益景湯對糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的影響

劉光輝，張云輝，鄭永征，潘銘東，孟春，徐朝陽

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）最為常見的微血管并發(fā)癥之一，是全球主要的不可逆性致盲性眼病，需要進(jìn)行早期防治。血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier,BRB）損害是DR 的早期表現(xiàn)，是DR 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[1]。BRB 損害是目前DR 早期防治研究的熱點(diǎn)。益景湯（原名加味補(bǔ)陽還五湯）是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院眼科針對DR 氣陰兩虛夾瘀病機(jī)設(shè)計用于DR 早期防治的驗(yàn)方。既往臨床研究中觀察到益景湯能夠改善DR 患者視網(wǎng)膜微循環(huán)、減輕黃斑水腫[2-3]，基礎(chǔ)研究中顯示益景湯能夠抑制DM 大鼠BRB構(gòu)成細(xì)胞的凋亡、減緩視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的減少[4-5]。本次研究采用益景湯干預(yù)DM 大鼠，觀察了其對視網(wǎng)膜微血管滲漏性及BRB 緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討了益景湯用于DR 早期防治的效應(yīng)及機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性清潔級6 周齡SD 大鼠45 只，屈光間質(zhì)透明，體重200±20 g，購買自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于21～25℃環(huán)境，相對濕度為50%～55%。普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12 h／12 h 明暗交替光照。實(shí)驗(yàn)動物的處理按國家科學(xué)技術(shù)委員會1988 年頒布的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

1.2 藥物、主要試劑及儀器

益景湯（黃芪15 g、山藥15 g、蒼術(shù)9 g、桃仁5 g、紅花5 g、當(dāng)歸9 g、川芎6 g、赤芍10 g 等），每劑濃煎至50 mL 備用，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥劑科；鏈脲佐菌素（streptozotoci，STZ）購于美國Thermo Fisher 公司；抗封閉蛋白（occludin）抗體、抗連接蛋白5（claudin-5）抗體、抗閉鎖連接蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）抗體購自美國abcam 公司；伊凡思藍(lán)（evans blue，EB）購自上海生工生物公司；倒置熒光顯微鏡（TE2000-S）購自日本Nikon公司。

1.3 分組及模型制作

45 只SD 大鼠按簡單數(shù)字隨機(jī)法分為3組：正常組、DM組、益景湯組，每組15 只。除正常組外，其余2組大鼠被制成DM 模型。臨用前以0.1 mmol/L、pH4.5檸檬酸緩沖液溶解STZ，配置成1%溶液。將大鼠禁食12 h 后，按60 mg/kg 劑量于左下腹腔內(nèi)一次性注射STZ。正常組注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。72 h后取尾血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L 大鼠為造模成功。造模成功后每周監(jiān)測血糖1 次，觀察大鼠一般狀況。

1.4 干預(yù)方法

益景湯組予益景湯水煎液灌胃，按方劑飲片合劑量10.71 g／（kg·d）計算，取原藥煎液1.35 mL，加蒸餾水稀釋至3 mL，一次性灌胃，每日1 次。DM組和正常組采用PBS 緩沖液3 mL 灌胃，每日1 次。干預(yù)自造模成功后開始持續(xù)至16 周末。干預(yù)結(jié)束后，麻醉處死大鼠，摘取眼球，按下述蛋白免疫印跡法（western blotting，WB）要求提取蛋白。

1.5 EB 活體灌注視網(wǎng)膜鋪片

大鼠麻醉后，于尾靜脈注射5%EB 染色液1 mL，直至大鼠通體變藍(lán)，處死大鼠摘取眼球，4%多聚甲醛中固定4 h，在體視顯微下剪開角膜緣，分離出視網(wǎng)膜，剪成4 瓣展開平鋪于載玻片上，抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡460 nm 波長激發(fā)光下觀察EB滲漏情況。

1.6 WB 法檢測occludin、claudin-5、ZO-1 蛋白的表達(dá)

提取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，加入含有RIPA 裂解液對視網(wǎng)膜組織進(jìn)行勻漿。勻漿結(jié)束后離心、定量，制備蛋白上樣品。行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育及顯影。采用Gel-Pro Analyzer 4 分析條帶光密度值，獲取目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad 6 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜微血管滲透性

在16 周末，正常組大鼠無明顯BRB 損害，鏡下見視網(wǎng)膜微血管管徑均勻、管跡清晰，未見明顯熒光滲漏（圖1A）。DM組大鼠存在明顯的BRB 損害，鏡下見視網(wǎng)膜微血管管徑欠均勻、管跡模糊、局灶性擴(kuò)張，存在節(jié)段性中小血管熒光滲漏及廣泛的毛細(xì)血管熒光滲漏，未見毛細(xì)血管無灌注區(qū)（圖1B）。益景湯組大鼠存在輕度BRB 損害，鏡下見大部分視網(wǎng)膜微血管管徑均勻、管跡清晰，少量毛細(xì)血管局灶性擴(kuò)張，節(jié)段性中小血管熒光滲漏及少量的毛細(xì)血管熒光滲漏，未見毛細(xì)血管無灌注區(qū)（圖1C）。

