尿石素A改善高糖致血管內(nèi)皮損傷的作用與機(jī)制

鄧智琴，楊永健，2

（1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610000；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，成都 610083）

糖尿病是一種慢性進(jìn)展性內(nèi)分泌疾病，持續(xù)高糖及長(zhǎng)期代謝紊亂可致血管病變［1］，而動(dòng)脈粥樣硬化的加速形成是血管病變的基礎(chǔ)，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。研究表明，氧化應(yīng)激是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的重要致病機(jī)制［2］，高糖可造成活性氧簇的大量積累，超過內(nèi)源性抗氧化酶的清除能力，形成氧化應(yīng)激狀態(tài)并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷是防治糖尿病血管病變的關(guān)鍵途徑［3］。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是參與細(xì)胞脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶，與糖尿病患者的氧化應(yīng)激、胰島素抵抗和自噬等密切相關(guān)［4-5］，其失調(diào)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙中起關(guān)鍵作用［6-7］。尿石素A（uro?lithin A，UA）是人體攝入主要由富含鞣花單寧的食物（石榴、草莓、核桃等）經(jīng)體內(nèi)腸道代謝產(chǎn)生，除了在抗炎、誘導(dǎo)自噬方面發(fā)揮積極的生物功效［8-10］，其抗氧化作用在急性腎損傷［11］、心肌缺血再灌注損傷［9］、神經(jīng)退行性疾病［12］等相關(guān)研究中也已明確證實(shí)，并且可以通過激活A(yù)MPK 發(fā)揮對(duì)阿爾茲海默病神經(jīng)元的保護(hù)作用［13］。但UA 在糖尿病血管病變中的作用，以及其作用是否與AMPK/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路的激活有關(guān)暫無報(bào)道。為此，本研究通過高糖培養(yǎng)基處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株模擬高糖損傷，以研究UA 對(duì)高糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平和血管內(nèi)皮功能的影響，并初步探討了其相關(guān)的機(jī)制，為糖尿病血管病變的防治提供新的理論依據(jù)和治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922EA.hy926 購于美國ATCC 細(xì)胞庫；DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；D-（+）-葡萄糖溶液（美國Sigma 公司）；UA、Dorsomorphin（Compound C，Com C）dihydrochloride（美國Abmole 公司）；CCK8 檢測(cè)試劑盒（索萊寶生物科技公司）；人細(xì)胞上清內(nèi)皮素（endothelin-1，ET-1）酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）；一氧化氮檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒及二氫乙錠（dihydroethidium，DHE）熒光探針（上海碧云天生物科技公司）；細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體、AMPK抗體、p-eNOS（Ser1177）抗體及p-AMPK（Thr172）抗體（Affinity 公司）；GAPDH（武漢三鷹公司）。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 內(nèi)皮細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基于37℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合生長(zhǎng)達(dá)到約90%，用0.25%胰酶消化按1∶2傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種24 h 后換液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 為探討不同濃度UA 對(duì)高糖下內(nèi)皮細(xì)胞存活的影響，UA 干預(yù)做濃度梯度分別為（0.1、1、10、50 μmol）。實(shí)驗(yàn)分組處理如下：（1）正常對(duì)照組（normal glucose，NG：含5.5 mmol 葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基）；（2）高糖對(duì)照組（high glucose，HG：含33 mmol 葡萄糖的高糖培養(yǎng)基）；（3）高糖+UA 組（HG+UA：高糖培養(yǎng)基+UA 10 μmol 孵育）；（4）高糖+UA+Compound C 組（HG+UA+Com C：高糖培養(yǎng)基+UA 10 μmol+Com C 1 μmol 孵育）；干預(yù)時(shí)間為24 h。

1.2.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞存活 96 孔板貼壁細(xì)胞干預(yù)完后，向每孔加入10 μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算并評(píng)價(jià)細(xì)胞相對(duì)存活。

