小麥籽粒黃色素含量檢測方法的改良與應用

翟勝男，劉愛峰，李法計，劉成，郭軍，韓冉，訾妍，汪曉璐，呂瑩瑩，劉建軍

小麥籽粒黃色素含量檢測方法的改良與應用

翟勝男，劉愛峰，李法計，劉成，郭軍，韓冉，訾妍，汪曉璐，呂瑩瑩，劉建軍

山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，濟南 250100

【】小麥籽粒黃色素含量是影響面制品顏色和營養(yǎng)品質(zhì)的重要因素，為快速、準確、簡便地檢測小麥籽粒黃色素含量，對傳統(tǒng)小麥籽粒黃色素測定方法AACC 14-50進行改良，為面制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良提供技術支撐。將酶標儀應用于小麥籽粒黃色素含量測定，對傳統(tǒng)AACC 14-50法進行改良，分析改良方法的準確性和穩(wěn)定性，探討不同提取時間和保存時間對面粉黃色素含量的影響，利用新改良方法測定283份國內(nèi)外小麥品種籽粒黃色素含量，進一步驗證改良方法的有效性，發(fā)掘面制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)異的種質(zhì)資源。改良方法與傳統(tǒng)AACC 14-50法所測黃色素含量呈極顯著正相關，相關系數(shù)達0.994（＜0.001），方差分析顯示，2種方法所測黃色素含量在品種間差異均極顯著（＜0.01）。應用改良方法對144份小麥品種籽粒黃色素含量進行重復測定，3次重復兩兩間的相關系數(shù)分別為0.997、0.998和0.998。藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366面粉黃色素含量在提取時間為30 min時達到最大值，分別為0.93、1.24和1.53 μg·g-1，且提取時間為30—120 min時，黃色素含量保持在穩(wěn)定水平（0.94—0.97、1.30—1.33和1.59—1.62 μg·g-1）。在室溫保存0—20 d的藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366的面粉，其黃色素含量沒有顯著變化（0.93—0.97、1.29—1.33和1.60—1.64 μg·g-1；＞0.05）。283份國內(nèi)外小麥品種籽粒黃色素含量變異范圍廣，不同環(huán)境間相關系數(shù)為0.73—0.98。其中，黃淮麥區(qū)小麥品種黃色素含量平均值為1.15 μg·g-1，變異范圍為0.51—2.42 μg·g-1；北部冬麥區(qū)平均值為1.57 μg·g-1，變異范圍為0.90—2.52 μg·g-1；長江中下游麥區(qū)平均值為1.07 μg·g-1，變異范圍為0.56—2.54 μg·g-1；國外品種平均值為1.61 μg·g-1，變異范圍為0.94—2.48 μg·g-1。篩選到24份黃色素含量較低和26份黃色素含量較高的品種，可作為親本材料用于面制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良。與傳統(tǒng)方法相比，改良方法顯著降低了工作量，縮短檢測時間，效率提高12—15倍，且樣本、試劑用量僅為原來的1/16，大大節(jié)約了成本。建立了一個準確穩(wěn)定、經(jīng)濟高效、操作簡便的小麥籽粒黃色素含量檢測方法，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)AACC 14-50法用于大規(guī)模樣本黃色素含量測定。

