石榴皮提取物改善肥胖大鼠糖、脂代謝紊亂的分子機制

張颯樂，魏香蘭，李 英，李曉明，方歡樂*

（1 西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院 西安710125 2 西安市胸科醫(yī)院藥劑科 西安710100）

肥胖（obesity）是一種過多脂肪積累并損害人體健康的慢性非傳染性疾病，與基因、不良生活習(xí)慣、內(nèi)分泌等多種因素有關(guān)[1]。近年來，隨著生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖的發(fā)生率逐漸升高，目前已成為世界范圍內(nèi)最為流行的營養(yǎng)障礙性疾病。肥胖患者能量攝入大于消耗，主要表現(xiàn)為脂肪過量堆積、脂質(zhì)代謝紊亂，同時很多肥胖患者多伴有糖尿病、高胰島素血癥等引起胰島素抵抗，因此肥胖是胰島素抵抗發(fā)生和發(fā)展的危險因素[2-3]。脂肪組織病變、代謝過程紊亂固然在胰島素抵抗中起著重要作用[4]，然而異常的抗氧化防御以及非脂肪組織慢性炎癥引起的氧化應(yīng)激也是胰島素敏感性的主要調(diào)節(jié)因素[5-7]。肝臟是維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要組織器官。在健康條件下，胰島素能有效抑制肝臟的葡萄糖生成和脂肪分解。當(dāng)肝臟葡萄糖生成和脂肪細胞脂肪分解受損時，血糖和游離脂肪酸水平升高，后者可促進甘油三酯（triglycerides，TG）的合成和儲存，導(dǎo)致肝脂質(zhì)積累增加和肝損傷[8]。目前肥胖人群在不斷擴大，在發(fā)達國家30%的成年人和10%的兒童均存在不同程度的非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），而非酒精性脂肪肝、肝臟胰島素抵抗和二型糖尿病又有著千絲萬縷的聯(lián)系。尋找改善肥胖患者肝臟糖、脂代謝紊亂的方法尤為重要。

石榴皮中富含氨基酸、蛋白質(zhì)、糖及其苷類、酚類和鞣質(zhì)、有機酸、黃酮類、生物堿、揮發(fā)油等化學(xué)成分[9]。國內(nèi)外研究顯示石榴皮有抗炎、抗感染、降脂、降糖、抗動脈硬化，防止肝纖維化等多種藥理學(xué)活性[10-11]。有文獻顯示石榴提取物可以降低高脂、高糖誘導(dǎo)的大鼠腦抗氧化標(biāo)志物含量及膽堿酯酶活性，發(fā)揮抗氧化能力，起到神經(jīng)保護作用，防止糖尿病和肥胖的發(fā)生[12]。本試驗組前期試驗發(fā)現(xiàn)石榴皮提取物（pomegranatepeels extracts，EPP）通過降低氧化還原反應(yīng)可有效改善四氯化碳誘發(fā)的大鼠肝臟損傷[13]。然而，石榴皮中的有效成分是否可以改善肥胖大鼠肝臟的糖、脂代謝紊亂尚未見報道。本文通過高脂飲食長期誘導(dǎo)建立肥胖大鼠模型，分析石榴皮提取物對肥胖大鼠體重、血脂、血糖以及肝臟糖脂代謝等的影響，為石榴皮提取物防治肥胖、保護肝臟功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

將2 000 g 石榴皮粗粉用10 L 95%乙醇回流提取3 次，每次2 h，過濾，將濾液常壓濃縮，回收乙醇至無乙醇，得到棕褐色浸膏730 g（石榴皮醇提物）備用。1 g 醇提物相當(dāng)于2.8 g 生藥量，收膏率為36.50%。提取物原料和提取工藝由西安市胸科醫(yī)院魏香蘭博士提供。

1.2 動物

SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體重180～200 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）003-0001。每6 只大鼠被飼養(yǎng)在一籠，隨意飲食覓食；飼養(yǎng)室溫度（24±2）℃，濕度50%～60%，12 h 光照/12 黑暗交替。