1.2.4 細(xì)胞上清一氧化氮濃度檢測(cè) 待細(xì)胞處理結(jié)束，培養(yǎng)基1 000g離心10 min取上清備用。96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，與NADPH（2 mmol）、FAD和Nitrate Reductase 混勻后，37 ℃孵育30 min；加入乳酸脫氫酶緩沖液和乳酸脫氫酶混勻后，37 ℃孵育30 min；加入Griess Reagent I 和Griess ReagentⅡ混勻后，室溫（20 ℃～30 ℃）孵育10 min 后立即用酶標(biāo)儀在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值并分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 細(xì)胞上清內(nèi)皮素-1濃度檢測(cè) ET-1濃度采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)，樣品制備同1.2.4。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別加入反應(yīng)孔中，與親和鏈酶素-HRP 混勻后在37℃溫育60 min；洗板5 次；加入底物A、B 后37℃避光溫育15 min；加入終止液后立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度并分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 二氫乙錠染色檢測(cè)活性氧簇生成 細(xì)胞干預(yù)完后，以5 μmol 的DHE 染色液37 ℃避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液溶液洗滌，經(jīng)熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 超氧化物歧化酶活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按照試劑盒說明書推薦的操作步驟收集細(xì)胞，氮藍(lán)四唑（NBT）顯色法測(cè)定SOD 活性（U/mL），37 ℃孵育30 min 后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)560 nm 處測(cè)定各孔吸光度值并計(jì)算SOD 相對(duì)活性。

1.2.8 蛋白免疫印跡 細(xì)胞加入裂解液，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。將30 μg 變性好的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠，利用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉1 h后，一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，掃膜成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 6.0 軟件制圖。計(jì)量資料用（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿石素A 明顯提高高糖誘導(dǎo)條件下內(nèi)皮細(xì)胞存活

CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖明顯降低了細(xì)胞存活（P＜0.05），UA（1 μmol～10 μmol）呈劑量依賴性提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活。10 μmol 和50 μmol 無明顯差異（P＞0.05）（圖1），后續(xù)實(shí)驗(yàn)UA 干預(yù)濃度取10 μmol。

圖1 不同干預(yù)分組下內(nèi)皮細(xì)胞存活比較（HG：高糖培養(yǎng)基處理；UA：處理高糖組與正常組相比，aP＜0.05；UA 處理組與高糖組相比，bP＜0.05，ns：P＞0.05）

2.2 尿石素A 改善高糖環(huán)境所致血管內(nèi)皮功能障礙

通過檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO 和ET-1 的分泌量，我們?cè)u(píng)估了UA 對(duì)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮功能的影響。與正常對(duì)照組比較，高糖明顯降低NO 的分泌量（P＜0.05），提高ET-1 的分泌量（P＜0.05）；加入U(xiǎn)A（10 μmol）后，NO 的分泌量明顯升高（P＜0.05），ET-1 的分泌量降低（P＜0.05）。而UA 的調(diào)節(jié)作用在同時(shí)給予AMPK 的抑制劑后消失（圖2）。

2.3 尿石素A 降低高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平

從DHE 熒光染色［檢測(cè)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成］結(jié)果及熒光定量分析和SOD活性結(jié)果來看，與正常對(duì)照組比較，高糖環(huán)境使血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 水平顯著升高，SOD 活性降低（P＜0.05）；UA孵育明顯減少ROS的水平和增加SOD活性（P＜0.05）；上述作用在同時(shí)給予AMPK 的抑制劑Com C后明顯減弱（P＜0.05）（圖3）。

圖2 UA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO和ET-1的影響（A：內(nèi)皮細(xì)胞上清NO 濃度，B：內(nèi)皮細(xì)胞上清ET-1 濃度）注：HG 組與NG 組相比，aP＜0.05；HG+UA 組與HG 組相比，bP＜0.05；HG+UA+Com C 組與HG+UA 組相比，cP＜0.05

2.4 尿石素A 激活A(yù)MPK/eNOS 通路改善高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷

在進(jìn)一步的機(jī)制探討中，我們通過蛋白免疫印跡檢測(cè)UA 對(duì)AMPK/eNOS 信號(hào)通路的影響，相應(yīng)蛋白磷酸化水平由p-AMPK/AMPK、p-eNOS/eNOS體現(xiàn)。結(jié)果顯示與正常組比較，高糖干預(yù)的內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK、eNOS 磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）；UA 則可以有效逆轉(zhuǎn)AMPK、eNOS 磷酸化水平改變（P＜0.05）；但該作用可被AMPK 的抑制劑所拮抗（P＜0.05），見圖4。以上結(jié)果表明，UA 可能通過激活A(yù)MPK/eNOS 通路改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

3 討論

近年來，我國糖尿病發(fā)病率逐年上升，糖尿病誘發(fā)的血管病變嚴(yán)重危害著糖尿病患者后期的生存質(zhì)量。糖尿病的發(fā)生伴有糖脂代謝紊亂，而血糖的增高和游離脂肪酸的增多均可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖損傷至關(guān)重要。