小麥；面制品顏色；營養(yǎng)品質(zhì)；酶標儀；遺傳改良

0 引言

【研究意義】小麥籽粒黃色素含量對面粉及其制品表觀色澤和營養(yǎng)品質(zhì)具有重要影響，對其進行遺傳改良已成為小麥品質(zhì)改良的重要內(nèi)容。快速、準確、簡便地檢測小麥籽粒黃色素含量，是面粉及其制品色澤和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良的基礎?！厩叭搜芯窟M展】黃色素是小麥籽粒中最主要的天然色素，是面粉及其制品顏色形成的主要原因。研究表明，小麥籽粒黃色素含量與面粉、面團黃度的相關系數(shù)高達0.8—0.9，與面包和面條顏色的相關系數(shù)分別為0.83和0.76[1-4]。類胡蘿卜素是構成黃色素的主要成分，兩者相關系數(shù)達0.8[5-9]。類胡蘿卜素，尤其是β-胡蘿卜素，是維生素A原，具有抗氧化、抗癌、降低心血管疾病、預防眼睛老年性黃斑病變、延緩衰老及提高免疫力等重要生理保健功能[10-15]。中國傳統(tǒng)主食饅頭、面條、包子和水餃等蒸煮類食品對面粉的白度要求比較高，細膩潔白的面粉及其制品備受消費者青睞[16-20]。中國主栽小麥品種的面粉平均白度較低，不少品種因不具備優(yōu)良的顏色性狀而不能滿足加工需求，限制其示范推廣[21-24]。而日本和東南亞等國家喜愛的黃堿面條要求亮黃色，提高籽粒黃色素含量已成為這些國家的重要育種目標[25]。此外，隨著人們營養(yǎng)和保健意識的提高，亮黃色的面粉和面制品也越來越受到重視。因此，根據(jù)不同的市場和消費者需求，對面粉及其制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)進行改良是小麥品質(zhì)改良的重要內(nèi)容。如何快速、準確、簡便地檢測小麥籽粒黃色素含量，是育種家們急需解決的問題。目前，小麥籽粒黃色素含量測定方法廣泛采用美國谷物化學協(xié)會（American Association for Cereal Chemistry，AACC）標準方法AACC 14-50[26]?！颈狙芯壳腥朦c】傳統(tǒng)的AACC 14-50方法以分光光度法測定黃色素含量，檢測通量低，只能對樣本進行逐個檢測，需要不斷更換比色皿，操作繁瑣，工作量大，測定時間長，檢測效率低，所需樣本試劑量大，不利于面制品顏色和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良育種中材料大規(guī)模檢測。酶標儀誕生于20世紀50年代，與分光光度計工作原理基本一致，同樣具有較高的檢測精度，而且酶標儀操作更加簡便，用樣量少，批量操作，適用于大規(guī)模樣本測定，已被廣泛應用于三角褐指藻油脂含量、食用菌多糖含量、大豆總皂甙含量等檢測[27-30]?！緮M解決的關鍵問題】本研究將酶標儀應用于小麥籽粒黃色素含量測定，對傳統(tǒng)檢測方法AACC 14-50進行改良，分析不同提取時間和保存時間對面粉黃色素含量的影響，并利用改良方法對283份國內(nèi)外小麥品種進行黃色素含量檢測，進一步驗證改良方法的有效性，篩選籽粒黃色素含量較低和較高品種，為面制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)前人研究，選用12個籽粒黃色素含量變異范圍較大的小麥品種，即煙農(nóng)15、汶農(nóng)14、陜512、洛旱2號、觀35、碧螞1號、冀師02-1、新麥9408、陜優(yōu)225、邯6172、魯麥6號和豫麥18，分別采用傳統(tǒng)AACC 14-50法[26]與改良方法測定黃色素含量，用于驗證改良方法的準確性。應用藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366，分析不同提取時間和保存時間對面粉黃色素含量的影響。選用144份中國黃淮麥區(qū)小麥品種，用于分析改良方法的重演性和穩(wěn)定性。選用283份具有代表性的國內(nèi)外小麥品種，進一步驗證改良方法的有效性。根據(jù)生育期和春冬性不同，于2012—2013年和2013—2014年進行分區(qū)種植。其中，144份中國黃淮麥區(qū)小麥品種種植于河南安陽和安徽濉溪；42份北部冬麥區(qū)品種和48份國外品種種植于北京和河北石家莊；49份長江中下游麥區(qū)品種種植于安徽濉溪和四川成都。

所有供試材料采用隨機區(qū)組設計，3次重復，4行區(qū)，行長2 m，行距25 cm，按常規(guī)方法進行田間種植管理。對2次重復的籽粒進行磨粉，用于黃色素含量測定。

