奠定基礎(chǔ)。采用輻射處理油菜萌動(dòng)發(fā)芽種子，獲得初級(jí)誘變?nèi)后w后在后續(xù)世代利用極端選擇法結(jié)合小孢子培養(yǎng)技術(shù)篩選油菜HO新種質(zhì)。以HO新種質(zhì)分別與3個(gè)不同遺傳背景的常規(guī)油菜品系為親本組合雜交構(gòu)建6個(gè)世代（P1、P2、F1、BC1P1、BC1P2和F2）的遺傳群體，測(cè)定各群體脂肪酸含量后應(yīng)用主基因+多基因混合遺傳模型聯(lián)合分析方法對(duì)遺傳群體的高油酸性狀進(jìn)行遺傳分析。測(cè)定HO新種質(zhì)種子發(fā)芽過程中子葉、不同溫度處理下苗期營養(yǎng)器官以及角果成熟過程中種子的油酸含量，明確其變化規(guī)律及生理效應(yīng)。通過輻射獲得油酸含量顯著變化的初級(jí)誘變?nèi)后w，在后續(xù)世代持續(xù)利用極端選擇法得到平均油酸含量升高20個(gè)百分點(diǎn)的高世代群體，采用小孢子培養(yǎng)得到純合穩(wěn)定的油菜HO雙單倍體群體，最終根據(jù)品質(zhì)性狀篩選成功得到HO新種質(zhì)B161，其油脂中油酸含量為85%，亞麻酸含量為3%。以B161為HO親本和常規(guī)品系雜交配置得到3個(gè)具有不同遺傳背景的遺傳群體并測(cè)定獲得各群體的油酸含量表型數(shù)據(jù)。脂肪酸含量相關(guān)性分析表明，十八碳脂肪酸中油酸含量與亞油酸含量和亞麻酸含量具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。遺傳分析結(jié)果表明，該種質(zhì)中高油酸性狀由2對(duì)具有加性效應(yīng)的主效基因控制，并且2對(duì)基因?qū)τ退岷康男?yīng)值接近。生理分析表明，常溫下HO品系營養(yǎng)器官（根、莖、葉和葉柄）的油酸含量均顯著高于常規(guī)品系，亞麻酸含量顯著低于常規(guī)品系。低溫下HO品系營養(yǎng)器官的油酸含量降低，但仍高于常規(guī)品系；常規(guī)品系油酸含量在低溫下穩(wěn)定。低溫下兩類品系營養(yǎng)器官的亞麻酸含量均顯著提高，但HO品系亞麻酸含量仍低于常規(guī)品系。在種子成熟過程和種子發(fā)芽過程中，HOLL品系中油酸含量持續(xù)顯著高于常規(guī)油菜，而亞麻酸含量則持續(xù)顯著低于常規(guī)油菜。成功創(chuàng)制了油菜HO新品系B161，明確了新種質(zhì)HO性狀的遺傳規(guī)律和生理特性。獲得的HO品系具有潛在育種利用價(jià)值。

油菜；輻射誘變；種質(zhì)創(chuàng)新；高油酸性狀；遺傳分析；低溫響應(yīng)