圖3 各組內(nèi)皮細(xì)胞ROS 水平及SOD 活性比較（A：DHE 熒光染色，×400；B：相對(duì)熒光強(qiáng)度定量；C：SOD 相對(duì)活性）注：HG 組與NG組相比，aP＜0.05；HG+UA 組與HG 組相比，bP＜0.05；HG+UA+Com C 組與HG+UA 組相比，cP＜0.05

高糖環(huán)境下，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位震蕩，NADPH 氧化酶活性增高，生成大量的ROS，破壞線粒體，使其功能嚴(yán)重失調(diào)，加劇氧化應(yīng)激狀態(tài)。血管內(nèi)皮細(xì)胞能分泌多種活性物質(zhì)來發(fā)揮舒縮血管、調(diào)節(jié)血管通透性、抗凝抗血栓等重要功能［14-15］，其中NO 具有舒張血管、抗血小板聚集的作用；ET-1具有收縮血管，促血小板黏附的作用，是內(nèi)皮依賴性血管舒縮作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。生理情況下，NO 與ET-1 處于動(dòng)態(tài)平衡水平，維持血管張力。在高糖環(huán)境下，其平衡被打破，ET-1 可以通過激活ETA/ETB 受體，增加內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基的生成［16］，內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷，引發(fā)血管病變。

AMPK 在許多信號(hào)通路的占核心地位［17-18］，在內(nèi)皮細(xì)胞中，AMPK/eNOS通路的激活，通過Ser1177位點(diǎn)激活eNOS 磷酸化，增加NO 的釋放量，提高內(nèi)皮細(xì)胞功能［19-20］，還通過拮抗ET-1 濃度升高導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)作用。此外，已經(jīng)研發(fā)用于治療2 型糖尿病的藥品，如二甲雙胍［21］，噻唑烷二酮（TZD）［22］和胰高血糖素樣肽-1 受體激動(dòng)劑［23］，均能激活A(yù)MPK，證明可用于預(yù)防糖耐量降低，延緩2 型糖尿病的進(jìn)展。

UA 是經(jīng)腸道菌群代謝生成的一類具有不同酚輕基的二苯并喃-6-酮衍生物，具有較高的生物利用度，對(duì)于多種疾病模型發(fā)揮積極的生物功效。Ryu 等［24］報(bào)道，UA 通過誘導(dǎo)線粒體自噬改善線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)，口服UA 可以延長(zhǎng)線蟲壽命和改善小鼠骨骼肌功能。石榴汁可改善患有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊邞?yīng)激誘導(dǎo)的心肌缺血［25］并抑制巨噬細(xì)胞膽固醇和氧化脂質(zhì)的積聚，減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展以及控制其隨后的心血管事件的發(fā)生［26］。最新研究證實(shí)，UA 可以直接清除自由基，保護(hù)Neuro-2a（神經(jīng)-2a）細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮氧化酶抑制劑的效果，清除氧自由基，明顯改善抗氧化酶（SOD、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶等）的活性［22］，提示UA在對(duì)抗氧化應(yīng)激方面有非常大的潛在價(jià)值。UA可以通過激活A(yù)MPK信號(hào)蛋白，促進(jìn)髓核（NP）細(xì)胞線粒體自噬，抑制凋亡，減弱椎間盤退行性變［27］；在阿爾茲海默病模型中，通過增強(qiáng)腦神經(jīng)元AMPK激活，產(chǎn)生抗炎和神經(jīng)元保護(hù)作用，改善認(rèn)知能力［13］。

以上研究表明，UA 具有抗氧化應(yīng)激的活性，且其發(fā)揮生物功效與AMPK 的激活相關(guān)聯(lián)，但其在糖尿病血管病變中的作用，以及其作用是否與AMPK的激活有關(guān)，國內(nèi)外目前無相關(guān)的報(bào)道。

本研究證實(shí)，UA 可顯著減輕高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 水平的升高，促進(jìn)eNOS 的磷酸化，通過維持NO/ET-1 的平衡而對(duì)血管舒縮、血小板聚集等生理活動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)抗高糖致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；上述UA 的所有保護(hù)作用幾乎都被AMPK 的抑制劑Com C 所消除，提示UA 的保護(hù)作用可能通過激活A(yù)MPK/eNOS 通路，上調(diào)其磷酸化有關(guān)。

綜上所述，UA 能夠抑制高糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，改善血管內(nèi)皮功能障礙，顯著拮抗高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷，有望成為糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供新的干預(yù)手段，亦可為日后的相關(guān)研究提供思路。