RNF144A基因在皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá)及臨床意義*

王智浩，曹如柔，蔣 帆，劉 韻，蔣益蘭

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410006)

皮膚惡性黑色素瘤(SKCM)是惡性程度很高、侵襲能力很強(qiáng)，發(fā)生在皮膚中的惡性腫瘤，占所有皮膚惡性腫瘤的5%，是死亡率最高的皮膚癌類型[1]。雖然轉(zhuǎn)移性黑色素瘤新療法廣泛應(yīng)用使SKCM的死亡率有所下降，但SKCM的發(fā)病率依舊在持續(xù)增加[2-3]。RNF144A基因是泛素化蛋白編碼基因家族中的重要成員，參與蛋白質(zhì)定位、轉(zhuǎn)運(yùn)、修飾及蛋白質(zhì)間的相互作用[4-6]。泛素化過程涉及細(xì)胞周期調(diào)控、染色體有絲分裂、核酸損傷修復(fù)[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，RNF144A基因在帕金森病[10]、肺纖維化[11]、心力衰竭[12]、乳腺癌[13]等疾病中作用顯著。本研究采用數(shù)據(jù)挖掘的方法，分析RNF144A在SKCM中的作用及對其預(yù)后的影響，為SKCM的精準(zhǔn)診斷及治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1RNF144A 基因在不同腫瘤組織中表達(dá)差異性分析 GEPIA是基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的腫瘤和正常樣本進(jìn)行基因表達(dá)分析的網(wǎng)站[14]。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫 (http://gepia2.cancer-pku.cn)分析不同腫瘤間RNF144A基因的差異性表達(dá)。進(jìn)入網(wǎng)站后選擇single gene analysis，輸入RNF144A，在GeneralInformation中查看分析結(jié)果。

1.2RNF144A 基因在SKCM中表達(dá)差異性分析 Oncomine數(shù)據(jù)庫是癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫和基于Web的數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，可以通過此數(shù)據(jù)庫對腫瘤臨床和病理學(xué)進(jìn)行探索，采用t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行差異分析[15]。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org)分析SKCM組織與癌旁組織中mRNA差異性表達(dá)。檢索條件：(1)Analysis type:Melanomavs.Normal analysis；(2) Cancer type:Cutaneous melanoma；(3) Data type:mRNA；(4)Concept type:Over-expression (Oncomine concepts)。

1.3RNF144A基因在SKCM中表達(dá)的亞組分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫是使用癌癥基因組圖譜(TCGA) 3級RNA-seq和來自31種癌癥類型的臨床數(shù)據(jù)對基因、臨床表型及疾病進(jìn)行深入分析的交互式網(wǎng)絡(luò)門戶[16]。通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)對RNF144A基因在SKCM中的表達(dá)進(jìn)行樣本類型、腫瘤分期、年齡、體重、性別、種族的亞組分析，以箱線圖展示。進(jìn)入網(wǎng)站后，在TCGAanalysis界面輸入RNF144A，TCGA dataset選擇SKCM，然后在Links for analysis欄選擇Expression。

1.4基于OncoLnc網(wǎng)站進(jìn)行生存分析 OncoLnc網(wǎng)站包含了TCGA進(jìn)行的21項(xiàng)癌癥研究中8 647例患者的生存數(shù)據(jù)，用戶能夠通過基因表達(dá)區(qū)分患者并進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析[17]。通過OncoLnc網(wǎng)站(http://www.Oncolnc.org)繪制RNF144A基因表達(dá)與SKCM患者生存周期相關(guān)曲線。進(jìn)入網(wǎng)站后輸入RNF144A，選擇SKCM，在Kaplan plot for RNF144A in SKCM的界面中，LowerPercentile和Upperpercentile分別輸入50、50。

1.5SKCM中RNF144A基因的共表達(dá)基因 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)查找SKCM中RNF144A基因的共表達(dá)基因。進(jìn)入網(wǎng)站后，在TCGAanalysis界面輸入RNF144A，TCGA dataset選擇SKCM，然后在Links for analysis欄選擇Correlation。

1.6String 蛋白網(wǎng)絡(luò)分析 String蛋白網(wǎng)絡(luò)分析可預(yù)測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[18]。通過String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)預(yù)測RNF144A蛋白的上下游調(diào)控蛋白及蛋白間的相關(guān)調(diào)控關(guān)系。檢索條件：(1) Portein name：RNF44A；(2) Organism：auto-detect。

2 結(jié) 果

2.1RNF144A 基因在不同腫瘤類型中的差異性表達(dá) 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，RNF144A在急性髓系白血病(LAML)、SKCM、胃腺癌(STAD)、胸腺瘤(THYM)中高表達(dá)，在宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、子宮內(nèi)膜癌(UCUC)、子宮內(nèi)膜肉瘤(UCS)中低表達(dá)。見圖1。

2.2RNF144A基因在SKCM中表達(dá)差異性分析 通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析SKCM中RNF144A基因轉(zhuǎn)錄水平，共有2個(gè)數(shù)據(jù)源，分別來自RIKER等[19]和TALAN TOV等[20]研究，共計(jì)137個(gè)樣本(圖2)。對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析發(fā)現(xiàn)，RNF144A轉(zhuǎn)錄的mRNA在SKCM中高表達(dá)，與其在正常組織中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中RNF144A在不同腫瘤中差異性表達(dá)

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中在SKCM中基因差異性表達(dá)

