碳源對膨脹污泥微生物多樣性的影響研究

高春娣，張 娜，韓 徽，任 浩，侯春艷，李 悅，王傳德

(北京工業(yè)大學環(huán)境與能源工程學院，城鎮(zhèn)污水深度處理與資源化利用技術國家工程實驗室，北京 100124)

就絲狀菌污泥膨脹而言，盡管已有眾多研究對與之相關的環(huán)境條件和處理工藝進行了全面的總結和改進[1-3]，但如一些污水本身的水質特點極易誘發(fā)膨脹. 季節(jié)變化導致的溫度變化極易誘發(fā)膨脹等問題在實際運行中常常難以避免，從而加大了污泥膨脹的防治難度. 而在絲狀菌膨脹的微生物學研究領域，雖然已發(fā)現(xiàn)并總結了許多優(yōu)勢絲狀菌的生理生態(tài)學特性，但相關的純培養(yǎng)仍存在較高的誤差和失敗率[4]，使得已有的研究不夠全面和深入. 必須認識到的是，活性污泥本質上是無數(shù)微生物群落所形成的復雜結合體，絲狀膨脹正是微生物群落失衡而引發(fā)的典型問題[5]，故面對污泥膨脹微生物學研究的瓶頸，應當將過去圍繞單一優(yōu)勢絲狀菌的研究視角轉移到針對微生物整體多樣性的變化分析中. 近年來，隨著先進分子生物學技術的發(fā)展和應用，高通量測序已在污水處理領域的諸多方面中取得了理想的應用效果[6-8]，也為膨脹領域相關問題的解決帶來了新的可能. 針對目前膨脹相關測序雖已陸續(xù)開展[9-11]，但研究基礎仍舊不足，理論基礎仍舊不豐富不全面的研究現(xiàn)狀，本實驗以導致膨脹的水質特征為切入點，選取不同碳源進行了污泥膨脹的誘發(fā)實驗，并借助高通量測序對膨脹污泥微生物多樣性進行了較為全面的研究和對比分析，放大了以往的研究視角，豐富了本領域的研究內容，以期為該問題的應對和解決提供更多的理論支撐.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

本實驗以SBR反應器(見圖1)作為主要裝置，2個反應器的容積均為8 L，運行期間每周期進水4 L、排水4 L，排水比50%. 反應器下部配備的曝氣盤與轉子流量計和空氣壓縮機連接，為活性污泥提供溶解氧，配備的WTW3420型溶氧儀裝有DO、pH探頭，不僅可用于觀察反應器內實際溶解氧水平，還可實現(xiàn)系統(tǒng)內pH的實時監(jiān)測，裝置上部電動攪拌器的主要功能是保證泥水充分混勻. 此外，還根據實際需求設置了進水口與排水口，分別與蠕動泵和電動閥相連，實現(xiàn)系統(tǒng)的自動進排水.

1—電動攪拌器；2—加熱棒；3—pH探頭；4—DO探頭；5—WTW3420型溶解氧儀；6—電動機；7—取樣口；8—氣體流量計；9—曝氣盤；10—空氣壓縮機；11—蠕動泵；12—配水水箱. 圖1 SBR反應器示意圖Fig.1 Scliematic diagram of SBR reactor

1.2 實驗水質和污泥

本實驗接種污泥為北京市高碑店污水處理廠二沉池回流污泥，具有較好的污泥沉降性能和脫氮除磷性能. 進水采用人工配水，2個反應器分別以淀粉和乙酸鈉為主要碳源，詳細配水水質參數(shù)如表1、2所示. 配水水質中的微量元素為1 mL/L.