1.3 試劑

高脂飲食（D12451）和正常脂肪飲食（D12450H）飼料，江蘇常州股份有限公司提供?？偰懝檀迹═C）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBil）和脂肪酸（FFA）試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；大鼠胰島素（INS）檢測ELISA 試劑盒，上海西塘生物科技有限公司；血糖試紙，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；RIPA 裂解液、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（GLUT2）和胰島素受體底物2（IRS-2），Abcam 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 分組、造模及干預(yù) 雄性SD 大鼠180～200 g，正常飼養(yǎng)1 周后被隨機分為5 組：空白對照組（sham），大鼠飼養(yǎng)喂對照飼料16 周（D12450H：10%脂肪，70%碳水化合物，20%蛋白）；高脂模型（HF）組：大鼠飼喂高脂飲食（D12451：45%脂肪，35%碳水化合物，20%蛋白）16 周；低劑量組【HF+EPP（50）】，大鼠飼喂高脂飼料并每天灌胃給予EPP【50 mg/（kg·d）】；中劑量組【HF+EPP（100）】，大鼠飼養(yǎng)喂高脂飼料并每天灌胃給予EPP（100 mg/（kg·d））；高劑量組【HF+EPP（200）】，大鼠飼喂高脂飼料并每天灌胃給予EPP 【200 mg/（kg·d）】。每周分別測量大鼠體重、體長、食物攝入量，觀察大鼠狀態(tài)。

1.4.2 標(biāo)本采集及處理 16 周后各組大鼠禁食12 h 后稱重，麻醉各組大鼠，腹主動脈取血，離心后血清用于檢測血糖和血脂指標(biāo)水平，取肝臟稱質(zhì)量后計算大鼠肝重比（肝重比=肝臟質(zhì)量/大鼠體重）。切取肝臟100 mg 置于4%多聚甲醛溶液中固定，以備病理學(xué)檢測。其余肝臟組織被置于超低溫冰箱中以備相關(guān)蛋白檢測。

1.4.3 血清指標(biāo)測定 用全自動生化分析儀檢測血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA 的含量，詳細流程參見試劑盒說明書（江蘇建成生物工程研究所）。用放射免疫分析法測定胰島素水平，計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。

1.4.4 蛋白印跡法測定肝臟中IRS-2 和GLUT2蛋白表達 取-80 ℃凍存的大鼠肝臟組織50 mg，加入500 μL 含10%PMSF 的增強型RIPA 裂解液提取總蛋白。經(jīng)30 min 充分裂解，4 ℃高速離心機12 000 r/min 離心10 min，取5 μL 上清液用于蛋白定量，剩余蛋白進行變性處理。蛋白（30 mg/道）上樣后，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA）上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，分別加入特異性一抗IRS-2（1∶1 000）、GLUT2（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）孵育，4 ℃過夜。用TBST 搖床清洗PVDF 膜3 次（10 min/次）；用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶7 000）室溫下孵育PVDF 膜40 min，再次用TBST 搖床清洗PVDF 膜3 次（10 min/次）。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對膜進行成像。利用Image J 軟件對條帶進行統(tǒng)計分析，確定各目的蛋白表達水平的改變。

1.4.5 蘇木精-伊紅（H&E）染色 4%多聚甲醛固定的肝組織進行石蠟包埋，切片機切至5 μm 厚組織切片。隨后進行H&E 染色，顯微鏡下觀察大鼠肝組織細胞形態(tài)，鏡下觀察，染成藍色的為細胞核，染成紅色的為細胞質(zhì)。（具體方法參見《顯微形態(tài)學(xué)實驗》科學(xué)出版社）

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，計量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差誤（±s）表示，組間差異應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著性差異應(yīng)用Tukeys post hoc 檢驗比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 石榴皮提取物降低肥胖大鼠體重、肥胖指數(shù)（Lee’s 指數(shù)）、肝重指數(shù)

檢測各組動物體重、體長和肝質(zhì)量，結(jié)果見表1。與對照組相比，用高脂飼料喂養(yǎng)16 周后大鼠體重明顯增加，Lee’s 指數(shù)和肝重指數(shù)也顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），說明營養(yǎng)性肥胖大鼠模型建立成功。大鼠被灌胃給予EPP 干預(yù)后，與HF 組比較，大劑量EPP 組大鼠體重、Lee’s 指數(shù)和肝重指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；中、小劑量EPP 組大鼠各指標(biāo)下降不明顯，無顯著性差異（P＞0.05），表明大劑量石榴皮提取物可抑制高脂飼養(yǎng)誘發(fā)的大鼠肥胖和肝臟肥大。

2.2 石榴皮提取物降低肥胖大鼠血脂水平和游離脂肪酸含量

與對照組比較，高脂飲食大鼠血清TG、TC 和LDL-C 水平均顯著升高（P＜0.01），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.01）；與高脂飲食組比較，EPP 不同劑量組均能降低TG、TC 和LDL-C 水平，升高HDLC 血脂水平，其中EPP 大劑量組有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。游離脂肪酸（FFA）是血清中未與膽固醇、甘油等成分酯化的脂肪酸，肥胖人群體內(nèi)FFA 的含量顯著升高。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食組FFA 和空白對照組比較含量明顯升高（P＜0.01），不同劑量的EPP 干預(yù)高脂飲食大鼠后FFA 均下降，其中大劑量最為顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠體重、Lee’s 指數(shù)及肝重指數(shù)比較Table 1 Comparison of body weight，Lee’s index and liver weight index of rats in each group