0 引言

【研究意義】油菜是中國三大主要油料作物之一，菜籽油在中國居民日常生活中具有良好的消費(fèi)基礎(chǔ)[1]。近年來，菜籽油已成為國產(chǎn)植物油的第一大來源，因此，菜籽油的品質(zhì)（主要是脂肪酸含量比例）對(duì)中國居民健康具有重要影響[2]。在中國油菜全面實(shí)現(xiàn)“雙低化”（2003年）后，十八碳脂肪酸含量的改良成為目前油菜品質(zhì)育種的重要目標(biāo)[3]。與普通雙低菜籽油相比，高油酸（high oleic，HO）菜籽油[4-5]具有四大優(yōu)勢(shì)：（1）較耐貯藏，貨架期較長；（2）可降低低密度脂蛋白含量，減少膽固醇形成，預(yù)防人體心血管疾?。唬?）甲酯化程度高，燃燒值高，更有利于生產(chǎn)生物柴油；（4）有利于提高菜籽油的氧化穩(wěn)定性，是菜籽油不容易變質(zhì)生成反式脂肪酸（或位置異構(gòu)脂肪酸）和產(chǎn)生異味[6]。創(chuàng)建HO甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)并以此培育HO油菜品種是提供高品質(zhì)菜籽油的有效途徑。【前人研究進(jìn)展】截至目前，國內(nèi)外學(xué)者通過不同方法獲得了HO甘藍(lán)型油菜種質(zhì)。國際上，最早用甲基磺酸乙酯（ethylmethylsulfone，EMS）誘變油菜種子并在后代篩選出高油酸突變系，油酸含量最高可達(dá)88%[7-8]。此后，有報(bào)道用疊氮化鈉誘變出高油酸油菜突變體[9]。國內(nèi)學(xué)者也重視HO材料創(chuàng)制并得到HO種質(zhì)。和江明等[10]最早用EMS誘變處理油菜小孢子篩選出油酸含量為80.3%的高油酸突變體材料，隨后多位學(xué)者通過化學(xué)誘變得到高油酸突變體[11-13]。而物理方法主要是采用放射性射線輻照產(chǎn)生變異。運(yùn)用這種方法成功獲得高油酸種質(zhì)的共有2例，一是利用60Co射線輻照油菜干種子后連續(xù)定向選擇獲得最高油酸含量達(dá)93.5%（近紅外法測(cè)定）的株系；二是通過航天誘變方法獲得一個(gè)高油酸含量（87.22%）的突變株系[13-14]。此外，轉(zhuǎn)基因方法也可以獲得高油酸種質(zhì)。多位學(xué)者利用RNAi技術(shù)獲得了油酸含量超過80%的株系，但轉(zhuǎn)基因種質(zhì)因需要經(jīng)過嚴(yán)格的釋放前環(huán)境評(píng)審而不能較快在育種中得到應(yīng)用，而且目前還未有成功釋放的先例[15-20]。綜合來看，采用非轉(zhuǎn)基因方法得到的高油酸種質(zhì)具有可即時(shí)應(yīng)用的比較優(yōu)勢(shì)。不同學(xué)者對(duì)油菜高油酸性狀的遺傳模式進(jìn)行了探索。品系19782/7531的高油酸性狀（C18:1=78.4%）由2個(gè)突變位點(diǎn)控制[21]。對(duì)高油酸親本DMS100（C18:1=77%）與普通品系衍生的DH群體進(jìn)行QTL定位后發(fā)現(xiàn)高油酸性狀主要由1個(gè)主效位點(diǎn)控制[11]。HO自交系Y539（C18:1=87.22%）的高油酸性狀是由分別位于A05和A01染色體上的2個(gè)主效基因控制[15]。H005的高油酸性狀（C18:1=83.10%）由2對(duì)具有加性和顯性效應(yīng)的主效基因控制[22]。HO品系SW Hickory（C18:1=78%）的高油酸性狀由位于A5染色體上1個(gè)主效QTL控制[23]。HO品系N1379T（C18:1=85%）的高油酸性狀則是由位于A5和C5染色體上的2個(gè)位點(diǎn)共同控制[24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管通過不同手段得到了HO種質(zhì)，但控制其HO性狀的遺傳模式并非一致，表明這些種質(zhì)在遺傳上具有不同的機(jī)制。同時(shí)，已有HO種質(zhì)的生理特性也未有深入研究。21世紀(jì)初江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油菜研究室利用輻射方法獲得油菜脂肪酸組分的變異，并結(jié)合多種育種方法，最終成功創(chuàng)建一個(gè)全新的HO種質(zhì)B161?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)B161中HO性狀的遺傳模式及其油酸含量變化的生理特性進(jìn)行研究，推進(jìn)該種質(zhì)的育種利用進(jìn)程，進(jìn)一步改良菜籽油品質(zhì)，為提供高品質(zhì)菜籽油奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