表1 人工配水水質情況

表2 微量元素配方

1.3 實驗運行方案

本實驗采取傳統(tǒng)硝化反硝化工藝，分3個階段共運行80 d，階段一和階段二每天運行3周期，為污泥馴化及膨脹發(fā)生階段，該階段主要目的是使污泥適應本實驗所采取的的水質及運行方式后盡早進入膨脹階段，該期間控制溶解氧在2 mg/L以上運行. 階段三每天運行2周期，為惡性污泥膨脹階段，由于該階段污泥沉降性能較差，故延長了污泥沉淀時間，具體的運行案如表3所示.

表3 實驗運行方案

1.4 分析指標和方法

在本實驗的分析過程中，SVI、MLSS、TN等根據標準方法測得[12]，COD采用連華科技5B-3 COD快速測定儀測定. 在對污泥絮體進行革蘭染色染色后，根據Olympus BX61型顯微鏡的鏡檢結果及Eikelboom絲狀菌手冊進行優(yōu)勢絲狀菌的判定，并結合高通量測序的結果，進行微生物群落多樣性的分析.

2 結果與討論

2.1 絲狀菌污泥膨脹的發(fā)生

2.1.1 絲狀菌污泥膨脹過程中的沉降性變化

全階段運行期間的污泥沉降性能如圖2所示，可以看出，雖然2個反應器的運行方式相同，但在不同碳源下的沉降性能卻存在差異，以淀粉為碳源的SBR1在運行至第34天左右就出現(xiàn)了SVI值的升高，但該現(xiàn)象僅持續(xù)了10 d左右，之后沉降性能又逐漸變好. 繼續(xù)運行至第53天左右時SVI迅速升高至300 mL/g左右并持續(xù)惡化至第64天時的479 mL/g，之后再次呈現(xiàn)沉降性能的轉好，這說明淀粉進水下的污泥膨脹具有一定波動性，但沉降性能仍能惡化至較為嚴重的狀態(tài). 盡管Wang等[13]的研究認為改用紅薯淀粉為碳源可抑制以葡萄糖為碳源于完全混合工藝下導致的絲狀菌污泥膨脹，改善污泥沉降性能，在采用可溶性淀粉為碳源的本實驗中，仍發(fā)生了絲狀菌膨脹，這可能是由于本實驗對使用的可溶性淀粉進行了加熱以便于淀粉在配水中的溶解. 而Wang等則通過將淀粉廢水保存在4 ℃環(huán)境下來避免其水解，由于較多未水解的顆粒態(tài)淀粉有利于菌膠團菌的附著，會增大污泥絮體的粒徑和質量，改善污泥沉降性能，且加熱后的淀粉會水解出葡萄糖等低分子化合物，有助于絲狀菌等微生物的吸收利用，從而使得本實驗中發(fā)生了污泥膨脹，出現(xiàn)了沉降性能的波動. 此外，在Guo等[14]以可溶性淀粉為碳源的實驗中也發(fā)生了絲狀菌污泥膨脹，但本實驗中SVI最嚴重時可惡化至479 mL/g，而Guo等實驗中的SVI最高卻不超過400 mL/g，可見本實驗中的污泥沉降性能更差一些. 產生這種現(xiàn)象的原因可能是本實驗中采取的傳統(tǒng)硝化反硝化運行模式與Guo實驗中階段一先缺氧后好氧，階段二和階段三又全程好氧的運行模式有所不同. 由于先缺氧后好氧的運行模式起到了缺氧選擇器的作用，可以在階段一期間洗脫掉一部分好氧絲狀菌，且后續(xù)階段二、三的全程好氧又提供了足夠的溶解氧，因此對菌膠團菌產生的抑制作用更小，從而使得系統(tǒng)中絲狀菌的豐度更小，沉降性能更好. 相較于SBR1中污泥沉降性能呈顯示出的波動性，以乙酸鈉為進水碳源的SBR2中的SVI值則變化得較為規(guī)律，隨運行時間變化呈逐步升高趨勢，中間沒有發(fā)生沉降性能的自我恢復，在系統(tǒng)運行至第26天時，反應器內活性污泥的SVI值便先于SBR1開始升高，并持續(xù)惡化至527 mL/g，這與其他乙酸鈉進水下污泥膨脹的相關研究結果較為一致.

