陸地棉鹽脅迫應(yīng)答基因GhPEAMT1的克隆及功能分析

王娜，趙資博，高瓊，何守樸，馬晨輝，彭振,，杜雄明,

陸地棉鹽脅迫應(yīng)答基因的克隆及功能分析

王娜1，趙資博2，高瓊1，何守樸1，馬晨輝1，彭振1,2，杜雄明1,2

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000；2鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州基地，鄭州 450001

【】磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（phosphoethanolamine N-methyltransferse，PEAMT）是植物磷酸膽堿合成的關(guān)鍵酶，而磷酸膽堿是可以增強(qiáng)植物抗性的甘氨酸甜菜堿合成底物膽堿的前體。通過對陸地棉磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（）的克隆、表達(dá)模式分析，以及功能驗(yàn)證，探究在陸地棉響應(yīng)鹽脅迫中的生物學(xué)功能，為棉花耐鹽品種的選育提供基因資源。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析，最終確定為耐鹽候選基因；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增目的基因；通過生物信息學(xué)分析基因結(jié)構(gòu)特征、預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量以及進(jìn)化關(guān)系；利用熒光定量PCR（qRT-PCR）分析耐鹽棉花品種早熟長絨7號和感鹽棉花品種南丹巴地大花在NaCl脅迫后不同時間點(diǎn)不同組織的表達(dá)特征；構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，進(jìn)行煙草的瞬時轉(zhuǎn)化，確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置；構(gòu)建基因超表達(dá)載體，通過花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在鹽脅迫下的萌發(fā)率和轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度；利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)（virus induced gene silencing，VIGS）對早熟長絨7號棉花品種進(jìn)行目的基因沉默，提取棉花葉片的RNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量用以檢測基因沉默效率，隨后用40 g·L-1的NaCl溶液的處理對照棉花植株（CK）、注射TRV2:00的棉花植株、和沉默成功的棉花植株，測定棉花葉片過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）的活性。克隆獲得的2個同源基因和，2個基因的CDS全長分別為1 488和1 485 bp；構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，與海島棉同源基因的親緣關(guān)系最近，而與其他物種相比，與可可同源性最高；鹽脅迫條件下，和在耐鹽品種早熟長絨7號葉片和根中的表達(dá)量顯著高于感鹽品種南丹巴地大花。亞細(xì)胞定位顯示該基因位于細(xì)胞質(zhì)中；超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥后，在100和150 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌發(fā)率顯著高于野生型擬南芥。在50和100 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥的主根長極顯著高于野生型擬南芥的主根長；用40 g·L-1的NaCl溶液處理24 h后，和沉默成功的棉花植株葉片比CK和注射TRV2:00的棉花植株的棉花葉片萎蔫嚴(yán)重，鹽脅迫后，與注射空載棉花植株相比，注射TRV2::GhPEAMT1A棉花植株過氧化氫酶（CAT）活性降低、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性降低?？梢栽鰪?qiáng)擬南芥對鹽脅迫的耐性，能夠響應(yīng)鹽脅迫并起正向調(diào)控作用。

