魚油中棕櫚油酸的分離純化

曹亞倫，戴志遠(yuǎn)，2*，沈 清，2，陶美潔，李思敏，葉 繁

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012）

棕櫚油酸（C16：1n7，Palmitoleic acid）是一種16 碳的ω-7 系單不飽和脂肪酸。近年來，隨著對魚油研究的深入，相對于脂肪酸中的“明星”ω-3系脂肪酸而言，鮮為人知的ω-7 系列脂肪酸也逐漸受到關(guān)注，它和ω-3 一樣有很多健康益處，還具有一些ω-3 沒有的功能。棕櫚油酸是自然界中最常見的ω-7，它具有獨特的功效，是保健市場上的一種新產(chǎn)品。ω-3 具有預(yù)防心血管疾病和促進神經(jīng)發(fā)育等功效[1]。與ω-3 脂肪酸相比，ω-7 有著不同的作用機制，ω-7 脂肪酸能起激素樣作用[2-3]，刺激肌肉胰島素，促進葡萄糖代謝并抑制脂肪的形成[4-6]，從而改善人體健康狀況[7-9]?？梢娮貦坝退嵩卺t(yī)療保健領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

棕櫚油酸在常見的油料作物中含量較低，而在澳洲堅果油中含30%[10]，沙棘果油中含35%[11]。有報道稱貓兒屎籽（Decaisnea insignis）油中棕櫚油酸的含量達55.9%，植物貓爪（Dolichandra unguis）含量約64%[12]。棕櫚油酸存在于一些種子油中，從種子油及沙棘油中分離棕櫚油酸價格昂貴，且其供應(yīng)不足以滿足市場需要，需尋找新的棕櫚油酸來源。深海魚油為ω-3 系脂肪酸的最主要來源，也是棕櫚油酸的來源。目前魚油工業(yè)主要以分離ω-3 系多不飽和脂肪酸為主，以魚油為原料生產(chǎn)的棕櫚油酸較少。目前國內(nèi)關(guān)于棕櫚油酸富集的研究大多以沙棘果油為原料[13-15]，而從魚油中富集棕櫚油酸的研究暫未見報道。本試驗使用的原料——秘魯鳀油含約8%的棕櫚油酸，因此以鳀魚油為原料進行棕櫚油酸初步分離富集研究，為生產(chǎn)更高純度棕櫚油酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

魚油，秘魯進口精制鳀魚油，由浙江海力生集團有限公司提供。95%乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、正己烷（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉（分析純），西隴化工股份有限公司；棕櫚油酸乙酯標(biāo)品（色譜純），美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀（7890A），美國Aglilent 公司；電子天平（AL204 型），梅特勒－托利多有限公司；定時恒溫磁力攪拌器（JB-3 型），上海雷磁新涇儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ），鄭州長城科工貿(mào)有限公司；分子蒸餾設(shè)備，天津市金舜堯化工設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚油脂肪酸乙酯的制備[16]稱取一定量的鳀魚油于三頸燒瓶中，水浴加熱至50 ℃，加入一定量的氫氧化鈉-乙醇溶液（m/m=0.02∶1），醇油比（無水乙醇/鳀魚油）為3∶5（m/m），水浴攪拌加熱75 min。反應(yīng)結(jié)束后將混合物倒入分液漏斗，然后用適量5%NaCl 溶液洗3 次，靜置至液體分層，去下層水相層。取上層含油相于60 ℃旋蒸除盡乙醇，加入一定量無水硫酸鈉除去水分，過濾得到鳀魚油混合脂肪酸乙酯。

1.3.2 魚油脂肪酸組分分析[17]稱取約1 g 乙酯化魚油于15 mL 容量瓶中，加入一定量的正己烷溶解魚油，用正己烷定容至刻度線，搖勻。取1 mL上述溶液用有機膜過濾到樣品瓶中，做氣相色譜分析。

色譜條件：HP-88 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.20 μm）；柱箱溫度，初始溫度70 ℃，后運行溫度100 ℃，以15 ℃/min 的速率升至150 ℃，再以3 ℃/min 的速率升至220 ℃保持5 min；進樣量1 μL；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度280 ℃；燃?xì)鉃楦呒儦錃?，助燃?xì)鉃榭諝?，尾吹氣為氮氣?/p>

1.3.3 尿素包合法[18]尿素包合法是一種根據(jù)脂肪酸飽和度的不同將其分離的方法。其原理是尿素在結(jié)晶過程中形成具有一定空間體積的晶體，飽和脂肪酸不含雙鍵，直徑較小，易與尿素分子形成穩(wěn)定的包合物；不飽和脂肪酸含有雙鍵會使其碳鏈彎曲，其碳鏈占據(jù)較大的體積空間，難與尿素形成包合物。使用尿素包合法可以除去大部分飽和脂肪酸，從而提高棕櫚油酸含量。