誘變?cè)疾牧蠟楦呤来筒俗越幌礚13-306-171，油酸（C18:1）與亞麻酸（C18:3）含量經(jīng)近紅外分析含量分別約為72.21%和4.18%（后期經(jīng)氣相色譜分析C18:1≈68%，C18:3≈7%），其系譜見傅壽仲等[25]。常規(guī)油菜品系N15、N27和N137為3個(gè)不同遺傳背景的高世代育種自交系。以上材料均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.2 油菜HO種質(zhì)的誘變及選育過程

選取L13-306-171干凈一致的1 000 粒種子（即M0代）排列在培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤濾紙上于25℃暗培養(yǎng)，每皿100粒種子，共10皿。待胚根萌動(dòng)露白后送至揚(yáng)州市輻照中心進(jìn)行800 Gray60Co-?射線輻照（輻照劑量參考徐華軍等[26]）。輻射處理后的萌動(dòng)種子繼續(xù)發(fā)芽后栽于大田。2004年在輻射當(dāng)代（即M1代）選擇優(yōu)勢(shì)單株套袋自交收獲種子。測(cè)定脂肪酸組分后按油酸含量從高到低選擇30株單株種子作為基礎(chǔ)選擇群體（即M2代）。從每個(gè)單株自交種子中分別取等量種子混合種植。隨后連續(xù)3年重復(fù)上年度的方法獲得M5代基礎(chǔ)群體。在本世代選擇質(zhì)量較好的種子進(jìn)行半粒法脂肪酸含量測(cè)定。2007年秋選取油酸含量＞80%的對(duì)應(yīng)半粒種子在室內(nèi)發(fā)芽后栽于大田形成M6代。2008年繼續(xù)選擇油酸高值單株種植于大田，于2009年春季選擇單株花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng)得到若干DH株系（M7代），選取油酸含量較高且亞麻酸含量較低的DH系作為候選株系。次年經(jīng)全生育期觀察比較后篩選最優(yōu)HO株系。

1.3 高油酸性狀的遺傳群體構(gòu)建

以中選的HO種質(zhì)B161（P1，C18:1=（85.36±0.50）%）和常規(guī)油菜品系N15、N27和N137親本（P2）種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)基地油菜育種田，2014年春季雜交分別獲得3個(gè)雜交組合的共6個(gè)正反交F1。2015年將各親本自交，F(xiàn)1自交得到F2分離群體種子，同時(shí)F1與2個(gè)親本分別回交得到BC1代的足量種子（BC1P1和BC1P2）。

1.4 低溫與常溫下HO品系與常規(guī)品系的組織樣品制備

將B161和N137的干凈種子在培養(yǎng)皿中發(fā)芽后至下胚軸長約0.5cm后，移栽至直徑為15cm且裝滿營養(yǎng)土的盆缽中，每品系6缽，每缽4株苗，置于光照培養(yǎng)箱（25℃ 12h光照/15℃12h黑暗，光照強(qiáng)度=2 000 lx）內(nèi)生長。于三葉期時(shí)將對(duì)應(yīng)品系盆缽分成2部分：一半繼續(xù)放置在原培養(yǎng)箱；另一半置于另一培養(yǎng)箱（12℃ 12h光照/6℃ 12h黑暗，光照強(qiáng)度=2 000 lx）內(nèi)培養(yǎng)。待7d后將盆缽取出并選取各培養(yǎng)箱內(nèi)生長一致的菜苗，迅速洗凈根系，用剪刀分離根（下胚軸以下部分）、莖（去掉最后一片葉連接點(diǎn)以上部分）、葉（包括去掉主葉脈后的整張葉片）和葉柄等組織，分別將兩品系不同單株的相同組織混合置于牛皮紙袋中編號(hào)，烘干備用。

1.5 油菜種子成熟及種子發(fā)芽過程的樣品制備

于大田油菜開花后選擇長勢(shì)均衡、花期一致的B161和N137植株，用棉線標(biāo)記主軸及倒一、倒二分枝同一天開放的花朵，每個(gè)材料標(biāo)記約10株，每株標(biāo)記約100朵花，一周后再標(biāo)記一次作為重復(fù)。由于早期的種子含水量很大，故而自角果齡15日開始每7天取樣一次，直至種子成熟。大田中角果置于冰盒中帶至實(shí)驗(yàn)室后，迅速將幼嫩種子從角果中小心剝出，每品系每個(gè)樣品至少選取100粒種子，及時(shí)烘干編號(hào)備用。