陸地棉；鹽脅迫；；基因克??；基因沉默

0 引言

【研究意義】棉花作為世界上最重要的天然纖維作物和最重要的經(jīng)濟(jì)作物，既是紡織工業(yè)的主要原料，也是國防、醫(yī)藥、化工等工業(yè)部門的原料[1-2]。土壤鹽漬化是全球面臨的重大問題，由于人類的活動，農(nóng)作物的生長受到了土壤鹽漬條件的限制，嚴(yán)重降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量，非生物脅迫每年造成數(shù)億美元的損失，嚴(yán)重地威脅著農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展[3-5]。棉花是中度耐鹽作物，它的鹽容忍閾值為7.7 ds·S-1[6-7]。雖然棉花是耐鹽作物，但是鹽堿地高濃度的鹽分依然制約著棉花的產(chǎn)量[8]。因此，解析植物鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制可有助于提高作物的耐鹽性[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉花滲透調(diào)節(jié)鹽脅迫條件下，外界滲透勢降低容易造成根系細(xì)胞脫水，失去膨壓，進(jìn)而葉片萎蔫影響棉花的生理功能。因此，棉花的耐鹽機(jī)理之一，是在鹽脅迫條件下能對滲透脅迫進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]。棉花滲透調(diào)節(jié)有2種方式：一種方式是吸收大量的無機(jī)鹽離子積累到液泡中，提高濃度，降低水勢，使其能在較高的滲透條件下吸水，保持膨壓，正常生長，但這種耐脅迫能力有限，畢竟Na+在胞質(zhì)積累過度會造成離子毒害；另一種方式主要依靠棉花體內(nèi)合成一些小分子有機(jī)物質(zhì)如脯氨酸、甜菜堿、甘油、甘露醇、海藻糖等來提高細(xì)胞的滲透壓，降低水勢。防止細(xì)胞脫水和保持細(xì)胞各種酶在高鹽環(huán)境下的功能[9]。目前，已知的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中，甜菜堿是最重要的一種。甜菜堿是一種水溶性生物堿，是甘氨酸甜菜堿（glycinebetaine，GB）的簡稱，廣泛存在于植物中，它的積累可以增強(qiáng)植物的抗性[10-11]。此外甜菜堿合成后幾乎不再被進(jìn)一步代謝，屬于永久性或半永久性滲透調(diào)節(jié)劑，因此，甜菜堿被認(rèn)為是最有希望的滲透保護(hù)劑，在植物抗鹽、耐旱研究中已越來越受到重視。陳少良等[12]研究發(fā)現(xiàn)，生長于中國西北鹽堿干旱地區(qū)的胡楊，在100 mmol·L-1NaCl處理下葉中甜菜堿濃度增加243倍，根中增加9倍。在高等植物中，合成甘氨酸甜菜堿（GB）的底物是膽堿（choline，Cho），磷酸膽堿（phosphocholine，P-Cho）在磷酸膽堿磷酸酶的水解作用下可生成膽堿（Cho）和磷脂酸（phos- phatidic acid，PA）[13]。磷酸膽堿（P-Cho）是由磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（phosphoethanolamine N-methyltransferse，PEAMT）通過連續(xù)3次甲基化生成，PEAMT的連續(xù)3次的催化被認(rèn)為是磷酸膽堿（P-Cho）合成中的限速步驟[14]。研究發(fā)現(xiàn)在高等植物中膽堿（Cho）的合成速度受到嚴(yán)格控制，而磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶在甜菜堿的底物膽堿的合成中起到重要作用[15-16]，因此，PEAMT在植物的耐鹽脅迫調(diào)控中具有重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，研究表明磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PEAMT）促進(jìn)GlyBet的合成，有助于提高植物抗鹽的能力。然而目前棉花中PEAMT基因的研究較少?；赑ENG等[17]發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)無論在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均表達(dá)量較高且在耐鹽性不同材料差異顯著。因此，研究的功能，進(jìn)一步解析它在棉花中的耐鹽機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過克隆磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（和）cDNA全長，并對核酸序列和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以及亞細(xì)胞定位載體、基因超表達(dá)載體和基因沉默載體的構(gòu)建，進(jìn)而對其生物學(xué)功能進(jìn)行驗(yàn)證，確定的功能，為解析在棉花鹽脅迫應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，同時也可為棉花耐鹽品種的選育提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為陸地棉品種早熟長絨7號（耐鹽）和南丹巴地大花（感鹽）。這些材料的種子均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國家棉花種質(zhì)資源中期庫提供，并經(jīng)過多代自交，且性狀穩(wěn)定。擬南芥哥倫比亞野生型（Col-0）和本氏煙草由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)資源課題組提供。

1.2 總RNA的提取和cDNA的制備

選取陸地棉耐鹽品種早熟長絨7號和感鹽品種南丹巴地大花。通過霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)，在苗期三葉一心期用200 mmol·L-1NaCl溶液處理，分別在處理前（0 h）和處理后0.5、4、12、24和72 h取棉花的葉片和根，3個生長一致的棉花植株混合取樣，-80℃保存?zhèn)溆?。采用天根生化科技（北京）有限公司的多酚多糖植物總RNA提取試劑盒（NO.DP441），提取經(jīng)過處理后的根和葉中的RNA。用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect real time）試劑盒（NO.RR047A），將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 GhPEAMT1的克隆