圖2 全階段運行期間的污泥沉降性能變化Fig.2 Variation of SVI during the full-stage operation

2.1.2 絲狀菌污泥膨脹過程中的污染物去除效果

如圖3所示，2種碳源進水下雖然都發(fā)生了污泥膨脹，但是反應器運行期間全階段污染物去除效果仍維持在較好水平，2個反應器的COD去除率均可維持在90%以上，TN去除率均可維持在80%以上. 這說明絲狀菌污泥膨脹的發(fā)生不一定伴隨著污染物處理效果的下降，即便在惡性污泥膨脹期間，活性污泥仍能保持較好的處理效果. 觀察圖3可以發(fā)現(xiàn)，全階段運行期間出水水質較差的時間點主要集中在反應器運行的前3周左右，而該階段正是實驗過程中的污泥馴化階段，從污水廠取來的活性污泥投加到本實驗中的人工配水環(huán)境中，需要適應一段時間，故在實驗初期出現(xiàn)了一定的水質波動. 而隨著反應器的不斷運行，污泥逐漸適應了本實驗的運行條件與進水水質，加之后期污泥膨脹的成功誘發(fā)使得絲狀菌不斷增殖，它們的菌絲或從絮體內部伸出，或纏繞包裹于絮體表面，從而會產生網捕作用[15]，促進水質的凈化，提升污染物的去除效果. 此外，本實驗中也發(fā)現(xiàn)了諸多在污泥膨脹后相對豐度仍呈上升趨勢的脫氮菌與菌膠團菌，這些功能菌的增殖說明活性污泥仍可維持正常的脫氮功能，且本實驗中在2種碳源下廣泛分布的優(yōu)勢絲狀菌Thiothrix也具有一定的有機物降解能力與脫氮功能[16]，其在污水中的大量增殖進一步強化了污水的處理效果. 故上述因素不僅為本實驗中較好的污染物處理效果帶來了解釋，也說明本實驗中的2種碳源類型雖會使污泥產生不同的沉降性能變化，卻不會對污染物的整體處理效果產生較大影響.

圖3 全階段運行期間的污染物去除效果Fig.3 Pollutant removal efficiency during the continuous operational period

2.2 微生物菌群多樣性的整體變化

2.2.1 膨脹污泥微生物菌群的Alpha多樣性分析

為探究絲狀菌膨脹污泥的微生物多樣性變化，對膨脹前后的活性污泥進行了高通量測序，并對高通量測序獲得的序列進行了Alpha分析，結果如表4所示.

表4 不同污泥樣品的Alpha多樣性分析

由表4所示，SBR1.1與SBR1.2分別對應淀粉碳源進水下的原始泥樣和膨脹泥樣，SBR2.1和SBR2.2分別對應乙酸鈉碳源進水下的原始泥樣和膨脹泥樣. 在本次測序的4個污泥樣品中分別獲得了51 373、67 592、63 410和71 937條優(yōu)化序列，為便于不同樣本間微生物多樣性的對比分析，以最少序列數(shù)51 373進行數(shù)據抽平，并在97%的相似水平下進行Alpha多樣性分析后，在4個不同的污泥樣本中分別得到964、713、951和903個OTUs，即2個反應器內的OTUs數(shù)均因污泥膨脹的發(fā)生而降低，其中淀粉廢水降低數(shù)量為251，是乙酸鈉廢水降低數(shù)量48的5倍多，說明相較于乙酸鈉，淀粉對菌群結構有更大的影響. 此外，常用于代表微生物菌群豐度的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Sobs指數(shù)和常用于估算污泥中微生物的多樣性和均一性的Shannon指數(shù)分別由SBR1.1中的348、343、323、4.261和SBR2.1中的381、382、338、3.946降低至SBR1.2中的334、341、303、3.891和SBR2.2中的340、344、307、3.882. 且常用于衡量樣品中微生物的豐富度的Simpson指數(shù)也由SBR1.1中的0.027以及SBR2.1中的0.043升高至SBR1.2中的0.046以及SBR2.2中的0.056. 故由這些指數(shù)的變化可知，隨污泥膨脹的發(fā)生及沉降性能的惡化，系統(tǒng)內微生物的數(shù)量、豐度、均一性、多樣性及豐富度均呈降低趨勢，污泥膨脹對微生物多樣性產生了較大影響.

