HPLC法同時(shí)測(cè)定葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉的含量

李梓瑩

葡萄糖酸鈣鋅口服溶液是以苯甲酸鈉為防腐劑，由葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅和鹽酸賴氨酸組成的復(fù)方制劑，臨床多用于治療因缺鈣、缺鋅引起的疾病，包括佝僂病、小兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、食欲缺乏、厭食癥等[1]。其中鹽酸賴氨酸為人體必需氨基酸，可促進(jìn)鈣吸收，增加骨結(jié)合蛋白的含量，促進(jìn)身體生長(zhǎng)發(fā)育，還對(duì)腦組織缺血、缺氧性疾病有保護(hù)作用，可調(diào)節(jié)體內(nèi)氮代謝平衡[2]。目前鹽酸賴氨酸的測(cè)定方法多為衍生化[3]或梯度洗脫[4]的高效液相色譜法(HPLC)，存在操作繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)、衍生物試劑不易得到等問(wèn)題。苯甲酸鈉價(jià)廉易得，但其毒副作用隨著其廣泛應(yīng)用也日漸突出，比如具有紡錘體毒劑的作用，存在基因遺傳毒性[5]、導(dǎo)致染色體斷裂，對(duì)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞具有致突變作用[6]，可能影響動(dòng)物受精過(guò)程，存在生殖毒性，有輕度的積蓄作用等[7]，大量飲用含苯甲酸鈉防腐劑的飲料會(huì)刺激胃腸道，影響鈣的吸收，誘發(fā)急性蕁麻疹、血管性水腫，導(dǎo)致大腦嚴(yán)重萎縮[8-10]。國(guó)外已經(jīng)開始禁止苯甲酸鈉的使用，但國(guó)內(nèi)仍在食品和藥物制劑中作為防腐劑被廣泛使用[4]。

《中國(guó)藥典》暫未收載葡萄糖酸鈣鋅口服溶液這一品種劑型，且無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)收載有關(guān)葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中苯甲酸鈉的量的控制測(cè)定方法。鑒于苯甲酸鈉的量會(huì)影響該藥的吸收及療效，甚至有可能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，臨床上該藥除成人外也用于嬰幼兒，嬰幼兒多體弱，故檢測(cè)葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中苯甲酸鈉含量十分必要。本文建立HPLC分析方法，同時(shí)測(cè)定葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸和苯甲酸鈉的含量，并進(jìn)行相關(guān)的方法學(xué)研究及考察，操作快捷簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀Chemstation色譜工作站，美國(guó)安捷倫科技有限公司，MT5型電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司(精度:0.001 mg)。

1.2 試藥 鹽酸賴氨酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140673-201509)，苯甲酸鈉對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100433-201702)；葡萄糖酸鈣鋅口服溶液(由湖北福人金身藥業(yè)有限公司、澳洛(中國(guó))制藥有限公司、湖北午時(shí)藥業(yè)股份有限公司提供)，乙腈為色譜純，德國(guó)默克公司；磷酸、磷酸氫二鉀、辛烷磺酸鈉為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zobarx C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相K2HPO4緩沖液(取K2HPO42.2822 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml，用H3PO4調(diào)pH值至4.8，加1.08 g辛烷磺酸鈉)—乙腈(90∶10)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備：取本品3 ml(約相當(dāng)于鹽酸賴氨酸30 mg)，置100 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備：取鹽酸賴氨酸對(duì)照品6 mg、苯甲酸鈉對(duì)照品1 mg，置20 ml量瓶中，加水超聲溶解并定容至刻度，搖勻，制成每毫升中約含0.3 mg/ml鹽酸賴氨酸及0.05 mg/ml苯甲酸鈉的溶液。

2.2.3 陰性空白溶液的制備：取處方量輔料，加水?dāng)嚢枞芙猓尤胩幏搅科咸烟撬徕}、葡萄糖酸鋅攪拌溶解后加水定容至最終體積；取上述溶液3 ml，置100 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為陰性空白溶液。

2.3 檢測(cè)限及定量限

2.3.1 檢測(cè)限：檢測(cè)限溶液配制：分別取鹽酸賴氨酸線性1溶液、苯甲酸鈉線性1溶液逐步稀釋。以S/N=3計(jì)算，鹽酸賴氨酸檢測(cè)限為4.211 μg/ml，苯甲酸鈉檢測(cè)限為0.0754 μg/ml。

2.3.2 定量限：分別取鹽酸賴氨酸線性1溶液、苯甲酸鈉線性1溶液，作為各自組分的檢測(cè)限溶液。以S/N=10計(jì)算，鹽酸賴氨酸定量限為20.39 μg/ml，苯甲酸鈉定量限為0.1142 μg/ml。