發(fā)芽試驗(yàn)按照糧油檢驗(yàn)發(fā)芽試驗(yàn)（GB/T 5520-2011）的方法進(jìn)行，選取B161和N137的飽滿種子自開始之日起每天于同一時(shí)間剝出發(fā)芽種子中的子葉，直至第5天成苗。取樣時(shí)迅速用鑷子剝?nèi)∽尤~部分，每品系每個(gè)樣品至少選取50個(gè)子葉組織，混合后立即烘干編號(hào)備用。

1.6 取樣及其脂肪酸含量測(cè)定

用于遺傳分析的6個(gè)世代群體種子，按照親本（P1、P2）、F1、BC1P1、BC1P2和F2分別取出粒數(shù)不等的種子，按照高建芹等[27]的半粒法測(cè)定種子脂肪酸含量。各個(gè)組織樣品按照國標(biāo)（GB/T17377-1998）的方法在安捷倫GC6910型氣相色譜儀上測(cè)定脂肪酸含量。由于根、莖、葉和葉脈組織的含油量低，因此，其干樣至少保證在0.5g以上。在加石油醚-乙醚混合液之前，樣品需要充分打樣磨碎。

1.7 數(shù)據(jù)分析、圖像繪制以及遺傳模型分析

采用Microsoft Excel計(jì)算最大值、最小值、平均值、變異系數(shù)及相關(guān)系數(shù)。采用Graphpad Prism7軟件進(jìn)行繪圖。根據(jù)作物數(shù)量性狀混合遺傳模型及主基因+多基因多世代聯(lián)合分析方法，采用章元明等[28]發(fā)布的植物數(shù)量性狀軟件包（the R software package of SEgregation analysis，SEA）對(duì)3個(gè)不同遺傳背景的6個(gè)世代分析群體的高油酸性狀進(jìn)行24個(gè)遺傳模型的極大似然分析，采用最小AIC值準(zhǔn)則篩選最適遺傳模型，用最小二乘法估計(jì)相應(yīng)的遺傳參數(shù)，并估計(jì)主基因和多基因效應(yīng)等遺傳參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 誘變?nèi)后w各世代油酸與亞麻酸的含量變化及HO種質(zhì)B161的獲得

采用輻射誘變后發(fā)現(xiàn)后續(xù)世代油酸和亞麻酸含量變異范圍明顯增加，篩選效果明顯。自誘變當(dāng)代到脂肪酸含量穩(wěn)定的7個(gè)世代，油酸和亞麻酸含量在定向選擇過程中均經(jīng)歷了由集中到分散然后又集中的變化趨勢(shì)（表1）。對(duì)2004年（M1代）套袋自交收的單株種子進(jìn)行脂肪酸分析發(fā)現(xiàn)，油酸含量變幅為68.75%—78.81%，亞麻酸含量變幅為3%—8%，表明誘變產(chǎn)生效果。經(jīng)過4個(gè)世代（M2—M5）對(duì)油酸進(jìn)行極端選擇后，油酸含量變幅為70.54%—86.95%，但平均值大幅升高。進(jìn)一步于M6代對(duì)極端單株進(jìn)行小孢子培養(yǎng)后獲得具有65個(gè)株系的DH系群體，根據(jù)脂肪酸測(cè)定結(jié)果篩選得到油酸含量≥85%且亞麻酸含量為3%—4%的多個(gè)株系。次年經(jīng)全生育期生長勢(shì)及農(nóng)藝性狀比較后獲得HO穩(wěn)定品系B161（C18:1為85.4%，C18:3為2.5%）。