圖1 各組視網(wǎng)膜微血管滲透性。1A 正常組，視網(wǎng)膜微血管管徑均勻、管跡清晰，未見明顯熒光滲漏；1B DM組，視網(wǎng)膜微血管管徑欠均勻、管跡模糊、局灶性擴(kuò)張，節(jié)段性中小血管熒光滲漏及廣泛的毛細(xì)血管熒光滲漏；1C 益景湯組，大部分視網(wǎng)膜微血管管徑均勻、管跡清晰，有節(jié)段性中小血管熒光滲漏及少量的毛細(xì)血管熒光滲漏。DM 糖尿病

2.2 視網(wǎng)膜occludin、claudin-5、ZO-1 蛋白的表達(dá)

occludin：DM組和益景湯組表達(dá)量均下降，3組間比較，F(xiàn)=285.300，P=0.000，有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較，正常組的表達(dá)量明顯高于DM組（t=23.568,P=0.000）、益景湯組（t=16.068,P=0.000），而益景湯組高于DM組（t=5.539，P=0.000），均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

claudin-5：DM組和益景湯組的表達(dá)量均下降，3組間比較，F(xiàn)=116.791，P=0.000，有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較，正常組的表達(dá)量明顯高于DM組（t=17.447,P=0.000）、益景湯組（t=8.422,P=0.000），而益景湯組高于DM組（t=5.466，P=0.000），均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

ZO-1：DM組和益景湯組的表達(dá)量均下降，3組間比較，F(xiàn)=198.236，P=0.000，有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較，正常組的表達(dá)量明顯高于DM組（t=21.365,P=0.000）、益景湯組（t=13.329,P=0.000），而益景湯組高于DM組（t=3.325，P=0.008），均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中occludin、claudin-5 和ZO-1 蛋白的相對表達(dá)量（，n=5）

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中occludin、claudin-5 和ZO-1 蛋白的相對表達(dá)量（，n=5）

注：* 與正常組相較，P＜0.05；# 與DM組相較，P＜0.05。occludin封閉蛋白；claudin-5 連接蛋白5；ZO-1 閉鎖連接蛋白1

3 討論

DR 是臨床常見的致盲性視網(wǎng)膜血管性疾病，視網(wǎng)膜微血管損害是DR 的重要病理表現(xiàn)[6]。在DR中，視網(wǎng)膜微血管損害的發(fā)生遠(yuǎn)早于肉眼可見的視網(wǎng)膜病變。視網(wǎng)膜微血管在長期代謝異常所致的缺血缺氧的環(huán)境下可出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞喪失、基底膜增厚及視網(wǎng)膜血流動力學(xué)變化等改變，直接表現(xiàn)為BRB 結(jié)構(gòu)完整性的破壞及滲透性的增加[7]。

BRB 是一種生理屏障，具有調(diào)節(jié)離子、蛋白質(zhì)和水進(jìn)出視網(wǎng)膜的功能[8]。BRB 分為血-視網(wǎng)膜外屏障（outer blood-retinal barrier,oBRB）和血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障（inner blood-retinal barrier,iBRB）2 種亞型。其中oBRB 由脈絡(luò)膜毛細(xì)血管、視網(wǎng)膜色素上皮及細(xì)胞間的連接構(gòu)成，iBRB 由內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、基底膜及細(xì)胞間的連接構(gòu)成。在正常生理狀態(tài)下，BRB 屏障可以調(diào)控血管內(nèi)液體和離子進(jìn)入視網(wǎng)膜，阻止血細(xì)胞及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)入視網(wǎng)膜。在高糖、缺氧、炎癥等病理?xiàng)l件下，細(xì)胞間連接可以受到破壞，BRB 滲透性增加，導(dǎo)致進(jìn)入視網(wǎng)膜的液體過多及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)異常滲漏，引起黃斑水腫。在臨床中，黃斑水腫可以發(fā)生于含早期在內(nèi)任何一期DR[9-10]。動物實(shí)驗(yàn)表明，1 個月期糖尿病模型大鼠即可以發(fā)生BRB 損害，出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管滲漏[11]。