2.2.2 膨脹污泥微生物菌群整體變化特征

如圖4所示，在來自2個反應器的4個泥樣中共檢測出10種門類微生物，在4個樣本中占比最大的門類均為Proteobacteria，其在不同碳源引發(fā)的污泥膨脹中展現(xiàn)出了不同的變化趨勢：在以淀粉為進水碳源的SBR1中，其相對豐度由未膨脹時的50.62%升高至膨脹后的62.89%，而在以乙酸鈉為進水碳源的SBR2中，相對豐度由未膨脹時的64.34%降低至膨脹后的62.86%，Actinobacteria與其變化規(guī)律相同，Bacteroidetes和Elusimicrobia的相對豐度則與它們相反，在SBR1中降低，在SBR2中升高. 說明以淀粉為碳源的廢水環(huán)境更利于Proteobacteria與Actinobacteria兩種門類微生物的生長，Bacteroidetes和Elusimicrobia則更適合在以乙酸鈉為碳源的廢水中生長. 此外，在本次檢測出的菌群中，Chloroflexi、Planctomycetes、Patescibacteria、Nitrospirae和Acidobacteria的相對豐度在2個反應器內均呈降低趨勢，Verrucomicrobia的相對豐度在2個反應器內均上升. 這說明在本實驗的運行條件下，2種碳源對以上6種門類微生物產生的影響是相同的.

圖4 膨脹污泥微生物菌群的整體變化Fig.4 Overall changes of relative abundance in bulking sludge

為了更好地區(qū)分膨脹污泥中不同種類微生物的多樣性變化，將高通量測序在屬水平檢測出的微生物按照其在污水處理過程中所執(zhí)行的功能分成了五大類，第1類是在污泥絮體中擔任菌膠團骨架結構的絲狀菌，通常也是造成污泥膨脹的主導菌；第2類及第3類是在污染物去除過程中起主要作用的脫氮菌和除磷菌；第4類是本次檢測出的其他菌膠團菌；第5類則是屬水平上檢測出占比卻無法確定菌屬名稱及相應功能的其他微生物. 從圖4中可以看出，污泥膨脹的發(fā)生使這5類微生物菌群的相對豐度都發(fā)生了變化，或同時升高或同時降低，而盡管不同碳源下各功能菌群的豐度變化較為一致，不同反應器中除磷菌的占比差異卻很大，在以乙酸鈉為進水碳源的SBR2中的占比遠高于以淀粉為進水碳源的SBR1. 這說明就不同功能菌群在膨脹前后的整體豐度變化而言，2種碳源所產生的影響大致相同，但就除磷菌群在所有微生物中的整體占比而言，乙酸鈉為碳源比淀粉為碳源更利于除磷菌的增殖.

2.3 膨脹污泥各特定菌群及特定菌屬的變化特征

2.3.1 絲狀菌群的相對豐度變化

如圖5所示，革蘭氏染色及鏡檢結果表明2種不同碳源下的優(yōu)勢絲狀菌存在差異，在以淀粉為碳源的SBR1中可以明顯觀察到2種優(yōu)勢絲狀菌，一種絲狀菌呈革蘭氏陰性，菌絲較粗且內有硫粒積累，推斷為Thiothrix[17]，而另一種絲狀菌也為革蘭氏陰性菌，但菌絲又細又長，推斷為Haliscomenobacterhydrossis[18]. 而在乙酸鈉為進水碳源的SBR2雖同樣發(fā)現(xiàn)了大量Thiothrix，卻沒有觀察到H.hydrossis.