表1 誘變?nèi)后w不同世代中C18:1及C18:3含量分布

2.2 HO種質(zhì)B161高油酸性狀的遺傳模式

2.2.1 遺傳群體中全脂肪酸組分含量的性狀變異 成功利用HO種質(zhì)B161與3個(gè)常規(guī)品系構(gòu)建了6個(gè)世代分離群體，其中，組合B161×N137的全脂肪酸含量情況如表2。正反交F1的油酸與亞麻酸含量值基本相當(dāng)，表明HO性狀不受細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)的影響。3個(gè)組合衍生的6個(gè)世代分離群體油酸含量呈連續(xù)性分布，符合數(shù)量性狀的特征。另外，油酸含量在3個(gè)群體中呈正態(tài)分布，表明該性狀在遺傳上受多基因控制。

2.2.2 菜籽油中各脂肪酸含量的相關(guān)性分析 對(duì)組合B161×N137的F2分離群體單株的脂肪酸含量進(jìn)行了相關(guān)性分析（表3），結(jié)果表明，在各十八碳脂肪酸中油酸含量除了與亞油酸和亞麻酸含量具有顯著負(fù)相關(guān)以外，還與棕櫚酸和二十碳烯酸顯著相關(guān)，而與硬脂酸含量相關(guān)較小。

2.2.3 HO種質(zhì)B161高油酸含量性狀的遺傳分析 利用SEA軟件對(duì)3個(gè)遺傳分析群體油酸含量數(shù)據(jù)分別計(jì)算所有的遺傳模型，獲得各個(gè)遺傳模型的最大似然值以及AIC值。根據(jù)最小AIC的遺傳模型優(yōu)選準(zhǔn)則，選取各遺傳群體中3個(gè)最小AIC值的遺傳模型作為備選（表4）。結(jié)果顯示，油酸含量大部分符合2對(duì)主效基因的遺傳模型，但不同遺傳群體估算的基因互作效應(yīng)略有差別。油酸含量的最佳遺傳模型為2MG-A，即2對(duì)加性主基因模型。

表2 組合B161×N137的6個(gè)世代遺傳群體脂肪酸含量統(tǒng)計(jì)

表3 組合B161×N137的F2群體中各脂肪酸含量的相關(guān)系數(shù)

*表示在0.05水平上差異顯著，**表示在0.01水平上差異顯著

* means the significance at the 0.05 level,** means the significance at the 0.01 level

對(duì)篩選得到的最佳遺傳模型估計(jì)了遺傳參數(shù)（表5）。結(jié)果顯示，控制高油酸含量的2對(duì)主效基因在3個(gè)組合遺傳群體中體現(xiàn)出的效應(yīng)值均較為接近，每個(gè)主效基因可提高油酸含量4—6個(gè)百分點(diǎn)。

2.3 HO種質(zhì)B161與常規(guī)品系苗期營養(yǎng)器官中油酸與亞麻酸含量的比較

不同溫度下HO品系與常規(guī)品系苗期組織中油酸與亞麻酸含量具有顯著變化（表6）。常規(guī)品系根、莖、葉及葉柄等組織中的油酸含量在常溫和低溫下沒有差異；但HO品系各組織在常溫下油酸含量均較常規(guī)品系高，低溫使各組織油酸含量顯著降低，以葉柄降幅最大。無論在低溫或常溫下常規(guī)品系各組織的亞麻酸含量均高于HO品系，低溫使HO品系各組織的亞麻酸含量顯著升高。

表4 3個(gè)組合的候選遺傳模型及其極大對(duì)數(shù)似然函數(shù)值和AIC值

MG：主基因；MX：主基因+多基因；A：加性；D：顯性；I：互作；E：相等

MG:Major gene; MX:Mixed major gene and polygene; A:Additive; D:Dominance; I:Interaction; E:Equal