1.2 制粉

應用單籽粒谷物特性測試儀SKCS 4100（Perten，Sweden）測定籽粒硬度。利用近紅外分析儀Foss-Tecator 1241（Foss，H?g?nas，Sweden）測定籽粒蛋白質(zhì)含量和含水量。根據(jù)硬度等級計算潤麥所需加水量：軟質(zhì)麥（硬度指數(shù)＜40）為14%、混合麥（40＜硬度指數(shù)＜60）為15%、硬質(zhì)麥（＞60）為16%。室溫潤麥16—18 h，應用Junior試驗磨（Brabender，Germany）制粉，出粉率約為60%。面粉4℃保存，用于黃色素含量檢測。

1.3 黃色素含量測定

2013—2014年于中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所何中虎研究員實驗室，分別利用傳統(tǒng)AACC 14-50法[26]與改良方法測定12個籽粒黃色素含量變異范圍較大的小麥品種黃色素含量。應用改良方法測定283份國內(nèi)外小麥品種籽粒黃色素含量。

傳統(tǒng)AACC 14-50法[26]：（1）稱取8.0 g面粉放入125 mL玻璃瓶中；（2）加入40 mL水飽和正丁醇提取液（體積比5﹕1），振蕩1 min，靜置30 min；（3）再次搖勻，應用Whatman no.1濾紙過濾；（4）以水飽和正丁醇為對照，利用分光光度計測定436.5 nm處反應液吸光值A，計算黃色素含量。

改良方法：（1）稱取0.5 g面粉放入10 mL離心管中；（2）加入2.5 mL水飽和正丁醇提取液（體積比5﹕1），旋渦振蕩、混勻；（3）將離心管放入PE離心管盒內(nèi)，并固定在沉降值測定儀（Brabender，Germany）上，上下振蕩30 min，以利于黃色素的充分提??；（4）應用Eppendorf離心機（Centrifuge 5804 R，Germany），5 000 r/min離心10 min；（5）吸取200 μL上清液加入96孔酶標板（Costar 3590，USA），以水飽和正丁醇溶液為對照，利用酶標儀SpectraMax Plus 384（Molecular Devices，LLC，USA）測定436.5 nm處上清液吸光值A。

黃色素含量=A×30.1，單位為μg·g?1。每個品種2次生物學重復，每個重復樣品3次技術重復，均值作為樣品黃色素含量的表型值。

1.4 不同提取時間和保存時間對面粉黃色素含量的影響

利用水飽和正丁醇分別對藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366面粉進行不同時間（15、30、45、60、75、90、105和120 min）的提取，分析不同提取時間對面粉黃色素含量的影響。

利用改良方法，分別對室溫條件下不同保存時間（0、5、10、15和20 d）的藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366面粉進行黃色素含量的測定，分析不同保存時間對面粉黃色素含量的影響。

1.5 統(tǒng)計分析

利用SAS V9.2（http://www.sas.com）軟件，進行黃色素含量基本統(tǒng)計量分析，利用PROC CORR程序進行相關性分析，應用PROC GLM程序進行方差分析。利用Microsoft Excel軟件進行圖表繪制。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)AACC 14-50法與改良方法所測黃色素含量比較

選用12個代表性小麥品種，分別采用傳統(tǒng)AACC 14-50法與改良方法測定籽粒黃色素含量，每個樣本重復3次，平均值作為樣本黃色素含量表型值。對2種方法所測黃色素含量進行比較（圖1），傳統(tǒng)AACC 14-50法所測黃色素含量較高，平均值為3.58 μg·g-1，變異范圍為2.51—5.22 μg·g-1，相對標準偏差為0.09%—11.13%，變異系數(shù)為24.3%。改良方法所測黃色素含量值較低，平均值為1.21 μg·g-1，變異范圍為0.76—1.79 μg·g-1，相對標準偏差為0.01%—6.47%，變異系數(shù)為27.6%。2種方法所測黃色素含量呈極顯著正相關（=0.994，＜0.001）。