根據(jù)（Gh_A03G080）和（Gh_D02G1225）的基因序列，利用primer premier 5軟件設(shè)計特異引物（表1）。利用TOYOBO的KOD-Plus-Neo高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到基因片段。純化后，連接到Blunt-zero載體上，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)中。篩選陽性單克隆，送深圳華大基因科技有限公司測序，獲得正確的和片段。吸取測序正確的菌液20 μl加入含有20 mL LB（Kan+）液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，用北京全式金生物技術(shù)有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.4 生物信息學(xué)分析

用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）分析GhPEAMT1氨基酸的理化性質(zhì)；用CDD（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；用Signal（http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的分析；用CELLO V.2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）在線軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；用DNAMAN軟件進(jìn)行基因序列比對；運(yùn)用MEGA7軟件對陸地棉基因及其他物種同源基因構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.5 GhPEAMT1的表達(dá)模式分析

為了研究不同組織中的表達(dá)模式，使用Primer Premier 5設(shè)計特異引物（表1）。使用LightCycler480Ⅱ（Roche，德國）對1.2方法獲得的NaCl脅迫的不同時期cDNA樣本進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。按照北京全式金生物技術(shù)有限公司的熒光定量試劑盒（TranStart Top Green qPCR SuperMix，AQ131）說明書確定qRT-PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。內(nèi)參基因?yàn)椋ˋY305733），每個反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)。采用2-ΔΔct計算基因的相對表達(dá)量。

1.6 GhPEAMT1亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建

分別以CPEAMT1A-F、CPEAMT1A-R和CPEAMT1D-F、CPEAMT1D-R為引物（表1）和1.3中提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用限制性內(nèi)切酶Ⅰ37℃酶切，按照NEB的小牛腸堿性磷酸酶（CIP，#M0290S）的步驟對酶切產(chǎn)物進(jìn)行堿性磷酸化，回收，16℃過夜連接到表達(dá)載體P438-GFP中。將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，得到亞細(xì)胞定位載體P438-GFP-GhPEAMT1A和P438-GFP- GhPEAMT1D。

1.7 GhPEAMT1過表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

擴(kuò)增和的CDS片段，用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和HⅠ對目的片段和表達(dá)載體PBI121進(jìn)行雙酶切，然后連接，重組得到過表達(dá)載體PBI121-GhPEAMT1A和PBI121-GhPEAMT1D。使用凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，篩選陽性單克隆菌。通過花序浸染法浸染擬南芥，收獲的種子即是T0代。把消毒后的種子，平鋪在含有卡那霉素抗性的MS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約15 d后，獲得擬南芥陽性苗。把陽性苗種植到營養(yǎng)土中，待擬南芥長到7—8片葉片，取葉片進(jìn)行PCR檢測，確定目的基因是否轉(zhuǎn)入擬南芥中，此時為T1代擬南芥。繼續(xù)種植，最后得到純合的T3代。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子鹽脅迫處理

將擬南芥種子在0.1%的HgCl2溶液中振蕩浸泡4 min，滅菌水清洗6次后，分別把轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子點(diǎn)種在含不同濃度NaCl（0、50、100、150和200 mmol·L-1）的MS培養(yǎng)基中，4℃，春化48 h后，放入23℃的光照培養(yǎng)箱中，16 h光照/8 h黑暗萌發(fā)，生長10 d后觀察統(tǒng)計擬南芥種子的萌發(fā)率，然后選取生長一致的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥轉(zhuǎn)移到不同濃度NaCl的MS培養(yǎng)基中，垂直置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一周后統(tǒng)計根長，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 病毒誘導(dǎo)GhPEAMT1沉默載體的構(gòu)建

基因沉默載體的構(gòu)建選用的載體是TRV2，選取特異的目的片段，片段大小為300 bp，酶切位點(diǎn)為Ⅰ和HⅠ。用Primer Premier5軟件設(shè)計引物為VPEAM1TA-F、VPEAMT1A-R和VPEAMT1D-F、VPEAMT1D-R（表1）。以1.4提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和HⅠ對目的片段進(jìn)行酶切，然后連接到TRV2沉默載體上，測序正確導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，挑取單克隆，驗(yàn)證條帶大小，得到基因沉默載體TRV2::GhPEAMT1A和TRV2::GhPEAMT1D。

