兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量一致性評(píng)價(jià)

王 鑫鄔國(guó)松 牛 明王伽伯趙 昕韓 杰郝亞冬溫瑞卿?李東輝?

（1.北京市海淀區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100094；2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東廣州 510006）

兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根。具有祛風(fēng)通絡(luò)、勝濕止痛、消腫解毒的功效，為傳統(tǒng)常用中藥，主產(chǎn)于廣西、廣東、福建、云南等地［1］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)廣西、廣東20 批不同產(chǎn)區(qū)的兩面針?biāo)幉慕Y(jié)合2020 年版《中國(guó)藥典》［2］一部的檢驗(yàn)項(xiàng)目和HPLC 指紋圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。檢驗(yàn)項(xiàng)目包括性狀鑒別、薄層鑒別、薄層檢查，水分、灰分、浸出物、氯化兩面針堿的含量測(cè)定。原藥材的安全性、有效性及質(zhì)量的一致性［3］直接關(guān)系到藥品的安全、有效，中藥材質(zhì)量的一致性是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的一個(gè)重要方面。由于中藥材成分復(fù)雜，中藥指紋圖譜［4-7］作為綜合的、可量化的色譜鑒別手段，可以較全面的反映中藥材的藥效學(xué)物質(zhì)特征評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量，因此選擇18 批鑒定為正品的兩面針?biāo)幉慕PLC 指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和聚類分析，以期進(jìn)一步探討廣西、廣東不同產(chǎn)地的兩面針的質(zhì)量一致性，為兩面針道地藥材優(yōu)良品種質(zhì)量生物評(píng)價(jià)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器 Waters2695 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；MSA125P 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；FB15061超聲清洗儀（美國(guó)Fisher 公司）；硅膠G 薄層版（德國(guó)默克公司）；ACY-1002-U 制水機(jī)（艾科浦超純水處理有限公司）。

1.2 試劑與藥物 兩面針對(duì)照藥材（批號(hào)121014-201204，鑒別／檢查用）、氯化兩面針堿（批號(hào)110848-201604，純度91.0%）、乙氧基白屈菜紅堿（批號(hào)110847-200601，供鑒別用）、毛兩面針?biāo)兀ㄅ?hào)111531-201603，供檢查用），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲酸、三乙胺均為色譜純（美國(guó)Fisher Scientific 公司）；甲醇、乙醇、三氯甲烷、濃氨試液、石油醚（60～90 ℃）、硫酸均為分析純。藥材20 批，具體信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀特征 20 批樣品中18 批呈厚片或圓柱形短段，長(zhǎng)2～20 cm，厚0.5～10 cm。表面淡棕黃色或淡黃色，有鮮黃色或黃褐色類圓形皮孔樣斑痕。切面較光滑，皮部淡棕色，木部淡黃色，可見(jiàn)同心性環(huán)紋和密集的小孔。質(zhì)堅(jiān)硬。樣品2 中栓皮碎塊較多。樣品3、9 表面呈灰棕色，可見(jiàn)疣狀突起。

2.2 薄層鑒別及檢查

2.2.1 兩面針、氯化兩面針堿 取樣品粉末1 g，加乙醇40 mL 超聲處理1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為樣品溶液。另取兩面針對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取氯化兩面針堿對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3 種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（30∶10∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈（365 nm）下檢視。見(jiàn)圖1。

表1 樣品信息

圖1 兩面針薄層色譜鑒別（一）

對(duì)比薄層圖譜，20 份樣品與氯化兩面針堿對(duì)照品在相同的位置上均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，但是樣品3、9 可見(jiàn)綠色的熒光帶。

2.2.2 乙氧基白屈菜紅堿 取乙氧基白屈菜紅堿對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（25∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。見(jiàn)圖2。

對(duì)比薄層圖譜，20 份樣品與乙氧基白屈菜紅堿對(duì)照品在相同的位置上均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，但是樣品3、9可見(jiàn)藍(lán)色的熒光帶。

圖2 兩面針薄層色譜鑒別（二）

2.2.3 毛兩面針?biāo)?取毛兩面針?biāo)貙?duì)照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取樣品粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，超聲處理（功率200 W，頻率59 kHz）30 min，放冷，濾過(guò)，濾液置50 mL 量瓶中，濾渣和濾紙?jiān)偌?0%甲醇20 mL，同法超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液置同一量瓶中，加適量70%甲醇洗滌2 次，洗液并入同一量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，取溶液4 mL，濃縮至2 mL，作為樣品溶液。吸取上述2 種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-三氯甲烷-甲醇（2∶13∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。見(jiàn)圖3。