圖5 革蘭氏染色和絲狀菌相對豐度變化圖Fig.5 Gram stain and relative abundance of filamentous bacteria

高通量測序的結果與革蘭氏染色的結果較為一致，在2個反應器的泥樣中均檢測出了大量的Thiothrix菌，其在SBR1和SBR2的膨脹泥樣中相對豐度分別占到7.11%和9.56%，在以乙酸鈉為碳源的SBR2中的相對豐度稍高，但整體差異不大. 屬水平上的第二優(yōu)勢菌為Haliscomenobacter，其分類下的H.hydrossis正是前述鏡檢染色中發(fā)現(xiàn)的絲狀菌，該菌在2個不同反應器中的相對豐度與鏡檢染色的結果也較為一致，在SBR1膨脹污泥中的相對豐度為2.39%，是SBR2膨脹污泥中0.56%的4.3倍左右，遠高于SBR2. 而在剩余的4種絲狀菌屬中，除來自Actinobacteria門的Tetrasphaera的相對豐度在2個反應器中均呈降低趨勢外，另外3種菌屬Tessaracoccus、Nocardioides和Mycobacterium的相對豐度在不同反應器中呈現(xiàn)出了相反的變化趨勢. 即2種碳源對這3種菌屬的增殖產生了不同的影響，Tessaracoccus和Mycobacterium更適宜在以淀粉為碳源的廢水中增殖，乙酸鈉為碳源的廢水會造成二者豐度的降低，而Nocardioides則更適宜在以乙酸鈉為碳源的廢水中增殖，淀粉為碳源的廢水會造成其豐度的降低.

2.3.2 脫氮菌的相對豐度變化

圖6 脫氮菌相對豐度變化圖Fig.6 Relative abundance of denitrification bacteria

2.3.3 除磷菌的相對豐度變化

如圖7所示，本實驗在屬水平中共檢測出8種與生物除磷有關的菌屬，分別為3種聚磷菌屬和5種聚糖菌屬，其中共5種菌屬的相對豐度在不同碳源廢水下呈現(xiàn)出了相同的變化，說明2種碳源對其增殖變化的影響相同，而作為聚磷菌的Pseudomonas、Acinetobacter和作為聚糖菌的Amaricoccus的相對豐度則在不同碳源廢水下呈現(xiàn)了不同的變化.C.Accumulibacter是一種典型的聚磷菌，有報道稱在乙酸作為單一碳源時，可得到大量的該菌[22]，在本實驗中，其在乙酸鈉為進水碳源的SBR2中的確有相較淀粉為進水碳源的SBR1中更大的系統(tǒng)占比.C.Competibacter為EBPR系統(tǒng)中一類經常出現(xiàn)的聚糖菌，也是本分類下相對豐度最大的菌屬，其在2個反應器中的相對豐度均隨污泥膨脹的發(fā)生呈降低趨勢，同樣作為聚糖菌的Tetrasphaera、Micropruina及Defluviicoccus的豐度變化與之相同.Tetrasphaera除作為EBPR系統(tǒng)中最豐富的除磷菌外，還具有一定的脫氮能力[23].Micropruina是一種能夠積累細胞聚磷酸鹽,且在好氧條件和厭氧條件下均可以利用和貯存各種糖類為聚合糖的菌屬，對除磷和CODCr有很大貢獻[24]. 有報道稱Defluviicoccus在以乙酸鹽為碳源的好氧顆粒污泥中為主要微生物，在本實驗中，其在淀粉為進水碳源的SBR1中也大量分布[25]. 由于Pseudomonas屬下包含多種反硝化聚磷菌[26]，因此在污染物去除過程中既可以執(zhí)行脫氮功能，也可以執(zhí)行除磷功能.Acinetobacter是一種可以在很寬的溫度范圍內生長的菌屬，在自然界中分布較為廣泛[27].Amaricoccus是本次實驗中占比最小的除磷菌，其在原始泥樣中的占比僅為0.01%，有關Amaricoccus的研究報道較少.