1.10 GhPEAMT1沉默棉花植株的鹽脅迫處理

把TRV2::GhPEAMT1A、TRV2::GhPEAMT1D、TRV2:00、CLA1和輔助菌液在含有卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中置于28℃的搖床里過夜培養(yǎng)（約16 h），菌液離心收集菌體，用重懸液（MES、MgCl2、乙酰丁香酮）重懸，測OD值為1.0—1.2，把輔助載體重懸液和各個載體的重懸液按1﹕1混合，然后在25℃黑暗環(huán)境中靜置2 h。選取在24℃，16 h光照/8 h黑暗環(huán)境下生長7 d的棉花幼苗完全展開的子葉進(jìn)行注射，注射之后黑暗處理24 h，置于23℃的溫室繼續(xù)培養(yǎng)。等出現(xiàn)白化苗后，對試驗(yàn)組和對照組單株取樣，進(jìn)行沉默效率的檢測，三葉期對試驗(yàn)組和對照組分別進(jìn)行鹽處理，鹽濃度為40 g·L-1，每株澆灌100 mL鹽水。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 GhPEAMT1在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組中的表現(xiàn)

通過比較陸地棉耐鹽品種早熟長絨7號和感鹽品種南丹巴地大花苗期葉片鹽脅迫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)[17]，圖1-A表明，Gh_A03G0803（）和Gh_D02G1225（）2個基因在NaCl 脅迫后4和24 h具有顯著的差異表達(dá)，尤其是在24 h時表達(dá)差異最大，其中，在早熟長絨7號中的表達(dá)差異倍數(shù)為5.22，在早熟長絨7號中的表達(dá)差異倍數(shù)為6.71。圖1-B表明，2個基因在蛋白質(zhì)水平受鹽脅迫4和24 h時有顯著的差異表達(dá)，其中GhPEAMT1D蛋白表達(dá)差異最大，耐鹽陸地棉早熟長絨7號中的表達(dá)差異倍數(shù)為4.70，感鹽陸地棉南丹巴地大花中的表達(dá)倍數(shù)為3.90。表明和可能是耐鹽相關(guān)基因。

表1 研究中使用的引物

A：差異表達(dá)基因；B：差異豐度蛋白。E：早熟長絨7號；N：南丹巴地大花；0：CK；4：200 mmol·L-1 NaCl處理4 h；24：200 mmol·L-1 NaCl處理24 h。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)無生物學(xué)重復(fù)，蛋白組數(shù)據(jù)有3個生物學(xué)重復(fù)

2.2 GhPEAMT1的克隆與序列分析

用200 mmol·L-1NaCl溶液處理后12 h的早熟長絨7號和南丹巴地大花的cDNA為模板，通過基因克隆、測序得到正確的和的CDS序列，經(jīng)分析，這兩個基因的CDS區(qū)核酸序列分別在2個品種中均表現(xiàn)無差異。的CDS全長為1 488 bp（圖2-A），編碼495個氨基酸，蛋白質(zhì)分子式為C2528H3924N670O749S19，相對分子質(zhì)量為56.296 kD，理論等電點(diǎn)為6.27，具有親水性，不具有跨膜結(jié)構(gòu)。的CDS全長為1 485 bp（圖2-B），編碼494個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子式為C2520H3906N662O746S19，相對分子質(zhì)量為56.021 kD，理論等電點(diǎn)為6.02，具有親水性，不具有跨膜結(jié)構(gòu)。通過保守結(jié)構(gòu)域分析，都具有2個高度保守甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（PF08241和PF13489）（圖2-C）。

A：GhPEAMT1A克隆電泳圖；B：GhPEAMT1D克隆電泳圖；C：GhPEAMT1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析；M1：Trans2K?Plus II Marker；1和3：早熟長絨7號；2和4：南丹巴地大花

將陸地棉GhPEAMT1A的氨基酸序列與亞洲棉（，XM_017755899）、海島棉（，XM_016811336、XM_ 016835662）、雷蒙德氏棉（，XM_012623073）、擬南芥（，NP_188427.2、NP_973993.1）、水稻（，XM_015785333XP_015622327）、玉米（，NP_001307897.2）、可可（，XM_ 007036740）和楊樹（，XM_ 024582451）進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)GhPEAMT1的氨基酸序列與以上物種存在高度保守區(qū)域（圖3-A），進(jìn)化樹分析表明與海島棉同源基因的親緣關(guān)系最近，同源性較高，而棉種與其他物種相比，與可可同源性最高（圖3-B）。