EB 可以檢測BRB 的損害。EB 是一種生物染色劑，注射入血管后，可以與血漿白蛋白緊密結(jié)合。視網(wǎng)膜微血管正常時，BRB 可以阻止其透過血管滲漏到視網(wǎng)膜組織中。當(dāng)BRB 發(fā)生損害時，通透性增加，EB 與白蛋白的復(fù)合物則可以滲漏到血管外，被觀測到[12]。故可以用于BRB 損害的定量或者定性檢測。本次研究觀察發(fā)現(xiàn)16 周末的DM組大鼠視網(wǎng)膜微血管存在廣泛的EB 滲漏，而益景湯組大鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏程度輕，僅見節(jié)段性中小血管熒光滲漏及少量的毛細(xì)血管熒光滲漏，提示益景湯對DM 大鼠BRB 損害具有保護(hù)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證益景湯對DM 大鼠BRB 保護(hù)作用的機(jī)制，研究檢測了BRB 緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)。

緊密連接又稱閉鎖小帶，是BRB 細(xì)胞間多種連接形式中的一種，其廣泛位于內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞間隙的頂端，能機(jī)械連接相鄰細(xì)胞，封閉細(xì)胞頂部的間隙，阻擋胞外蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi)[13]。緊密連接本質(zhì)是一種蛋白復(fù)合體，構(gòu)成蛋白有occludin、claudin、ZO、連接粘附分子JAM 等[14]。其中occludin 及claudin 為跨膜蛋白，同時具有胞內(nèi)環(huán)和胞外環(huán)，胞外環(huán)以“拉鏈”狀結(jié)合封閉細(xì)胞間間隙，胞內(nèi)環(huán)則與胞內(nèi)ZO 蛋白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的支架結(jié)合，參與維持和調(diào)節(jié)極性細(xì)胞的屏障功能[13]。claudin-5 廣泛表達(dá)于BRB，是claudin 中的內(nèi)皮細(xì)胞特異型，具有離子選擇性。ZO-1 則常見于內(nèi)皮細(xì)胞的閉鎖小帶中。結(jié)構(gòu)蛋白是BRB 發(fā)揮屏障功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，BRB 通過這些連接蛋白調(diào)控液體和分子的運(yùn)動，維持視網(wǎng)膜的正常功能。當(dāng)?shù)鞍椎谋磉_(dá)量發(fā)生變化時，BRB 的通透性將會受到影響。

在早期DR 中，occludin、claudin-5、ZO-1等緊密連接相關(guān)蛋白的損傷是BRB 被破壞的核心因素之一。Leal 等[11]觀察到Wistar 大鼠經(jīng)STZ 造模成功后1 個月，視網(wǎng)膜組織中occludin、claudin-5、ZO-1蛋白表達(dá)即下降，BRB 通透性增加。雷曉琴等[15]發(fā)現(xiàn)SD 大鼠DM 造模成功后12 周，視網(wǎng)膜滲漏增加，occludin、ZO-1 蛋白的表達(dá)量較正常組減少了約50%。本次研究觀察到16 周末DM組大鼠occludin、claudin-5、ZO-1 表達(dá)量下降，與既往研究結(jié)果類似。這一結(jié)果表明，可以干預(yù)BRB 損害來進(jìn)行DR 早期防控。

目前已有很多針對DM 視網(wǎng)膜BRB 損害進(jìn)行干預(yù)的藥物研究，如抗VEGF 藥物、糖皮質(zhì)激素、重組人血管內(nèi)皮抑素、促紅細(xì)胞生成素及中醫(yī)藥等[15-18]。這些研究結(jié)果均證實(shí)，增加occludin、claudin-5、ZO-1等緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)量，可以實(shí)現(xiàn)BRB 的保護(hù)效應(yīng)。益景湯是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院眼科針對DR 氣陰兩虛夾瘀病機(jī)設(shè)計用于DR 早期防治的驗(yàn)方，由補(bǔ)陽還五湯化裁而來，具有益氣養(yǎng)陰、通絡(luò)明目之效果。既往臨床中觀察到益景湯能夠改善DR 患者視網(wǎng)膜微循環(huán)、減輕黃斑水腫[2-3]，基礎(chǔ)研究中觀察到益景湯能夠抑制DM 大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞凋亡、減緩視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的減少[4-5]。本次研究觀察到益景湯能夠抑制DM 所引起的視網(wǎng)膜組織中occludin、claudin-5、ZO-1 等緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)量的下降，表明益景湯減輕DM 大鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏的作用機(jī)制與其抑制上述蛋白的表達(dá)量下降、保護(hù)BRB 有關(guān)。

綜上所述，BRB 損害是早期DR 的重要特征，益景湯能夠抑制DM 大鼠視網(wǎng)膜組織中occludin、claudin-5、ZO-1 等緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)量下降，降低BRB 的損害，減輕視網(wǎng)膜微血管的滲漏，對早期DR 具有防治作用。