HPLC法同時測定葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉的含量

李梓瑩

葡萄糖酸鈣鋅口服溶液是以苯甲酸鈉為防腐劑，由葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅和鹽酸賴氨酸組成的復(fù)方制劑，臨床多用于治療因缺鈣、缺鋅引起的疾病，包括佝僂病、小兒生長發(fā)育遲緩、食欲缺乏、厭食癥等[1]。其中鹽酸賴氨酸為人體必需氨基酸，可促進(jìn)鈣吸收，增加骨結(jié)合蛋白的含量，促進(jìn)身體生長發(fā)育，還對腦組織缺血、缺氧性疾病有保護(hù)作用，可調(diào)節(jié)體內(nèi)氮代謝平衡[2]。目前鹽酸賴氨酸的測定方法多為衍生化[3]或梯度洗脫[4]的高效液相色譜法(HPLC)，存在操作繁瑣、分析時間長、衍生物試劑不易得到等問題。苯甲酸鈉價廉易得，但其毒副作用隨著其廣泛應(yīng)用也日漸突出，比如具有紡錘體毒劑的作用，存在基因遺傳毒性[5]、導(dǎo)致染色體斷裂，對哺乳動物骨髓細(xì)胞具有致突變作用[6]，可能影響動物受精過程，存在生殖毒性，有輕度的積蓄作用等[7]，大量飲用含苯甲酸鈉防腐劑的飲料會刺激胃腸道，影響鈣的吸收，誘發(fā)急性蕁麻疹、血管性水腫，導(dǎo)致大腦嚴(yán)重萎縮[8-10]。國外已經(jīng)開始禁止苯甲酸鈉的使用，但國內(nèi)仍在食品和藥物制劑中作為防腐劑被廣泛使用[4]。

《中國藥典》暫未收載葡萄糖酸鈣鋅口服溶液這一品種劑型，且無相關(guān)文獻(xiàn)收載有關(guān)葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中苯甲酸鈉的量的控制測定方法。鑒于苯甲酸鈉的量會影響該藥的吸收及療效，甚至有可能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，臨床上該藥除成人外也用于嬰幼兒，嬰幼兒多體弱，故檢測葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中苯甲酸鈉含量十分必要。本文建立HPLC分析方法，同時測定葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸和苯甲酸鈉的含量，并進(jìn)行相關(guān)的方法學(xué)研究及考察，操作快捷簡便、專屬性強，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀Chemstation色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司，MT5型電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司(精度:0.001 mg)。

1.2 試藥 鹽酸賴氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：140673-201509)，苯甲酸鈉對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100433-201702)；葡萄糖酸鈣鋅口服溶液(由湖北福人金身藥業(yè)有限公司、澳洛(中國)制藥有限公司、湖北午時藥業(yè)股份有限公司提供)，乙腈為色譜純，德國默克公司；磷酸、磷酸氫二鉀、辛烷磺酸鈉為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zobarx C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相K2HPO4緩沖液(取K2HPO42.2822 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml，用H3PO4調(diào)pH值至4.8，加1.08 g辛烷磺酸鈉)—乙腈(90∶10)，流速1.0 ml/min，檢測波長203 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備：取本品3 ml(約相當(dāng)于鹽酸賴氨酸30 mg)，置100 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。

2.2.2 對照品溶液的制備：取鹽酸賴氨酸對照品6 mg、苯甲酸鈉對照品1 mg，置20 ml量瓶中，加水超聲溶解并定容至刻度，搖勻，制成每毫升中約含0.3 mg/ml鹽酸賴氨酸及0.05 mg/ml苯甲酸鈉的溶液。

2.2.3 陰性空白溶液的制備：取處方量輔料，加水?dāng)嚢枞芙?，加入處方量葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅攪拌溶解后加水定容至最終體積；取上述溶液3 ml，置100 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為陰性空白溶液。

2.3 檢測限及定量限

2.3.1 檢測限：檢測限溶液配制：分別取鹽酸賴氨酸線性1溶液、苯甲酸鈉線性1溶液逐步稀釋。以S/N=3計算，鹽酸賴氨酸檢測限為4.211 μg/ml，苯甲酸鈉檢測限為0.0754 μg/ml。

2.3.2 定量限：分別取鹽酸賴氨酸線性1溶液、苯甲酸鈉線性1溶液，作為各自組分的檢測限溶液。以S/N=10計算，鹽酸賴氨酸定量限為20.39 μg/ml，苯甲酸鈉定量限為0.1142 μg/ml。