將尿素和95 乙醇按比例（尿素∶乙醇=1∶2，g/g）混合，在75 ℃下水浴攪拌加熱直至尿素全部溶解，加入魚油（魚油∶尿素=1∶2，g/g）繼續(xù)攪拌加熱，回流1 h 使脂肪酸和尿素充分混勻，置低溫下包合結(jié)晶。包合結(jié)束后迅速抽濾，將濾液旋蒸濃縮除去乙醇，用熱水洗滌，分離出上層有機相。對抽濾后的尿包相加入熱水破壞尿素魚油絡(luò)合物，其中的脂肪酸被釋放出來，再用熱飽和食鹽水洗至下層澄清，取上層脂肪酸。通過氣相色譜分析非尿包相與尿包魚油產(chǎn)物的脂肪酸組成。

1.3.4 分子蒸餾試驗[19]在分子蒸餾設(shè)備的出料口上裝上配套的接收燒瓶，在接收燒瓶口涂抹密封脂保證系統(tǒng)密閉性，打開真空泵、增壓泵和冷凝水，打開加熱器加熱導(dǎo)熱油，打開熱油泵將熱油運送至蒸發(fā)面處；將乙酯化鳀魚油200 g 放入設(shè)備的進樣口，待設(shè)備的真空度和蒸發(fā)溫度達到要求后，調(diào)節(jié)刮膜轉(zhuǎn)速和進料速度開始進樣，考察不同的蒸餾溫度、刮膜轉(zhuǎn)速、進料速度對分離樣品中棕櫚油酸的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化分子蒸餾富集棕櫚油酸的操作條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料魚油的脂肪酸組成

將棕櫚油酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品和乙酯化魚油用氣相色譜儀分析，得到其脂肪酸組成及其占總脂肪酸比例，結(jié)果見圖1、圖2 與表1。

圖1 對棕櫚油酸標(biāo)品的氣相色譜分析表明，在試驗條件下棕櫚油酸出峰時間為9.57 min。從圖2 和表1 可看出，原料魚油中棕櫚油酸屬于單不飽和脂肪酸，占總脂肪酸的8.41%。魚油中飽和脂肪酸占39.92%，其中C16：0占總脂肪酸的23.54%，單不飽和脂肪酸占25.34%，多不飽和脂肪酸占28.33%；中C20：5占總脂肪酸的15.47%。在富集試驗中主要除去以C16：0為主的飽和脂肪酸和以C20：5為主的多不飽和脂肪酸。利用不同分離技術(shù)將這2 類脂肪酸去除。在本試驗中采用尿素包合法與分子蒸餾技術(shù)。

圖1 棕櫚油酸乙酯標(biāo)品氣相色譜圖Fig.1 GS of palmitoleic acid ethyl ester

圖2 原料魚油氣相色譜圖Fig.2 GS of fish oil

表1 原料魚油的脂肪酸組成及含量Table 1 Fatty acid composition and content of raw fish oil

2.2 尿素包合處理對魚油脂肪酸的影響

尿素包合法是利用尿素分子在結(jié)晶過程中可與飽和、單不飽和脂肪酸形成包合物，而不易與多不飽和脂肪酸包合的原理，達到對多不飽和脂肪酸分離純化的目的。原料魚油經(jīng)乙酯化處理后，采用尿素包合法富集其中的棕櫚油酸乙酯，得到非尿包相和尿包相，進氣相色譜分析，結(jié)果見圖3、圖4 與表2。

原料魚油經(jīng)尿素包合法處理得到的產(chǎn)物非尿包相中棕櫚油酸的含量由8.41%提升至13.57%，得率為60.1%。氣相色譜分析表明（見表2 和圖4），尿素包合可除去大部分的飽和脂肪酸C14：0、C16：0及C18：0，只損失少量的棕櫚油酸，這是因為尿素包合法是根據(jù)不飽和度的差異實現(xiàn)分離的，尿素遇到脂肪化合物會形成六棱晶體結(jié)構(gòu)，直鏈的飽和脂肪酸比碳鏈彎曲的不飽和脂肪酸更易進入尿素晶體管道內(nèi)，因此尿素包合法可以有效除去飽和脂肪酸[20]。

2.3 分子蒸餾單因素試驗

2.3.1 刮膜轉(zhuǎn)速對富集效果的影響 刮膜轉(zhuǎn)速是影響分子蒸餾富集效果的因素之一。此次試驗所采用的分子蒸餾條件為：設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，進料速度1 mL/min，蒸餾溫度70 ℃。在此條件下考察不同刮膜轉(zhuǎn)速對棕櫚油酸富集的影響，如圖5所示。