2.4 耐用性試驗(yàn) 本文考察3種不同廠牌和型號(hào)的色譜柱：(1)Agilent Zobarx C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(2)Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(3)Inersil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)主成分峰形均良好(鹽酸賴氨酸理論塔板數(shù)均≥7 000，苯甲酸鈉理論塔板數(shù)均≥4 000)，且能達(dá)到較好的分離效果，表明該方法耐用性較好。

2.5 線性關(guān)系考察

2.5.1 鹽酸賴氨酸線性范圍：取鹽酸賴氨酸對(duì)照品50.397 mg，置25 ml量瓶中，加水溶解后，加水定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。再精密量取3、3、1、3、3、3 ml分別置200、100、20、20、10、5 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得線性試驗(yàn)用系列濃度的溶液。按濃度從小到大的順序取各溶液分別進(jìn)樣10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=3.47650×102X-0.3784，相關(guān)系數(shù)r=1.0000(n=6)。結(jié)果表明，鹽酸賴氨酸濃度在0.03～1.21 mg/ml范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 苯甲酸鈉線性范圍：取苯甲酸鈉對(duì)照品6.174 mg，置25 ml量瓶中，加水溶解后，加水定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。再精密量取2、2、2、2、2、4 ml分別置50(再精密量取1 ml置25 ml量瓶)、250、50、10、5、5 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得線性試驗(yàn)用系列濃度的溶液。按濃度從小到大的順序取各溶液分別進(jìn)樣10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=5.07706×104X+1.41985×101，相關(guān)系數(shù)r=1.0000(n=6)。結(jié)果表明，苯甲酸鈉濃度在0.39～196.98 μg/ml范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.6 系統(tǒng)專屬性試驗(yàn) 分別精密量取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性空白溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果均無(wú)干擾。見圖1、圖2、圖3。

圖1 對(duì)照品溶液HPLC圖(鹽酸賴氨酸保留時(shí)間為5.3 min，苯甲酸鈉保留時(shí)間為9.8 min)

圖2 供試品溶液HPLC圖

圖3 陰性空白溶液HPLC圖

2.7 破壞性試驗(yàn) (1)酸破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸2 ml，室溫放置1 h后加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml中和，加水定容至刻度，搖勻。(2)堿破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，室溫放置1 h后加0.1 mol/L鹽酸2 ml中和，加水定容至刻度，搖勻。(3)氧化破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，加30%過(guò)氧化氫溶液1 ml，室溫放置1 h，加水定容至刻度，搖勻。(4)光破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，254 nm照射15 min，加水定容至刻度，搖勻。(5)高溫破壞：取本品3 ml，置100 ml量瓶中，沸水浴30 min，放冷，加水定容至刻度，搖勻。樣品在高溫與氧化條件不穩(wěn)定，易產(chǎn)生降解產(chǎn)物。見圖4。

A

2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取鹽酸賴氨酸線性4溶液、苯甲酸鈉線性4溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣10 μl(n=6)，測(cè)定峰面積的RSD%分別為0.4%、0.2%。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液于室溫放置，分別于0、5、10、12、18 h進(jìn)樣10 μl，樣品中鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉峰面積基本保持不變，RSD%分別為0.9%、0.2%，即樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.10.1 鹽酸賴氨酸回收率實(shí)驗(yàn)：精密量取樣品3 ml，置10 ml量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作為供試品貯備溶液。分別精密稱取鹽酸賴氨酸對(duì)照品1.8、3、4.2 mg各3份，置20 ml量瓶，分別精密加入供試品貯備溶液1 ml，加水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液各10 μl注入液相色譜儀，鹽酸賴氨酸含量測(cè)定的平均回收率為101.06%，RSD%為0.8%。

2.10.2 苯甲酸鈉回收率實(shí)驗(yàn)：分別精密稱取苯甲酸鈉對(duì)照品2.5、4、5.5 mg各3份，置200 ml量瓶，分別精密加入樣品3 ml，加水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液各10 μl注入液相色譜儀，苯甲酸鈉含量測(cè)定的平均回收率為100.27%，RSD%為0.7%。

2.11 樣品測(cè)定結(jié)果 見表1。

表1 樣品中鹽酸賴氨酸及苯甲酸鈉含量測(cè)定結(jié)果 (n=4)