2.3 GhPEAMT1的表達(dá)特征分析

通過對經(jīng)NaCl溶液不同處理時間棉花中表達(dá)的分析（圖4），結(jié)果表明，不同的棉花品種在不同組織和時期和的表達(dá)量呈不同程度上調(diào)，但是表達(dá)特征有所不同。在12和24 h時，耐鹽棉花品種早熟長絨7號中的和表達(dá)量顯著高于南丹巴地大花，且24 h表達(dá)量達(dá)到最高；相對于葉片中的表達(dá)趨勢，在根中有所區(qū)別。2個基因在早熟長絨7號根中受NaCl脅迫12 h表達(dá)量達(dá)到最大值，整體表現(xiàn)為先升后降。感鹽品種南丹巴地大花的表達(dá)量在4、12和24 h顯著低于早熟長絨7號。因此，推測2個基因在耐鹽品種中響應(yīng)鹽脅迫過程中起重要作用。

A：GhPEAMT1氨基酸的多序列比對。Gbar_A03G010420：海島棉，XM_016811336；Gbar_D02G013090：海島棉，XM_016835662；Thecc1EG012768t1：可可，XM_007036740；Gorai.005G132000：雷蒙德氏棉，XM_012623073；Gh_A03G0803：陸地棉，GhPEAMT1A；Gh_D02G1225：陸地棉，GhPEAMT1D；AT1G48600：擬南芥，NP_973993.1；AT3G18000：擬南芥，NP_188427.2；LOC_Os01g47540：水稻，XM_015785333；LOC_Os01g50030：水稻，XP_015622327；Ga03G1288：亞洲棉，XM_017755899；Potri.012G047400：楊樹，XM_024582451；GRMZM2G122296：玉米，NP_001307897.2；黑色線段為保守結(jié)構(gòu)域的位置；B：GhPEAMT1的系統(tǒng)進(jìn)化分析；黑色方框表示目的基因

A: Multiple sequence alignment of. Gbar_A03G010420:, XM_016811336; Gbar_D02G013090:, XM_016835662; Thecc1EG012768t1:, XM_007036740; Gorai.005G132000:, XM_012623073; Gh_A03G0803:, GhPEAMT1A; Gh_D02G1225:, GhPEAMT1D; AT1G48600:, NP_973993.1; AT3G18000:, NP_188427.2; LOC_Os01g47540:, XM_015785333; LOC_Os01g50030:, XP_015622327; Ga03G1288:, XM_017755899; Potri.012G047400:, XM_024582451; GRMZM2G122296:, NP_001307897.2; The black line indicates the position of conserved domain; B:Phylogenetic analysis of; The black box indicates the target gene

圖3 GhPEAMT1氨基酸序列比對和進(jìn)化樹分析

Fig. 3 Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis for gene GhPEAMT1

A：GhPEAMT1A在早熟長絨7號和南丹巴地大花葉片中的表達(dá)；B：GhPEAMT1A在早熟長絨7號和南丹巴地大花根中的表達(dá)；C：GhPEAMT1D在早熟長絨7號和南丹巴地大花葉片中的表達(dá)；D：GhPEAMT1D在早熟長絨7號和南丹巴地大花根中的表達(dá)。E：早熟長絨7號；N：南丹巴地大花

2.4 陸地棉GhPEAMT1的亞細(xì)胞定位分析

運(yùn)用CELLOV.2.5軟件預(yù)測GhPEAMT1位于細(xì)胞質(zhì)中，通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空載體在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均能檢測到綠色熒光蛋白，而目的基因融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中檢測到綠色熒光蛋白（圖5），說明GhPEAMT1A和GhPEAMT1D位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得與鑒定