對(duì)比薄層圖譜，樣品3、9 的薄層色譜呈藍(lán)色的熒光條帶，且與毛兩面針?biāo)貙?duì)照品在相同的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖3 兩面針薄層色譜檢查

2.3 水分、總灰分、浸出物測(cè)定 根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 四部0832 水分測(cè)定法、2201 浸出物測(cè)定法、2302灰分測(cè)定法，檢測(cè)20 批樣品，結(jié)果見(jiàn)表2。藥典規(guī)定，水分不得超過(guò)10.0%，所有樣品均符合規(guī)定；總灰分不得超過(guò)7.0%，所有樣品均符合規(guī)定；浸出物不得少于5.5%，樣品2 小于標(biāo)準(zhǔn)，其他樣品均符合規(guī)定。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) DIONEX Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸-三乙胺（pH 4.5）（B），梯度洗脫（0～30 min，20%～50% A；30～35 min，50%～100% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm。理論板數(shù)按氯化兩面針堿計(jì)算，應(yīng)不低于2 500。

表2 樣品水分、總灰分、浸出物及含量測(cè)定結(jié)果（%）

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取氯化兩面針堿對(duì)照品10.37 mg 至20 mL 量瓶中，70%甲醇溶解至刻度，精密量取2 mL 至20 mL 量瓶中，搖勻，制成47.18 μg／mL 溶液。

2.4.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、8、10、12、16、18、20 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝593.57X+5.622（r＝0.999 9），在0.047～0.944 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 供試品溶液制備 取樣品粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加70% 甲醇20 mL，超聲處理（功率200 W、頻率59 kHz）30 min，放冷，濾過(guò)，濾液置于50 mL 量瓶中，濾渣和濾紙?jiān)偌?0%甲醇20 mL，同法超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液置于同一量瓶中，70%甲醇洗滌2 次，洗液并入同一量瓶中，70% 甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.5 測(cè)定法 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，色譜圖見(jiàn)圖4，外標(biāo)法計(jì)算氯化兩面針堿含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

藥典規(guī)定，按照干燥品計(jì)算，氯化兩面針堿含量不得少于0.13%，而樣品3、9、10、11、12、14 均低于0.13%。

圖4 氯化兩面針堿HPLC 色譜圖

2.5 兩面針HPLC 指紋圖譜建立

2.5.1 色譜條件 DIONEX Acclaim C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 甲酸-三乙胺（pH 4.5）（B），梯度洗脫（0～30 min，20%～50%A；30～35 min，50%～100%A，36～45 min，80%～20%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm。

2.5.2 對(duì)照品、供試品溶液制備 分別按“2.4.2”“2.4.3”項(xiàng)下方法制備。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（樣品18），在“2.5.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.1 版本）軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果均≥0.999（RSD＜0.05%），表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（樣品18），在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，24 h 內(nèi)每間隔4 h 測(cè)定1 次，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.1版本）軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果均≥0.997（RSD ＜0.15%），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份藥材粉末（樣品18）各1 g，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.1 版本）軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果均≥0.989（RSD＜0.5%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 圖譜生成 取18 批經(jīng)鑒定為正品的藥材，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.1 版本）軟件進(jìn)行處理，選擇S18 號(hào)樣品色譜為參照指紋圖譜。為減小極端數(shù)據(jù)的影響，選擇中位數(shù)法作為對(duì)照指紋圖譜的生產(chǎn)方法，運(yùn)用手動(dòng)多點(diǎn)校正方法對(duì)色譜峰進(jìn)行譜圖匹配，見(jiàn)圖5，建立共有模式。再用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰，結(jié)果確定了15個(gè)共有峰，見(jiàn)圖6。

圖5 18 批兩面針?biāo)幉腍PLC 指紋圖譜

圖6 兩面針?biāo)幉墓灿心Ｊ綀D譜

2.5.7 兩面針指紋圖譜評(píng)價(jià)

2.5.7.1 相似度評(píng)價(jià) 對(duì)18 批已處理的指紋色譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3，可知相似度范圍為0.647～0.993，表明藥材質(zhì)量存在一定的差異；除S12、S20 相似度低于0.85 外，其他樣品均大于0.85。