2.4 HO種質(zhì)B161油酸與亞麻酸含量的變化特征

2.4.1 種子成熟過程中HO種質(zhì)B161與常規(guī)品系油酸與亞麻酸的積累HO品系B161與常規(guī)油菜品系N137在花后至種子成熟過程中油酸和亞麻酸含量的增減趨勢(shì)一致，但含量具有顯著差異。兩品系油酸含量在此段時(shí)期內(nèi)均表現(xiàn)為先迅速增長而后緩慢增長的趨勢(shì)。B161在花后第15天油酸含量即達(dá)到約50%，至第35天達(dá)到約80%后仍繼續(xù)緩慢增長；整個(gè)過程高于常規(guī)品系20個(gè)百分點(diǎn)。兩品系亞麻酸含量在此過程中均表現(xiàn)為持續(xù)降低趨勢(shì)，在花后15d時(shí)兩者差異不大，但在此后差距持續(xù)拉大（圖1）。

表5 最適遺傳模型下3個(gè)雜交組合中油酸含量的遺傳參數(shù)估計(jì)

/：無估計(jì)值 /:Means no value

表6 不同溫度下HO品系與常規(guī)品系苗期不同組織中油酸與亞麻酸的含量

不同小寫字母表示在 0.05 水平差異顯著 The different lowercase letters in the table indicate significance at 0.05 level

圖1 花后HO品系和常規(guī)品系種子中油酸與亞麻酸的含量變化

2.4.2 B161與常規(guī)品系子葉中油酸與亞麻酸在發(fā)芽進(jìn)程中的代謝HO品系與常規(guī)品系子葉中油酸與亞麻酸的相對(duì)含量在發(fā)芽過程中的變化（圖2）具有明顯差異。在種子萌發(fā)后5d之內(nèi)，兩品系子葉的油酸含量均呈持續(xù)下降趨勢(shì)，下降速率接近，兩品系差異值基本維持在20個(gè)百分點(diǎn)左右。相反的，在此進(jìn)程中，兩品系亞麻酸含量均呈持續(xù)上升趨勢(shì)，但兩品系差異經(jīng)歷了由小到大再變小的過程。

圖2 發(fā)芽后HO品系和常規(guī)品系子葉中油酸與亞麻酸的含量變化

3 討論

誘變是創(chuàng)建油菜遺傳變異材料的有效方法。目前，已報(bào)道的非轉(zhuǎn)基因油菜HO種質(zhì)均通過誘變獲得，但誘變方法以及誘變對(duì)象不盡相同。大部分HO材料都是通過化學(xué)誘變油菜種子獲得的[7,9,11-13,20-21,29]，也有通過誘變小孢子獲得[10]，而利用輻射處理油菜種子得到高油酸種質(zhì)的案例較少[14-15]。本研究亦是采用輻射誘變，但在輻射對(duì)象上與前人有所不同。本研究輻射對(duì)象是處于萌動(dòng)露白狀態(tài)的油菜種子。此種狀態(tài)下油菜種子中各項(xiàng)生理生化活動(dòng)剛剛啟動(dòng)，對(duì)外界環(huán)境極度敏感[30]。從理論上說輻射處理具有較高的誘變率。本研究中在早期世代（M2代）即發(fā)現(xiàn)了油酸含量顯著升高的株系，不但說明創(chuàng)建思路是可行的，而且也表明突變位點(diǎn)位于控制HO性狀的主效基因內(nèi)，同時(shí)這些主效基因可能位于相對(duì)容易誘變的染色體區(qū)域。此外，由于輻射誘變可能造成油菜染色體變異，若持續(xù)采用系譜法選擇可能多代自交仍不能純合穩(wěn)定，因此，本例中采用小孢子培養(yǎng)技術(shù)迅速固定高油酸性狀，效果很好，這與LORIN等[9]使用的方法一致。本研究獲得的HO品系油酸和亞麻酸含量均與現(xiàn)有報(bào)道中的極端值相當(dāng)，表明所集成的誘變及選擇方法在油菜上具有實(shí)用性，對(duì)其他的類似性狀可能也具有借鑒價(jià)值。