2.3RNF144A基因在SKCM中基因表達(dá)的亞組分析通過UALCAN網(wǎng)站對RNF144A基因在SKCM中表達(dá)進(jìn)行樣本類型、腫瘤分期、年齡、體重、性別、種族的亞組分析,發(fā)現(xiàn)RNF144A在男性SKCM患者中的表達(dá)明顯高于RNF144A在女性SKCM患者中的表達(dá)存在顯著差異(P=0.003)(圖3C),在其余亞組分析即不同樣本類型的SKCM中、不同腫瘤分期的SKCM中、不同種族的SKCM中、不同年齡的SKCM中、不同體重的SKCM中RNF144A的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A、3B、3D、3E、3F)。

2.4基于OncoLnc網(wǎng)站的生存曲線 通過OncoLnc網(wǎng)站繪制RNF144A基因表達(dá)與SKCM患者生存周期相關(guān)曲線，RNF144A高表達(dá)組與低表達(dá)組樣本各有229例，繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)(圖4)，RNF144A高表達(dá)組患者生存周期較低表達(dá)組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00 165)。

2.5SKCM中 RNF144A基因的共表達(dá)基因 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫查找發(fā)現(xiàn)Pearson-CC大于0.5的基因有602個(gè)，按Pearson-CC降序排列，選取前25個(gè)基因，繪制RNF144A基因在SKCM中共表達(dá)基因的熱圖(圖5)，這些基因分別是PRKCE、C2orf29、HMG20A、USP39、SLC35E3、KCMF1、POLR1A、MSI2、RNF115、PTCD3、LRPPRC、C2orf44、PNO1、UBXN2A、POLR2D、MARS2、E2F6、PPP3R1、C2orf43、FAM168B、CTBP2、ADSS、GPN1、IMMT。

A.不同樣本類型的SKCM中RNF144A的表達(dá);B.不同腫瘤分期的SKCM中RNF144A的表達(dá);C.不同性別的SKCM中RNF144A的表達(dá);D.不同種族的SKCM中RNF144A的表達(dá);E.不同年齡的SKCM中RNF144A的表達(dá);F.不同體重的SKCM中RNF144A的表達(dá);與男性患者比較，aP<0.05。

圖4 RNF144A基因不同表達(dá)水平的SKCM患者總體生存曲線

圖5 SKCM中RNF144A基因的共表達(dá)基因熱圖

2.6RNF144A基因上下游關(guān)系預(yù)測 在String網(wǎng)站中，分析RNF144A基因上下游關(guān)系，得到相應(yīng)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)，PPI富集P值(PPI enrichmentP-value)=0.031 3。相互作用節(jié)點(diǎn)數(shù)共有11個(gè)，分別為PRKDC、UBC、RPS27A、UBB、UBA52、UBE2L3、CMPK2、TSSC1、MRPL37、RNFT2。RNF144A基因主要參與蛋白質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)泛素化。E3泛素蛋白連接酶以硫酯的形式從E2泛素結(jié)合酶UBE2L3和UBE2L6接受泛素，然后將泛素直接轉(zhuǎn)移至目標(biāo)底物。

圖6 RNF144A與上下游基因調(diào)控關(guān)系

3 討 論

SKCM是惡性程度最高的惡性腫瘤之一[21]。目前，針對SKCM的靶向治療及免疫療法取得了突破性進(jìn)展，并在早期診斷和預(yù)防方面獲得了不可忽視的進(jìn)步，但SKCM的預(yù)后依舊不容樂觀，尤其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，3年生存率不足20%[22-23]。

RNF144A基因是蛋白質(zhì)泛素化家族基因中的重要成員。泛素化是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，可與細(xì)胞質(zhì)DNA-PKcs相互作用并降解，維持EGFR信號傳導(dǎo)，在DNA損傷過程中促進(jìn)細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用[24-25]。有證據(jù)表明，靶向泛素化在惡性腫瘤的治療及預(yù)后中存在巨大潛力[26-27]，但RNF144A基因與SKCM的相關(guān)性研究尚缺乏相關(guān)報(bào)道。

本文通過GEPIA網(wǎng)站和Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)RNF144A基因在SKCM中高表達(dá)，基于此結(jié)論，RNF144A基因有可能成為一個(gè)SKCM分子診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記物?；赨ALCAN數(shù)據(jù)庫對RNF144A基因在SKCM中表達(dá)進(jìn)行樣本類型、腫瘤分期、年齡、體重、性別、種族的亞組分析，發(fā)現(xiàn)男性患者的RNF144A基因表達(dá)高于女性患者?；贠ncoLnc網(wǎng)站的生存分析發(fā)現(xiàn)RNF144A基因高表達(dá)組患者生存周期明顯短于低表達(dá)組，提示RNF144A基因的表達(dá)與SKCM的預(yù)后顯著相關(guān)，證明了RNF144A基因可作為SKCM治療的潛在靶點(diǎn)?；赨ALCAN數(shù)據(jù)庫的共表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)RNF144A基因在SKCM中存在眾多的共表達(dá)基因，為進(jìn)一步的分子機(jī)制研究開拓了新的思路。通過String蛋白網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，RNF144A可能與PRKDC、UBC、RPS27A、UBB、UBA52、UBE2L3、CMPK2、TSSC1、MRPL37、RNFT2等蛋白相互作用，這為RNF144A基因表達(dá)調(diào)控研究提供了方向。

本研究使用不同數(shù)據(jù)庫及在線分析工具分析了RNF144A與SKCM之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RNF144A在SKCM中高表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了理論依據(jù)，同時(shí)為SKCM精準(zhǔn)診斷及治療提供了新的思路。