通過花序浸染法得到轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，用MS培養(yǎng)基（Kan+）篩選得到陽性植株，使用基因特異引物對篩選出的陽性植株進(jìn)行PCR鑒定，去除假陽性植株，為了得到純合的單拷貝陽性植株，繼續(xù)篩選陽性植株與非陽性植株比值為3﹕1的株系，直至得到純合株系。獲得9株轉(zhuǎn)陽性植株（圖6-A），獲得5株轉(zhuǎn)陽性植株（圖6-B），通過RT-PCR分析，和在轉(zhuǎn)基因植株中均能正常表達(dá)，在野生型擬南芥中未檢測到轉(zhuǎn)錄信號（圖6-C）。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性分析

為了進(jìn)一步研究的耐鹽性，通過對WT、轉(zhuǎn)擬南芥和轉(zhuǎn)擬南芥在不同濃度NaCl（0、50、100、150和200 mmol·L-1）處理下進(jìn)行萌發(fā)率和根長的數(shù)據(jù)統(tǒng)計（圖7）。0 mmol·L-1NaCl濃度時野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率和主根長無顯著差異；50 mmol·L-1NaCl濃度時野生型擬南芥萌發(fā)率無顯著差異，主根長有顯著差異，但能正常生長；100 mmol·L-1NaCl濃度時野生型擬南芥萌發(fā)率顯著低于轉(zhuǎn)基因擬南芥，野生型擬南芥的主根顯著長于野生型擬南芥；150 mmol·L-1NaCl濃度時野生型擬南芥的萌發(fā)率顯著低于轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率，野生型擬南芥葉片發(fā)黃逐漸死去，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片發(fā)黃且主根長度較短。

2.7 GhPEAMT1沉默后的功能分析

對陸地棉早熟長絨7號中的和進(jìn)行沉默。棉花中與葉綠素合成相關(guān)基因發(fā)生沉默，棉花的葉綠素合成受到干擾，后期新出現(xiàn)的真葉表現(xiàn)為白化[18]。侵染棉花植株后觀察表型，當(dāng)出現(xiàn)白化表明基因沉默成功（圖8-A）。然后單株取棉花的葉片，通過實(shí)時熒光定量（qRT-PCR）驗(yàn)證對照（CK）、TRV2:00、和沉默后棉花植株的表達(dá)量，CK棉花植株和TRV2:00棉花植株表達(dá)量無顯著變化，目的基因沉默后棉花植株的表達(dá)量顯著降低，結(jié)果表明，成功沉默（圖8-B）。用40 g·L-1NaCl溶液對基因沉默棉花植株、TRV2:00棉花植株和CK棉花植株進(jìn)行鹽脅迫處理。觀察鹽處理后的表型發(fā)現(xiàn)鹽脅迫48 h后，棉花1沉默的植株比對照植株萎蔫嚴(yán)重（圖8-C和圖8-D）。

圖5 GhPEAMT1A和GhPEAMT1D亞細(xì)胞定位

A—D：0、50、100和150 mmol·L-1 NaCl處理下擬南芥萌發(fā)率情況；E—H：0、50、100和150 mmol·L-1 NaCl處理下擬南芥根伸長情況；I：不同NaCl濃度下擬南芥的萌發(fā)率；J：不同NaCl濃度下擬南芥的主根長度。*：差異顯著（P＜0.05），**：差異極顯著（P＜0.01）。下同

A：沉默標(biāo)記基因TRV2:CLA植株；B：病毒誘導(dǎo)基因沉默后，GhPEAMT1A/D沉默效率分析，1—7：注射TRV2::GhPEAMT1A、TRV2::GhPEAMT1D菌株的株系；C—D：鹽脅迫48 h后，CK、TRV2:00、TRV2::GhPEAMT1A、TRV2::GhPEAMT1D棉花幼株表型

鹽脅迫后，注射TRV2::GhPEAMT1A棉花植株與注射空載棉花植株相比過氧化氫酶（CAT）活性降低、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性降低（圖9-A和圖9-B）。沉默TRV2::GhPEAMT1D棉花植株TRV2:00相比CAT、GPX活性都略微升高，但沒有顯著差異（圖9-A和圖9-B），由此推測沉默后，CAT、GPX的活性降低，直接影響活性氧清除系統(tǒng)的不同成員如CAT、GPX、POD的活性（隨著脅迫時間延長，最終結(jié)果都是降低），繼而表現(xiàn)出對鹽敏感。而沉默后對活性氧清除系統(tǒng)沒有影響，推測沉默的植株受鹽脅迫后可能影響其他代謝途徑。