2.4 耐用性試驗 本文考察3種不同廠牌和型號的色譜柱：(1)Agilent Zobarx C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(2)Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(3)Inersil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)主成分峰形均良好(鹽酸賴氨酸理論塔板數(shù)均≥7 000，苯甲酸鈉理論塔板數(shù)均≥4 000)，且能達(dá)到較好的分離效果，表明該方法耐用性較好。

2.5 線性關(guān)系考察

2.5.1 鹽酸賴氨酸線性范圍：取鹽酸賴氨酸對照品50.397 mg，置25 ml量瓶中，加水溶解后，加水定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。再精密量取3、3、1、3、3、3 ml分別置200、100、20、20、10、5 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得線性試驗用系列濃度的溶液。按濃度從小到大的順序取各溶液分別進(jìn)樣10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=3.47650×102X-0.3784，相關(guān)系數(shù)r=1.0000(n=6)。結(jié)果表明，鹽酸賴氨酸濃度在0.03～1.21 mg/ml范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 苯甲酸鈉線性范圍：取苯甲酸鈉對照品6.174 mg，置25 ml量瓶中，加水溶解后，加水定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。再精密量取2、2、2、2、2、4 ml分別置50(再精密量取1 ml置25 ml量瓶)、250、50、10、5、5 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得線性試驗用系列濃度的溶液。按濃度從小到大的順序取各溶液分別進(jìn)樣10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=5.07706×104X+1.41985×101，相關(guān)系數(shù)r=1.0000(n=6)。結(jié)果表明，苯甲酸鈉濃度在0.39～196.98 μg/ml范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.6 系統(tǒng)專屬性試驗 分別精密量取供試品溶液、對照品溶液、陰性空白溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果均無干擾。見圖1、圖2、圖3。

圖1 對照品溶液HPLC圖(鹽酸賴氨酸保留時間為5.3 min，苯甲酸鈉保留時間為9.8 min)

圖2 供試品溶液HPLC圖

圖3 陰性空白溶液HPLC圖

2.7 破壞性試驗 (1)酸破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸2 ml，室溫放置1 h后加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml中和，加水定容至刻度，搖勻。(2)堿破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，室溫放置1 h后加0.1 mol/L鹽酸2 ml中和，加水定容至刻度，搖勻。(3)氧化破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，加30%過氧化氫溶液1 ml，室溫放置1 h，加水定容至刻度，搖勻。(4)光破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，254 nm照射15 min，加水定容至刻度，搖勻。(5)高溫破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，沸水浴30 min，放冷，加水定容至刻度，搖勻。樣品在高溫與氧化條件不穩(wěn)定，易產(chǎn)生降解產(chǎn)物。見圖4。

A

2.8 精密度實驗 分別取鹽酸賴氨酸線性4溶液、苯甲酸鈉線性4溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣10 μl(n=6)，測定峰面積的RSD%分別為0.4%、0.2%。

2.9 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液于室溫放置，分別于0、5、10、12、18 h進(jìn)樣10 μl，樣品中鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉峰面積基本保持不變，RSD%分別為0.9%、0.2%，即樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收實驗

2.10.1 鹽酸賴氨酸回收率實驗：精密量取樣品3 ml，置10 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為供試品貯備溶液。分別精密稱取鹽酸賴氨酸對照品1.8、3、4.2 mg各3份，置20 ml量瓶，分別精密加入供試品貯備溶液1 ml，加水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液各10 μl注入液相色譜儀，鹽酸賴氨酸含量測定的平均回收率為101.06%，RSD%為0.8%。

2.10.2 苯甲酸鈉回收率實驗：分別精密稱取苯甲酸鈉對照品2.5、4、5.5 mg各3份，置200 ml量瓶，分別精密加入樣品3 ml，加水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液各10 μl注入液相色譜儀，苯甲酸鈉含量測定的平均回收率為100.27%，RSD%為0.7%。

2.11 樣品測定結(jié)果 見表1。

表1 樣品中鹽酸賴氨酸及苯甲酸鈉含量測定結(jié)果 (n=4)