2.2 傳統(tǒng)AACC 14-50法與改良方法所測黃色素含量方差分析

對傳統(tǒng)AACC 14-50法與改良方法所測12個小麥品種的黃色素含量進行方差分析，由表1可知，應用2種方法所測得的12個小麥品種籽粒黃色素含量在品種水平差異均極顯著。

圖1 2種方法所測黃色素含量的相關性

2.3 傳統(tǒng)AACC 14-50法與改良方法的差異性比較

如表2所示，改良方法面粉和水飽和正丁醇所需量僅為傳統(tǒng)AACC 14-50法的1/16，大大節(jié)約檢測成本。該方法應用96孔酶標板和酶標儀同時可檢測多個樣本的黃色素含量，顯著提高檢測效率。

表1 2種方法測定黃色素含量的方差分析

**表示在0.001水平差異顯著** Significant at=0.001

表2 2種黃色素含量測定方法比較

2.4 改良方法測定黃色素含量穩(wěn)定性分析

為了分析改良方法測定黃色素含量的穩(wěn)定性和可靠性，應用此方法對144份中國黃淮麥區(qū)代表性品種黃色素含量進行重復測定（圖2），3次重復兩兩間黃色素含量相關系數(shù)分別為0.997、0.998和0.998（＜0.001），表明改良方法測定黃色素含量重復性好，穩(wěn)定性高。

圖2 改良方法測定黃色素含量重復間的相關性

2.5 不同提取時間對黃色素含量的影響

利用水飽和正丁醇對藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366面粉分別進行15、30、45、60、75、90、105和120 min的提取，黃色素含量測定結果如圖3所示。振蕩提取15 min時，黃色素含量較低，藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366的黃色素含量分別為0.93、1.24和1.53 μg·g-1。提取時間為30 min時，黃色素含量達到最大值，藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366的黃色素含量分別為0.97、1.33和1.62 μg·g-1。提取時間為30—120 min時，黃色素含量保持在穩(wěn)定水平（0.94—0.97、1.30—1.33和1.59—1.62 μg·g-1）。

2.6 保存時間對黃色素含量的影響

利用改良方法，對室溫放置0—20 d的藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366面粉進行黃色素含量測定（圖4），發(fā)現(xiàn)其黃色素含量差異不顯著（0.93—0.97、1.29—1.33和1.60—1.64 μg·g-1；＞0.05）。

圖3 提取時間對面粉黃色素含量的影響

圖4 保存時間對面粉黃色素含量的影響

2.7 283份國內(nèi)外小麥品種黃色素含量分析

由表3可知，283份國內(nèi)外小麥品種籽粒黃色素含量變異范圍廣，遺傳基礎豐富。其中，黃淮麥區(qū)小麥品種黃色素含量平均值為1.15 μg·g-1，變異范圍為0.51—2.42 μg·g-1；北部冬麥區(qū)平均值為1.57 μg·g-1，變異范圍為0.90—2.52 μg·g-1；長江中下游麥區(qū)平均值為1.07 μg·g-1，變異范圍為0.56—2.54 μg·g-1；國外品種平均值為1.61 μg·g-1，變異范圍為0.94—2.48 μg·g-1。

同一品種不同環(huán)境間黃色素含量的相關系數(shù)為0.73—0.98。比較各個品種在不同環(huán)境下黃色素含量，篩選出環(huán)境間穩(wěn)定存在的黃色素含量較低的品種24個和黃色素含量較高的品種26個（表4），可作為面制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良的優(yōu)異資源。

表3 283份國內(nèi)外小麥品種黃色素含量基本信息

AY：安陽；SX：濉溪；SJZ：石家莊；BJ：北京；CD：成都 AY: Anyang; SX: Suixi; SJZ: Shijiazhuang; BJ: Beijing; CD: Chengdu