3 討論

當(dāng)植物受到鹽脅迫時，可發(fā)生多種脅迫應(yīng)答反應(yīng)，例如，可以積累一些可溶性物質(zhì)來提高細(xì)胞滲透壓來減輕鹽脅迫對植物造成的傷害[19]。植物PEAMT基因通過提高Cho的含量促進(jìn)滲調(diào)物質(zhì)甘氨酸甜菜堿（GB）的生成，從而增強(qiáng)了植物對鹽脅迫或干旱脅迫的耐受能力[20]。研究表明，在轉(zhuǎn)基因植物中GB含量低在很大程度上是由于Cho合成能力不足[21]。其中磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PEAMT）是磷酸膽堿合成的關(guān)鍵酶[22]，因此，研究植物中的PEAMT的基因在應(yīng)對鹽脅迫中所起的作用顯得非常重要。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過基因工程技術(shù)培育和篩選耐鹽性的作物得到了大力的發(fā)展。截至目前，研究人員已克隆、鑒定出一批與耐鹽相關(guān)的基因，并研究了抗逆境功能，通過遺傳轉(zhuǎn)化還獲得了一些轉(zhuǎn)基因株系。比如，用NaCl處理菠菜葉片后，PEAMT的酶活都高于未處理的[23]；Peel等[11]克隆了玉米中的PEAMT基因在鹽堿脅迫下的玉米葉片，PEAMT酶的活性增加了400%；Li等[24]在遼寧蓬堿中克隆了PEAMT基因，在鹽脅迫后，基因的表達(dá)量升高；對大麥的根中進(jìn)行了PEAMT基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分析，在24 h和3 d上調(diào)表達(dá)[25]；在無隱芒子中克隆出，干旱脅迫誘導(dǎo)8 d時，在葉和根中表達(dá)量分別是未干旱對照的43.35倍和13.25倍，表明可能是無芒隱子草抗旱性相關(guān)的基因[26]。過量表達(dá)PEAMT基因的轉(zhuǎn)基因植株通過增加膽堿和GB的合成來提高自身對鹽脅迫的耐受能力[14,27]，表明PEAMT基因參與植物對非生物逆境的響應(yīng)。Mou等[27]研究表明，擬南芥突變體的Cho生物合成量減少約64%，從而導(dǎo)致突變體植株對鹽漬高度敏感。

A：鹽脅迫48 h后，TRV2:00、TRV2::GHPEAMT1A棉花幼苗CAT的活性；B：鹽脅迫48 h后，TRV2:00、TRV2::GHPEAMT1D棉花幼苗GPX的活性

目前，PEAMT基因在棉花中研究比較少。本研究在轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上篩選到的該耐鹽相關(guān)的候選基因。前人的研究表明不同植物PEAMT基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平受到鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[28-29]。WU等[30]通過對玉米進(jìn)行實(shí)時定量PCR分析，表明受到鹽脅迫的誘導(dǎo)和高溫抑制；MOU等[27]對鹽角草啟動子區(qū)分析含有脫落酸（ABA）誘導(dǎo)元件、熱激應(yīng)答元件和低溫誘導(dǎo)元件等順式調(diào)控元件，表明在轉(zhuǎn)錄水平上可能受赤霉素、低溫、光、ABA與熱激的調(diào)控，這和鹽草角適應(yīng)其惡劣多變的環(huán)境相關(guān)。本研究對鹽耐性不同的棉花品種進(jìn)行表達(dá)特征分析表明在受到鹽脅迫后根和葉在12和24 h表達(dá)量最高，且在耐鹽棉花品種中的表達(dá)量高于感鹽品種，因此，推測陸地棉在植物耐鹽中有著重要作用。繼而對目的基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證，通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)擬南芥與野生型相比，在100 mmol·L-1NaCl脅迫下萌發(fā)率和主根長顯著較高；通過VIGS技術(shù)沉默后陸地棉的抗氧化能力相比對照植株下降，由此推測在棉花在鹽脅迫響應(yīng)中能提高抗氧化能力，繼而表現(xiàn)對鹽脅迫的耐受性。