菜籽油中的油酸含量主要受遺傳控制，環(huán)境影響較小[21,31]。本研究也發(fā)現(xiàn)HO新種質(zhì)高油酸性狀的遺傳貢獻(xiàn)率高，與前人結(jié)果一致。在控制該性狀的基因數(shù)目上，研究結(jié)果有所不同。HU等[11]、官春云等[14]、、YANG等[23]利用QTL定位或基因克隆等方法發(fā)現(xiàn)高油酸性狀受一個(gè)主效基因位點(diǎn)控制。而SCHIERHOLT等[15]和劉列釗等[21]分別利用遺傳試驗(yàn)和分子標(biāo)記篩選表明高油酸性狀主要受2個(gè)主效位點(diǎn)控制。隨后WELLS等[29]利用EMS誘變獲得了一批油菜減飽和酶突變體，其不同位點(diǎn)突變對(duì)油酸含量的增量效應(yīng)不同。ZHAO等[32]還發(fā)現(xiàn)在A9染色體也有一個(gè)位點(diǎn)控制油酸含量。這表明油菜中油酸含量的控制位點(diǎn)較為豐富。本研究中的高油酸新種質(zhì)雖然也受2對(duì)基因控制，但其基因位點(diǎn)需要進(jìn)一步確認(rèn)。從育種實(shí)踐而言，本研究創(chuàng)建的新種質(zhì)高油酸性狀遺傳模式相對(duì)簡單，育種利用較為容易。自2010年開始將HO種質(zhì)的高油酸性狀轉(zhuǎn)育進(jìn)入蘿卜質(zhì)不育系統(tǒng)并進(jìn)行了雜交組合配置工作，品比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一些組合的全生育期表現(xiàn)和產(chǎn)量與對(duì)照品種相當(dāng)，表明本研究發(fā)現(xiàn)的高油酸種質(zhì)具有育種利用潛力（電子附表1）。

脂肪酸是植物細(xì)胞質(zhì)膜的主要組成成分，是細(xì)胞與環(huán)境互作的前哨，因此，脂肪酸的合成與代謝對(duì)油菜的非生物脅迫抗性至關(guān)重要[33-35]。油菜生育期長，無論是冬油菜還是春油菜在營養(yǎng)生長階段都會(huì)受到溫度影響。本研究發(fā)現(xiàn)，常溫下HO種質(zhì)營養(yǎng)器官以及種子中的油酸含量均高于常規(guī)品系，而亞麻酸含量則低于常規(guī)品系，表明（1）HO種質(zhì)中控制油酸的基因是組成型表達(dá)，可能是油菜中2個(gè)組成型表達(dá)的發(fā)生了突變。（2）油菜的脂肪酸合成途徑中油酸有2個(gè)去向，絕大部分進(jìn)入減飽和途徑生成亞油酸和亞麻酸，少部分進(jìn)入加碳途徑生成二十碳烯酸和芥酸[36]?；谟退崤c亞麻酸之間的強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)關(guān)系，亞麻酸降低是油酸升高的必然結(jié)果。也有可能是HO種質(zhì)中亞麻酸合成酶也產(chǎn)生突變，導(dǎo)致該酶活性降低，不能合成更多的亞麻酸。本研究還發(fā)現(xiàn)，低溫下HO種質(zhì)油酸含量降低和亞麻酸含量增加，但均低于常規(guī)品系，這表明（1）低溫能夠增加突變油酸控制基因的表達(dá)，提高油酸的轉(zhuǎn)化率，這與的特性符合[37]。（2）亞麻酸是高不飽和脂肪酸，易于氧化。其含量的增加，可能是油菜進(jìn)行呼吸作用時(shí)更偏好于將亞麻酸氧化從而為其自身提供足夠能量；也有可能是因?yàn)閬喡樗岷铣擅富钚缘淖兓隆Ａ硗?，發(fā)現(xiàn)HO種質(zhì)與常規(guī)品系在種子成熟過程和發(fā)芽過程中的亞麻酸含量并非持續(xù)保持平行差異，說明在HO種質(zhì)中除了油酸含量變化影響亞麻酸含量之外，亞麻酸本身的合成控制酶也在起作用。值得提出的是，低溫下常規(guī)品系較HO種質(zhì)能合成更多的高不飽和度脂肪酸，這意味著常規(guī)品系在低溫下細(xì)胞膜具有更好的流動(dòng)性，在表型上則可能具有更強(qiáng)的耐寒性。因此可以推斷，在較寒冷的油菜產(chǎn)區(qū)，HO品系可能耐寒性較常規(guī)品系差，需要關(guān)注。