表3 18 批樣品相似度（編號(hào)和含量測(cè)定等的編號(hào)保持一致，除去非正品樣品3 和9）

2.5.7.2 聚類分析 通過(guò)稱樣量量化，將18 批樣品的指紋圖譜的共有峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，組成18 階×15 階原始數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用iTOL 在線分析軟件，選用平均組間連接聚類方法，利用平方歐式距離法作為樣品間距計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類結(jié)果見(jiàn)圖7。

18 批兩面針?biāo)幉目煞譃? 類，S1、S4、S8、S16～S17為Ⅰ類，S2、S6、S10、S18 為Ⅱ類，S5、S7、S11、S13～S15、S19 為Ⅲ類，S12 為Ⅳ類，S20 為Ⅴ類。

圖7 18 批樣品系統(tǒng)聚類樹(shù)

3 討論

性狀和薄層色譜鑒別是鑒定中藥材真?zhèn)蔚闹匾侄巍?duì)20 批不同產(chǎn)地的兩面針樣品進(jìn)行檢驗(yàn)和分析。薄層色譜鑒別出樣品3、9 均含有毛兩面針?biāo)?，且表皮灰棕色具有疣狀突起，性狀與飛龍掌血藥材一致［8］，推斷兩者可能為飛龍掌血［8-10］。

中藥材的有效成分為植物的次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與生長(zhǎng)環(huán)境有密切關(guān)系。生態(tài)環(huán)境條件的不同，可能導(dǎo)致相同品種藥用植物次生代謝過(guò)程的變化，影響同一品種藥材的內(nèi)在質(zhì)量［11-12］。本文對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的兩面針?biāo)幉?，分別測(cè)定了水分、灰分、浸出物及氯化兩面針堿的含量。1 批樣品的浸出物含量未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，4 批樣品的含量未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，不同產(chǎn)地的兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量有差異。

由于中藥材成分復(fù)雜，單一成分的含量不能全面的評(píng)價(jià)中藥材的質(zhì)量。因此對(duì)其他18 批鑒定為兩面針的樣品建立HPLC 指紋圖譜，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)和聚類分析進(jìn)一步探討比較樣品間的整體化學(xué)成分的一致程度。相似度評(píng)價(jià)和聚類分析結(jié)果基本一致，因此，以上樣品可以分為五類，S12 為一類，S20 為一類，S1、S4、S8、S16～S17 為一類，S2、S6、S10、S18 為一類，S5、S7、S11、S13～S15、S19為一類。由此可見(jiàn)，廣東、廣西兩省之間及產(chǎn)自越南的野生兩面針?biāo)幉木鶡o(wú)明顯的地域性差異。

S8、S16 為產(chǎn)自廣西大新的野生樣品，僅采集時(shí)間不同，薄層色譜、液相圖譜、相似度評(píng)價(jià)和聚類分析結(jié)果顯示兩種樣品的質(zhì)量具有較高的一致性；S11 和S13 及S14 皆產(chǎn)自廣東且聚為一類，其中S11 和S13 同為廣東平遠(yuǎn)縣的栽培品種，分析結(jié)果顯示兩種樣品的質(zhì)量也具有較高的一致性；對(duì)于整體而言，雖然廣東、廣西作為兩面針?biāo)幉牡牡赖禺a(chǎn)地，大部分地區(qū)藥材的化學(xué)成分基本一致，栽培品種和野生品種也無(wú)明顯差異，但是以上數(shù)據(jù)顯示，來(lái)源（栽培／野生和產(chǎn)地）的統(tǒng)一更有利于保證兩面針?biāo)幉牡馁|(zhì)量一致性。

S11、S12、S13、S14 為不同地區(qū)的栽培品種，栽培年限分別為5.5、3、6.5、5 年，其中只有栽培6.5 年的樣品其氯化兩面針堿的含量高于藥典標(biāo)準(zhǔn)。有文獻(xiàn)報(bào)道氯化兩面針的含量與不同的生長(zhǎng)期有密切關(guān)系［13-14］，提示由于生長(zhǎng)年限不足導(dǎo)致了S11、S12、S14 中氯化兩面針堿的含量偏低，栽培年限是影響栽培品種質(zhì)量的重要因素。

綜上所述，不同產(chǎn)地來(lái)源的兩面針存在一定的差異，S1、S4～S8、S13、S15～19，按藥典檢驗(yàn)符合規(guī)定，通過(guò)指紋圖譜和聚類分析表明這12 批兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量具有較高的一致性。建立的兩面針的HPLC 指紋圖譜可有效反映出兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量的一致性。