表4 籽粒黃色素含量較低和較高小麥品種

3 討論

3.1 改良方法測定黃色素含量的準確穩(wěn)定性和高效經(jīng)濟性分析

小麥是中國主要的糧食作物，隨著人們生活水平提高，對小麥品質(zhì)提出更高的要求。面粉中黃色素含量直接影響面制品的色澤和營養(yǎng)品質(zhì)，已成為小麥品質(zhì)改良的重要研究內(nèi)容[31-33]。缺乏準確、穩(wěn)定、高效測定小麥籽粒黃色素含量的方法，嚴重制約了面制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良。

本研究對傳統(tǒng)AACC 14-50法進行改良，發(fā)現(xiàn)2種方法測定所得黃色素含量呈極顯著正相關，相關系數(shù)達0.994，表明改良方法與傳統(tǒng)方法在測定小麥籽粒黃色素含量準確度上無顯著差異。且改良方法所測黃色素含量的相對標準偏差小于傳統(tǒng)AACC 14-50法（0.01%—6.47% vs 0.09%—11.13%），表明改良方法測定黃色素含量的精度更高。應用改良方法重復測定144份小麥品種黃色素含量，3次重復兩兩間的相關系數(shù)分別為0.997、0.998和0.998，表明該方法重復性好，穩(wěn)定性高。此外，改良方法應用96孔酶標板和酶標儀測定黃色素含量，操作更加簡便，無需更換清洗比色皿，大大減少工作量，同時可檢測多個樣本，縮短檢測時間，避免因測定時間過長而導致的誤差，適用于大樣本測定分析，檢測效率提高12—15倍。同時，樣本試劑用量小，僅為傳統(tǒng)AACC 14-50法用量的1/16，大大降低試驗成本。因此，本研究改良方法具有操作簡便、準確可靠、精密度高、重復性好、經(jīng)濟高效等優(yōu)點，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法用于小麥籽粒黃色素含量高通量檢測，為小麥品種資源篩選、面制品顏色和營養(yǎng)品質(zhì)改良提供技術支撐。

3.2 不同提取時間和保存時間對樣本黃色素含量影響

應用水飽和正丁醇，對藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366面粉振蕩提取15 min時，黃色素含量較低，表明提取時間過短黃色素提取不充分。當提取時間為30 min時，黃色素含量達到最大值，且提取時間在30—120 min時，黃色素含量保持在穩(wěn)定水平。因此，提取時間為30 min時，能較快、較好地反映面粉黃色素含量真實水平。

室溫存放0—20 d的藁優(yōu)5218、冀師02-2和鄭麥366面粉，其黃色素含量差異不顯著，表明面粉黃色素相對較穩(wěn)定，為大批量樣本檢測提供可能。

3.3 面粉及其制品色澤和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良

小麥籽粒黃色素含量對面條和饅頭等面制品的表觀色澤和營養(yǎng)品質(zhì)具有重要影響，已成為小麥品質(zhì)改良的重要內(nèi)容[31-33]。缺乏優(yōu)異種質(zhì)資源成為小麥面粉及其制品品質(zhì)改良的“瓶頸”，嚴重影響中國小麥品種面制品顏色和營養(yǎng)品質(zhì)的遺傳改良。

本研究對283份國內(nèi)外小麥品種籽粒黃色素含量進行檢測，結果表明，黃色素含量變異范圍廣，遺傳基礎豐富，環(huán)境間較穩(wěn)定。共篩選出不同環(huán)境下黃色素含量均較低品種24個和黃色素含量均較高品種26個，可作為面制品顏色性狀和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良的優(yōu)異資源。此外，在面粉及其制品顏色和營養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良工作中，還應利用本研究改良方法對高代育種材料進行黃色素含量測定和篩選，以提高育種選擇的精準度。

4 結論

建立了一個準確穩(wěn)定、經(jīng)濟高效、操作簡便的小麥籽粒黃色素含量檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比，改良方法顯著降低了工作量，縮短檢測時間，效率提高12—15倍，且樣本、試劑用量僅為原來的1/16，大大節(jié)約成本，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)AACC 14-50法用于大規(guī)模樣本黃色素含量測定。利用新改良方法對283份國內(nèi)外小麥品種黃色素含量進行檢測，篩選出不同環(huán)境下穩(wěn)定存在的黃色素含量較低品種24個和黃色素含量較高品種26個。