3 討 論

3.1 波長(zhǎng)選擇 用DAD檢測(cè)器對(duì)各自對(duì)照品進(jìn)行掃描，結(jié)果葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、鹽酸賴氨酸無(wú)最大吸收，苯甲酸鈉除226 nm有最大吸收外另無(wú)最大吸收，選擇末端吸收203 nm與226 nm檢測(cè)苯甲酸鈉，峰形無(wú)明顯變化，峰面積基本一致，考慮要同時(shí)測(cè)定鹽酸賴氨酸及苯甲酸鈉的含量，故選擇末端吸收203 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。由于葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅光譜圖均一致，為葡萄糖酸的響應(yīng)圖譜，故不考慮在選定的色譜條件下同時(shí)測(cè)定這兩種組分的含量，只考察這兩種組分在選定的色譜條件下對(duì)方法是否存在干擾。

3.2 流動(dòng)相中有機(jī)相類別的選擇及是否應(yīng)添加離子對(duì)試劑 由于甲醇截止波長(zhǎng)為205 nm，鹽酸賴氨酸及苯甲酸鈉均需采用末端檢測(cè)波長(zhǎng)，為了減少溶劑對(duì)檢測(cè)的干擾，改為用乙腈作為有機(jī)相洗脫。同時(shí)參考文獻(xiàn)，由于鹽酸賴氨酸含有2個(gè)伯氨基、1個(gè)羧基，極性較大, 單純采用磷酸二氫鉀溶液和乙腈為流動(dòng)相時(shí)難以保留，過(guò)早出峰導(dǎo)致檢測(cè)存在誤差，無(wú)法定量作其含量測(cè)定的檢查。在流動(dòng)相中添加適量的離子對(duì)試劑，可以使其保留能力明顯改善，延遲其出峰時(shí)間，使其能準(zhǔn)確積分定量。

3.3 柱子類型的選擇 參照葡萄糖酸鈣鋅口服溶液YBH37212005標(biāo)準(zhǔn)中鹽酸賴氨酸含量的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液—乙腈溶液(乙腈—水(10∶1)(30∶70)為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為40 ℃。試驗(yàn)表明，苯甲酸鈉在該色譜條件下，較早出峰，與溶劑峰、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅重疊在一起。經(jīng)多種調(diào)試，苯甲酸鈉峰均未能與溶劑峰、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅峰完全分離，分離度達(dá)不到要求無(wú)法準(zhǔn)確積分定量，故放棄選用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱。參考文獻(xiàn)[2-3,11]，無(wú)論是衍生化方法還是梯度方法，多用C18柱做鹽酸賴氨酸的含量測(cè)定檢查，故選用C18柱進(jìn)行試驗(yàn)。

3.4 流動(dòng)相pH值的選擇 參照葡萄糖酸鈣鋅口服溶液YBH02122016標(biāo)準(zhǔn)中苯甲酸鈉含量測(cè)定測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液—甲醇(70∶30)為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm，柱溫為30 ℃。在該色譜條件下，葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、鹽酸賴氨酸與溶劑峰均有部分重疊，無(wú)法完全分離，而苯甲酸鈉峰形良好，可以避免樣品中其他成分及輔料的干擾。0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液pH值為4.8，故參考該標(biāo)準(zhǔn)，用磷酸調(diào)pH值至4.8，同時(shí)試驗(yàn)用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.5、3.5的情況，考察流動(dòng)相pH值的影響。pH值為4.8時(shí)，鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉峰形良好，出峰時(shí)間適中(圖1)。pH值為6.5時(shí)，鹽酸賴氨酸與苯甲酸鈉峰形良好，但苯甲酸鈉出峰時(shí)間過(guò)早與溶劑峰、輔料峰才剛達(dá)到分離度1.5(苯甲酸鈉保留時(shí)間為2.3 min，鹽酸賴氨酸保留時(shí)間為5.1 min(圖5)，故不采用該pH條件。pH值為3.5時(shí)，苯甲酸鈉保留時(shí)間為31.4 min，考慮到樣品中還有輔料峰在苯甲酸鈉峰后出峰，分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分析效率低(圖6)，故不采用該pH條件。綜合考慮溶劑峰、輔料峰的干擾、分析時(shí)間的長(zhǎng)短、峰形是否良好，最后確定流動(dòng)相pH值為4.8。

圖5 用磷酸調(diào)pH值至6.5為流動(dòng)相的供試品溶液HPLC圖

圖6 用磷酸調(diào)pH值至3.5為流動(dòng)相的供試品溶液HPLC圖

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸和苯甲酸鈉的含量，精密度良好，有較高的準(zhǔn)確度，可以避免樣品中其他成分及輔料的干擾，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，線性范圍及回收率等均符合系統(tǒng)適用性要求，可快速有效檢測(cè)葡萄糖酸鈣鋅口服溶液中鹽酸賴氨酸和苯甲酸鈉的含量，從而保證樣品的質(zhì)量，保障患者用藥安全。