4 結(jié)論

獲得雙低甘藍(lán)型油菜HO新種質(zhì)B161，其高油酸性狀受2個(gè)主效基因控制。B161中控制高油酸性狀的基因?yàn)榻M成型表達(dá)，低溫對(duì)其有誘導(dǎo)增強(qiáng)作用。高油酸種質(zhì)B161具有育種利用潛力。

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Creation of High-Oleic (HO) Canola Germplasm and the Genetic and Physiological Analysis onHOTrait

LONG WeiHua,PU HuiMing,GAO JianQin,HU MaoLong,ZHANG JieFu,CHEN Song

Institute of the Industrial Crops,Jiangsu Academy of Agriculture Sciences/Key Lab of Cotton and Rapeseed (Nanjing) of Ministry of Agriculture,Nanjing 210014

【】 This study is to create the new high oleic (HO) canola germplasm,to explore its genetic mode and the physiological characters of theHOtrait,which will lay a foundation for breedingHOcanola varieties.【】 The primary mutation population with was obtained by radiation treatment of germinating canola seeds.The newHOgermplasm was screened by extreme selection method combined with microspore culture technology in subsequent generations.The genetic populations of six generations (P1,P2,F1,BC1P1,BC1P2and F2) were constructed by crossing theHOGermplasm with three conventional canola lines with different genetic background.After the fatty acid content of each population was determined,the genetic analysis of high oleic acid content in the genetic population was analyzed by the mixed major-gene plus polygene inheritance model.The oleic acid content in cotyledons during seed germination,vegetative organs at seedling stage in different temperature regimes and seeds during silique ripening process of theHOgermplasm were detected to explore their change patterns and physiological effects.【】 The primary mutation population with significantly increased oleic acid content was obtained by radiation treatment,and then the high generation population with 20-percent-increased oleic acid content was obtained by using extreme selection method in subsequent generations and the double haploid population was obtained by microspore culture.Finally,a newHOgermplasm B161 (C18:1=85%,C18:3=3%) was successfully screened according to the quality traits.Three genetic populations with different genetic background were obtained by crossing B161 asHOparent with three other conventional lines.The correlation analysis of fatty acid contents showed that there was a significant negative correlation between oleic acid content,linoleic acid content and linolenic acid content.The results of genetic analysis showed that the high oleic acid content was controlled by two major genes with additive effect,and their effect values were close.Physiological analysis showed that the contents of oleic acid in vegetative organs (root,stem,leaf and petiole) ofHOline were significantly higher than those of the conventional strain,and the linolenic acid contents ofHOline were significantly lower than those of the conventional line.The contents of oleic acid in vegetative organs ofHOline decreased at low temperature,but they were still higher than those of the conventional line.The linolenic acid contents in vegetative organs of the two lines increased significantly at low temperature,but the linolenic acid content ofHOline was still lower than that of the conventional line.During the process of seed ripening and seed germination,the oleic acid content ofHOline was significantly higher than that of conventional line,while the linolenic acid content was significantly lower than that of conventional line.【】The newHOgermplasm was successfully created and the genetic mode and physiological characters were confirmed.ThisHOgermplasm has the potential value in breeding.

L.; radiation mutagenesis; germplasm creation; high oleic trait; genetic analysis; response to low temperature

附表1 高油酸低亞麻酸雜交組合產(chǎn)量和菜籽品質(zhì)

Supplemental table 1 The yields and the seed-oil quality of the HOLL hybrid combinations

*表示在0.05水平上差異顯著 * Significance at the 0.05 level

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.003

2020-07-04；

2020-09-01

國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016YFD0101300）、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心（JCIC-MCP）

龍衛(wèi)華，Tel：025-84390368；E-mail：long-weihua@163.com。通信作者浦惠明，Tel：025-84390370；E-mail：puhuiming@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）