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Improvement and Application of the method for determining Yellow Pigment Content in Wheat Grain

ZHAI ShengNan, LIU AiFeng, LI FaJi, LIU Cheng, GUO Jun, HAN Ran, ZI Yan, WANG XiaoLu, Lü YingYing, LIU JianJun

Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100

【】The yellow pigment content (YPC) in wheat grain is an important factor affecting the color and nutritional quality of flour end-use products. To quickly, accurately and simply detect YPC in wheat grain, the traditional method for YPC determination, AACC 14-50, was improved, providing a technical support for genetic improvement of the color and nutritional quality of flour end-use products.【】In this study, improvements have been made to the AACC 14-50 method using a Multiskan Spectrum microplate reader. The accuracy and stability of the modified method were analyzed, and the influence of extraction time and preservation time on flour YPC was dissected. The YPC of 283 domestic and foreign wheat varieties were determined by the improved method to further verify its effectiveness and explore excellent resources for genetic improvement of the color and nutritional quality of flour end-use products. 【】The results showed that YPC determined by the modified method was significantly and positively correlated with those by the traditional AACC 14-50 method, with a correlation coefficient of 0.994 (<0.001),and analysis of variance showed that YPC measured by the two methods was significant among varieties. The YPC of 144 wheat varieties were measured repeatedly using the modified method, and the correlation coefficients of YPC among three replicates were 0.997, 0.998 and 0.998, respectively. The flour YPC of Gaoyou 5218, Jishi 02-2 and Zhengmai 366 reached the maximum value (0.93, 1.24and 1.53 μg·g-1) at the extraction time of 30 min, and remained stable during 30-120 min (0.94-0.97 μg·g-1, 1.30-1.33 μg·g-1and 1.59-1.62 μg·g-1). No significant changes were observed in the flour YPC of Gaoyou 5218, Jishi 02-2 and Zhengmai 366 stored at room temperature for 0-20 days (0.93-0.97 μg·g-1, 1.29-1.33 μg·g-1and 1.60-1.64 μg·g-1;>0.05). A wide range of YPC variation was identified in 283 domestic and foreign wheat varieties, with correlation coefficients ranging from 0.73 to 0.98 among different environments. Briefly, the mean YPC of varieties in the Huang-Huai wheat region was 1.15 μg·g-1, ranging between 0.51-2.42μg·g-1. The average value of YPC in varieties from the Northern winter wheat region was 1.57 μg·g-1, ranging from 0.90 to 2.52 μg·g-1. The average value of YPC in the Middle-Lower reaches of the Yangtze River wheat region was 1.07 μg·g-1, and the variation ranged from 0.56 to 2.54 μg·g-1. The average YPC of foreign varieties was 1.61 μg·g-1, ranging from 0.94to 2.48 μg·g-1. Twenty-four varieties with lower YPC and 26 with higher YPC were identified, which can be used as parents in wheat breeding programs to improve the color and nutritional quality of flour end-use products. Compared with the traditional AACC 14-50 method, the modified one reduces the workload, decreases the detection time, and increases the detection efficiency by about 12-15 times, and the consumption of samples and reagents is only 1/16 of those in the traditional method, which greatly reduces the cost. 【】The modified method for determining YPC in wheat grain established in this study is accurate, reliable, economical, efficient and simple, which can replace the traditional AACC 14-50 method for a large-scale determination of YPC.

; color of flour end-used products; nutritional quality; multiskan spectrum microplate reader; genetic improvement

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.001

2020-04-27；

2020-07-06

國家自然科學基金（31701420）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程（2019LGC001）、山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2018E01）、山東省重大科技創(chuàng)新工程項目（2018YFJH0602）

翟勝男，E-mail：zsn19870322@163.com。通信作者劉建軍，E-mail：ljjsaas@163.com

（責任編輯 李莉）