圖3 尿包相氣相色譜圖Fig.3 GS of urea phase

圖4 非尿包相氣相色譜圖Fig.4 GS of non-urea phase

表2 非尿包相與尿包相的主要脂肪酸組成及含量Table 2 Main fatty acid composition and content of non-urea phase and urea phase

由圖5 可知，在蒸餾溫度70 ℃時，隨著刮膜轉(zhuǎn)速的加快，棕櫚油酸含量提高，直至轉(zhuǎn)速達140 r/min 后棕櫚油酸含量沒有明顯提高，這是因為當(dāng)刮膜轉(zhuǎn)速較低時，從進料口進入的魚油在重力和刮膜的作用下不能完全均勻地分布在蒸發(fā)表面上，低沸點組分不能完全蒸發(fā)到達冷凝器，冷凝流入輕相接受瓶中，從而導(dǎo)致分子蒸餾分離效果不佳。當(dāng)刮膜轉(zhuǎn)速加快，低沸點組分得以蒸發(fā)，分離效果有所提升。當(dāng)刮膜轉(zhuǎn)速大于140 r/min 時，棕櫚油酸富集效率沒有明顯增加，是因為此刮膜轉(zhuǎn)速足以使物料在蒸發(fā)表面上形成均勻的液膜，使輕組分得以完全蒸發(fā)出來。由上述結(jié)果可知，刮膜轉(zhuǎn)速對物料的分離效果影響不明顯，最終確定適合的刮膜轉(zhuǎn)速為140 r/min。

2.3.2 進料速度對富集效果的影響 進料速度是影響分子蒸餾富集效果的因素之一。本試驗的分子蒸餾條件為：刮膜轉(zhuǎn)速140 r/min，設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，蒸餾溫度70 ℃。在此條件下考察不同進料速度對棕櫚油酸富集的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6 可知，在進料速度大于1 mL/min 時，隨著進料速度的加快，輕相中棕櫚油酸的含量有所降低，變化不大，而輕相得率不斷降低且變化明顯，這是因為進料速度快時，物料在刮膜作用下形成的液膜過快地流過蒸發(fā)面，物料得不到足夠的時間加熱，輕組分難以完全蒸發(fā)出來，且蒸發(fā)面上的液膜較厚，液膜外層也不能充分加熱，從而導(dǎo)致分子蒸餾的分離效果不理想，輕組分的得率低?？紤]到進料速度過慢使整個操作時間過長，將進料速度設(shè)定為1 mL/min。

2.3.3 蒸餾溫度對富集效果的影響 蒸餾溫度是分子蒸餾富集效果的決定性因素，因不同脂肪酸在高真空度下的沸點不同，故蒸餾溫度決定脂肪酸的分離效果及得率。本試驗的分子蒸餾條件為：刮膜轉(zhuǎn)速140 r/min，設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，進料速度1 mL/min。在此條件下考察一級分子蒸餾溫度對棕櫚油酸富集的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7 可知，當(dāng)蒸餾溫度低于65 ℃時，隨著溫度的升高輕相得率和棕櫚油酸含量都增大，這是因為此溫度下含有棕櫚油酸的輕組分脂肪酸不斷被蒸餾出來，到65 ℃時大部分棕櫚油酸被蒸餾出來進入輕相，而多不飽和脂肪酸等因溫度不夠流入重相。當(dāng)蒸餾溫度在65～75 ℃時，隨著蒸餾溫度的升高，收集的輕相中棕櫚油酸含量不斷降低，輕相得率提高，這是因為蒸餾溫度過高多不飽和脂肪酸也被蒸餾出來，隨著溫度的升高多不飽和脂肪酸進入輕相。最終確定合適的分子蒸餾溫度為65 ℃。

圖5 刮膜轉(zhuǎn)速對分子蒸餾的影響Fig.5 Effect of scrape speed on molecular distillation

圖6 進料速度對分子蒸餾的影響Fig.6 Effect of feed rate on molecular distillation

圖7 蒸餾溫度對分子蒸餾的影響Fig.7 Effect of temperature on molecular distillation

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化分子蒸餾工藝

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 選擇對產(chǎn)物棕櫚油酸含量影響顯著的3 個因素：蒸餾溫度（X1）、進料速度（X2）、刮膜轉(zhuǎn)速（X3）做三因素三水平的響應(yīng)面試驗，得到分子蒸餾的最優(yōu)條件。

通過Design-Expert 軟件進行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：

Y=31.56+2.43X1-2.03X2+0.81X3+0.29X1X2-0.45X1X3+0.36X2X3-6.03X12-1.11X22+0.098X32。

表3 試驗設(shè)計因素與水平表Table 3 Experimental design factors and levels

表4 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果表Table 4 Experiment schemes and results of the response surface