土壤鹽漬化已經(jīng)嚴(yán)重影響到世界范圍內(nèi)不少作物的產(chǎn)量等性狀。而當(dāng)前利用基因工程手段來提高作物的耐鹽性是解決這一世界難題的有效策略之一。也有大量研究表明向作物轉(zhuǎn)入與耐鹽相關(guān)的基因可以在一定程度提高作物的耐鹽性。本研究通過轉(zhuǎn)基因擬南芥，提高了耐鹽性；通過沉默該基因?qū)е旅藁ǔ聊晗祵}敏感，都證明該基因是耐鹽相關(guān)基因，這為進(jìn)一步棉花基因工程育種，培育棉花抗逆新品系提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

從陸地棉中克隆了2個同源基因和，其CDS長度分別為1 488和1 485 bp，編碼495和494個氨基酸，推導(dǎo)的多肽均包含2個高度保守甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。不具有跨膜結(jié)構(gòu)，在進(jìn)化中功能高度保守。陸地棉和的表達(dá)在鹽脅迫后被誘導(dǎo)，推測在響應(yīng)鹽脅迫過程中起正向調(diào)控作用。

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Cloning and Functional Analysis of Salt Stress Response Gene

WANG Na1, ZHAO ZiBo2, GAO Qiong1, HE ShouPu1, MA ChenHui1, PENG Zhen1,2, DU XiongMing1,2

1Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan;2School of Agricultural Sciences, Zhengzhou University/Zhengzhou Research Base, State Key Laboratory of Cotton Biology, Zhengzhou 450001

【】Phosphoethanolamine-N-methyltransferase (PEAMT) is the key enzyme in the synthesis of plant phosphocholine, which is the precursor of choline, a glycine betaine synthesis substrate that can enhance plant resistance. The biological function ofgene in response to salt stress in upland cotton was studied by cloning, expression pattern analysis and functional verification,so as to provide gene resources for breeding salt tolerant cotton varieties.【】According to the screening of transcriptome sequencing data,gene was selected as a salt-tolerant candidate gene. the target gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). gene structure characteristicspredict protein relative molecular mass and evolutionary relationship were analyzed by bioinformatics; Salt-tolerant cotton variety Earlistable 7 and salt-sensitive cotton genotype Nandanbadidahua were treated with 200 mmol·L-1NaCl solution, and cotton leaves and roots were taken for fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) to analyze the expression characteristics in tissues. Subcellular location vector was constructedfor transient transformation of tobacco to determine the location of protein in the cell. The gene overexpression vector was constructed, andwas transformed by inflorescence infection method, and the germination rate and taproot lengthof transgenicunder salt stress were analyzed. Virus induced gene silencing (VIGS) technology was used on Earlistable 7to silence the target gene and the efficiency of gene silencing was verified by real-time fluorescence quantitative analysis of the cotton leaves. Then the enzyme activities of catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX) in the leaves of cotton were measured. 【】Two homologous genes,and, were cloned and the CDS lengths were 1 488 bp and 1 485 bp, respectively. The phylogenetic tree showed thathad the closest genetic relationship with the Sea island cotton, andhad the higher homology withcompared with other species. Under salt stress conditions, the expression levels ofgene andgene in leaves and roots of salt-tolerant Earlistable 7 were significantly higher than that of salt-sensitive Nandanbadidahua. Subcellular localization shows that the gene is located in the cytoplasm.Overexpression of this gene forfound that the germination rate of transgenicwas significantly higher than that of wild-type on MS medium of 100 and 150 mmol·L-1NaCl. The taprootroot length of transgenicwas significantly longer than that of wild-type on the MS medium of 50 mmol·L-1and 100 mmol·L-1NaCl.After treatment with 40 g·L-1NaCl solution for 24 h, the cottonleaves with successfully silencedandgene were more wilting than those of CK and TRV2:00 injections. After salt stress, the TRV2::GhPEAMT1A cotton plants were reduced in catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX) content in comparison with the unloaded injected cotton plants. 【】overexpression and VIGS experiments show that thegene can respond to salt stress and play a positive regulatory role.

Upland cotton; salt stress;gene; gene cloning; gene silencing

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.002

2020-06-13；

2020-08-27

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2017YFD0101600）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（161012018004）

王娜，E-mail：15517960172@163.com。通信作者杜雄明，E-mail：dxm630723@163.com。通信作者彭振，E-mail：pengzhen01@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）