3 討 論

3.1 波長選擇 用DAD檢測器對各自對照品進(jìn)行掃描，結(jié)果葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、鹽酸賴氨酸無最大吸收，苯甲酸鈉除226 nm有最大吸收外另無最大吸收，選擇末端吸收203 nm與226 nm檢測苯甲酸鈉，峰形無明顯變化，峰面積基本一致，考慮要同時測定鹽酸賴氨酸及苯甲酸鈉的含量，故選擇末端吸收203 nm作為測定波長。由于葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅光譜圖均一致，為葡萄糖酸的響應(yīng)圖譜，故不考慮在選定的色譜條件下同時測定這兩種組分的含量，只考察這兩種組分在選定的色譜條件下對方法是否存在干擾。

3.2 流動相中有機相類別的選擇及是否應(yīng)添加離子對試劑 由于甲醇截止波長為205 nm，鹽酸賴氨酸及苯甲酸鈉均需采用末端檢測波長，為了減少溶劑對檢測的干擾，改為用乙腈作為有機相洗脫。同時參考文獻(xiàn)，由于鹽酸賴氨酸含有2個伯氨基、1個羧基，極性較大, 單純采用磷酸二氫鉀溶液和乙腈為流動相時難以保留，過早出峰導(dǎo)致檢測存在誤差，無法定量作其含量測定的檢查。在流動相中添加適量的離子對試劑，可以使其保留能力明顯改善，延遲其出峰時間，使其能準(zhǔn)確積分定量。

3.3 柱子類型的選擇 參照葡萄糖酸鈣鋅口服溶液YBH37212005標(biāo)準(zhǔn)中鹽酸賴氨酸含量的測定方法進(jìn)行試驗。采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液—乙腈溶液(乙腈—水(10∶1)(30∶70)為流動相，流速為1.0 ml/min，檢測波長為203 nm，柱溫為40 ℃。試驗表明，苯甲酸鈉在該色譜條件下，較早出峰，與溶劑峰、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅重疊在一起。經(jīng)多種調(diào)試，苯甲酸鈉峰均未能與溶劑峰、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅峰完全分離，分離度達(dá)不到要求無法準(zhǔn)確積分定量，故放棄選用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱。參考文獻(xiàn)[2-3,11]，無論是衍生化方法還是梯度方法，多用C18柱做鹽酸賴氨酸的含量測定檢查，故選用C18柱進(jìn)行試驗。

3.4 流動相pH值的選擇 參照葡萄糖酸鈣鋅口服溶液YBH02122016標(biāo)準(zhǔn)中苯甲酸鈉含量測定測定方法進(jìn)行試驗。以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液—甲醇(70∶30)為流動相，流速為1.0 ml/min，檢測波長為224 nm，柱溫為30 ℃。在該色譜條件下，葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、鹽酸賴氨酸與溶劑峰均有部分重疊，無法完全分離，而苯甲酸鈉峰形良好，可以避免樣品中其他成分及輔料的干擾。0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液pH值為4.8，故參考該標(biāo)準(zhǔn)，用磷酸調(diào)pH值至4.8，同時試驗用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.5、3.5的情況，考察流動相pH值的影響。pH值為4.8時，鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉峰形良好，出峰時間適中(圖1)。pH值為6.5時，鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉峰形良好，但苯甲酸鈉出峰時間過早與溶劑峰、輔料峰才剛達(dá)到分離度1.5(苯甲酸鈉保留時間為2.3 min，鹽酸賴氨酸保留時間為5.1 min(圖5)，故不采用該pH條件。pH值為3.5時，苯甲酸鈉保留時間為31.4 min，考慮到樣品中還有輔料峰在苯甲酸鈉峰后出峰，分析時間過長，分析效率低(圖6)，故不采用該pH條件。綜合考慮溶劑峰、輔料峰的干擾、分析時間的長短、峰形是否良好，最后確定流動相pH值為4.8。

圖5 用磷酸調(diào)pH值至6.5為流動相的供試品溶液HPLC圖

圖6 用磷酸調(diào)pH值至3.5為流動相的供試品溶液HPLC圖

4 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，采用HPLC法同時測定葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸和苯甲酸鈉的含量，精密度良好，有較高的準(zhǔn)確度，可以避免樣品中其他成分及輔料的干擾，操作簡便，靈敏度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確，線性范圍及回收率等均符合系統(tǒng)適用性要求，可快速有效檢測葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸和苯甲酸鈉的含量，從而保證樣品的質(zhì)量，保障患者用藥安全。