由表5 可知，模型的F 值為73.82，P＜0.0001，表明該模型顯著，可用于試驗。3 個影響因素中——蒸餾溫度（X1）和進料速度（X2）的影響顯著（P＜0.001），3 個交互項的影響不顯著，二次項X12的影響極顯著（P＜0.001），說明產(chǎn)物的棕櫚油酸含量主要受蒸餾溫度和進料速度的影響。試驗校正決定系數(shù)R2Adj=0.9718，表明該試驗中棕櫚油酸含量97.18%的可能性包含在回歸方程模型的9 個因子中，說明模型合適。另外，R2=0.9852，說明在棕櫚油酸含量的實際值與模型的預(yù)測值有較好的擬合度。CV=2.53%，該值低表示該試驗準(zhǔn)確，可靠性高。

表5 回歸模型方差分析表Table 5 The result of regression model of variance analysis

（續(xù)表5）

2.4.2 響應(yīng)面圖分析結(jié)果 分析得出的響應(yīng)面圖見圖8。

從圖8 可看出，刮膜轉(zhuǎn)速與進料速度的交互作用對棕櫚油酸含量的影響最弱。與刮膜轉(zhuǎn)速相比，進料速度所對應(yīng)的曲面坡度較陡，說明進料速度的變化對棕櫚油酸含量的影響較明顯。隨著進料速度的減慢，棕櫚油酸含量有所提高，這是因為進料速度減慢有利于在蒸發(fā)面上形成更薄的液膜，有利于輕組分蒸發(fā)出來，從而提高棕櫚油酸含量。刮膜轉(zhuǎn)速和進料速度與蒸餾溫度的交互作用對棕櫚油酸含量的影響顯著。與進料速度和刮膜轉(zhuǎn)速相比，蒸餾溫度所對應(yīng)的曲面坡度較陡，表明蒸餾溫度對棕櫚油酸含量的影響顯著。

2.4.3 最優(yōu)條件及驗證 利用Design-Expert 軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析，得到分離棕櫚油酸的最優(yōu)條件：蒸餾溫度65.74 ℃，刮膜轉(zhuǎn)速160 r/min，進料速度0.63 mL/min，同時產(chǎn)物中的棕櫚油酸含量達到最大值33.23%。

采用優(yōu)化條件對魚油進行分子蒸餾并測定其棕櫚油酸含量，判斷優(yōu)化條件是否準(zhǔn)確。實際試驗時適當(dāng)調(diào)整最優(yōu)條件，即蒸餾溫度65 ℃，刮膜轉(zhuǎn)速160 r/min，進料速度0.5 mL/min，最終測得產(chǎn)物中的棕櫚油酸含量為32.29%，與預(yù)測的取代度近似，說明模擬條件可行。

圖8 兩因素交互作用對棕櫚油酸含量的影響Fig.8 Effect of interaction of two factors on Palmitoleic acid content

2.5 尿素包合及分子蒸餾后魚油中棕櫚油酸乙酯含量

原料魚油首先經(jīng)尿素包合法處理，除去大部分飽和脂肪酸，然后在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到分子蒸餾富集棕櫚油酸的最優(yōu)條件。采用氣相色譜分析分子蒸餾收集的魚油的脂肪酸組成，測定棕櫚油酸含量。經(jīng)尿素包合和分子蒸餾處理，魚油中主要脂肪酸的組成變化見圖9、表6。

從表6 可看出，尿素包合處理主要除去飽和脂肪酸，使產(chǎn)物中的棕櫚油酸含量由8.41%提至13.57%，得率60.1%。然后分子蒸餾處理，主要除去EPA 和DHA 等長鏈多不飽和脂肪酸，使魚油中棕櫚油酸的含量由13.57%提至32.29%。分子蒸餾后收集的輕相得率26.29%，棕櫚油酸乙酯的回收率60.5%。

圖9 分子蒸餾產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.9 GS of molecular distillation product

表6 原料魚油經(jīng)兩次處理后其產(chǎn)物的脂肪酸組成及含量Table 6 Fatty acid composition and content of fish oil product

3 結(jié)論

利用尿素包合法和分子蒸餾分離特性的不同對魚油中的棕櫚油酸進行富集。首先通過尿素包合處理，在反應(yīng)溫度75 ℃，m魚油∶m尿素∶m乙醇=1∶2∶4 的條件下，產(chǎn)物中棕櫚油酸的含量由8.41%提至13.57%，得率60.1%。然后分子蒸餾處理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到分子蒸餾富集棕櫚油酸的最優(yōu)條件：設(shè)備真空度3.0×10-3kPa，刮膜轉(zhuǎn)速160 r/min，進料速度0.5 mL/min，蒸餾溫度65 ℃，使魚油中棕櫚油酸的含量由13.57%提至32.29%，得率26.29%。原料魚油經(jīng)尿素包合和分子蒸餾，產(chǎn)品中的棕櫚油酸乙酯含量從8.41%提到32.29%，回收率為60.5%。