圖7 除磷菌相對豐度變化圖Fig.7 Relative abundance of dephosphorization bacteria

2.3.4 其他菌膠團菌的相對豐度變化

為便于分析，對屬水平上發(fā)現(xiàn)的其他菌膠團菌中相對豐度占比在前20的菌屬進行繪圖，結果如圖8所示. 可以發(fā)現(xiàn)，在選取的其他菌膠團菌中共有Reyranella等8種(40%)菌屬的相對豐度在2種碳源下均隨膨脹的發(fā)生而降低；Zoogloea等7種(35%)菌屬的相對豐度在2種碳源下均隨膨脹的發(fā)生而升高；Stella等5種(25%)菌屬的相對豐度在2種不同碳源下變化趨勢不同. 而在所有來自其他菌膠團菌的20種微生物中，占比最大的為來自β-Proteobacteria的好氧菌Zoogloea，作為活性污泥菌膠團絮體形成的代表性微生物，Zoogloea不僅能夠有效去除污水中的有機物質，降低污水的BOD和COD，且在污水處理廠的脫氮除磷過程中也發(fā)揮著重要作用[28-29]，從而在許多污水處理廠活性污泥中都占有優(yōu)勢地位[30]. 在本實驗中，該菌膨脹前后的相對豐度為7%～19%，且在2個反應器中的相對豐度均隨膨脹的發(fā)生呈上升趨勢，從而在一定程度上促進了出水水質的提升. 在6種相對豐度受碳源選擇性影響的菌屬中，Haliangiums是粘細菌的一種，Bryobacter則能夠促進土壤的碳循環(huán)，兩者均多見于土壤及海洋細菌群落的相關研究[31]，有關Stella、Inhella和Opitutus的報道則相對較少，對應的生理特性信息較少，有待進一步的研究.

圖8 其他菌膠團菌相對豐度變化圖Fig.8 Relative abundance of other floc-forming bacteria

3 結論

1) 相較于乙酸鈉進水下沉降性能的持續(xù)惡化，淀粉進水下的沉降性能具有一定波動性. 雖然2種不同的進水碳源均能引起污泥沉降性能的惡化，但對污染物的去除效果沒有較大影響，2個反應器在實驗期間均保持了較好的出水水質.

2) 2個反應器內微生物整體的豐度、均一性、多樣性及豐富度均因污泥膨脹的發(fā)生而有所降低，淀粉進水下發(fā)生的污泥膨脹使反應器內OTUs數(shù)減少了251，是乙酸鈉進水下減少數(shù)量的5倍多，表明其對微生物多樣性的影響大于乙酸鈉.

3) 所有泥樣中相對豐度最大的門類均為Proteobacteria，其相對豐度在SBR1中降低，在SBR2中升高，說明以淀粉為碳源的廢水環(huán)境更利于該門類微生物的生長. 淀粉進水中第一優(yōu)勢絲狀菌Thiothrix的相對豐度與乙酸鈉進水差別不大，但第二優(yōu)勢菌Haliscomenobacter的相對豐度遠高于乙酸鈉進水.

4) 在不同菌群中，2種碳源對除磷菌群的豐度影響較大. 而在不同菌屬中，作為優(yōu)勢絲狀菌的Thiothrix和Haliscomenobacter的相對豐度在2種碳源下均隨污泥膨脹的發(fā)生而增高；作為典型脫氮菌的Nitrospira以及典型除磷菌的C.Accumulibacter和C.Competibacter的相對豐度均隨污泥膨脹的發(fā)生而降低；同樣作為典型脫氮菌的Nitrosomonas以及典型菌膠團菌的Zoogloea的相對豐度則隨污泥膨脹的發(fā)生而升高.