表2 各組大鼠血清TC，TG，LDL-C，HDL-C 和游離脂肪酸水平Table 2 Serum TC，TG，LDL-C，HDL-C and free fatty acids levels of rats in each group

2.3 石榴皮提取物抑制肥胖大鼠胰島素抵抗

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指人體對胰島素降糖作用的敏感性下降，即胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降。IR 的發(fā)生大大增加了心血管、腎、大腦等相關(guān)疾病的患病率及死亡率[9]。高脂飼料喂養(yǎng)造模16 周后，取血清進行血糖、胰島素水平評估。根據(jù)公式“HOMA-IR=空腹血糖（mmol/L）×血清胰島素濃度（mU/L）/22.5”計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。結(jié)果顯示，高脂飲食組大鼠血糖和胰島素明顯增高，發(fā)生胰島素抵抗（P＜0.01）。不同劑量的EPP 干預(yù)高脂飲食大鼠后胰島素抵抗明顯得到改善，尤其大劑量最為顯著（P＜0.01），結(jié)果見表3。

2.4 EPP 對大鼠肝組織的保護作用

為了明確EPP 對肥胖大鼠肝臟的作用，檢測大鼠血清ALT，AST 和T-Bil 水平。結(jié)果顯示：與空白對照相比，高脂飲食組大鼠血清ALT，AST和T-Bil 顯著增加（P＜0.01），EPP 3 個劑量干預(yù)后，大、中劑量組ALT，AST 和T-Bil 水平明顯低于高脂飲食組（P＜0.01，P＜0.05，圖1a～c），小劑量EPP 組ALT，AST 和T-Bil 水平與高脂飲食組比較雖有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 各組大鼠血清葡萄糖、胰島素水平的變化Table 3 Changes of serum glucose and insulin levels of rats in each group

對大鼠肝臟進行HE 染色觀察肝臟顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：空白對照組大鼠肝組織靜脈分布均勻，周圍肝細胞排列整齊緊密，呈放射狀，未見空泡形成。高脂飲食組肝臟細胞明顯腫脹，靜脈周圍細胞排列紊亂，大量空泡形成。與高脂飲食組比較，EPP 組治療16 周后肝臟顯微結(jié)構(gòu)有明顯改善，空泡減少（圖1d），表明EPP 對高脂飲食大鼠肝臟有明顯的保護作用。

圖1 EPP 對大鼠肝組織的保護作用Fig.1 Protective effect of EPP on rat liver tissue

2.5 EPP 對肝臟糖代謝的影響

肝臟是機體糖代謝的主要器官，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（GLUT2）參與胰島素的合成與分泌。胰島素受體底物2（IRS-2）是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游分子，兩者共同調(diào)控血糖的穩(wěn)定。試驗結(jié)果顯示：與空白組相比，高脂飲食組大鼠肝臟中IRS-2和GLUT2 蛋白表達明顯降低，大劑量EPP 可顯著改善由肥胖誘發(fā)的IRS-2 和GLUT2 表達降低（P＜0.05，P＜0.01，圖2），表明EPP 可劑量依賴性地改善肥胖大鼠肝臟糖代謝作用。

圖2 EPP 對大鼠肝臟組織糖代謝的影響Fig.2 Effect of EPP on glucose metabolism in rat liver

3 討論與結(jié)論

高脂飼料（45%脂肪）喂養(yǎng)是誘發(fā)嚙齒動物肥胖的廣泛造模方法之一[14]。本試驗采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠16 周，模擬能量攝入過度誘發(fā)的肥胖模型，試驗結(jié)束后測定大鼠Lee’s 指數(shù)顯著性增加。肥胖產(chǎn)生時，機體對脂肪酸的清除和代謝被抑制，進而使血清中FFA 含量升高，過多的游離FFA 以三酰甘油的形式在非脂肪組織——主要在肝臟過度沉積，造成肝臟損傷，即非酒精性脂肪肝。同時，長期處于高濃度FFA 環(huán)境中也會損傷β 細胞，導(dǎo)致胰島素分泌障礙，引起胰島素抵抗，并有發(fā)展為糖尿病的高度風(fēng)險[15]。本研究結(jié)果顯示：血脂指標(biāo)TC、TG、LDL 和FFA 增高，HDL 降低引起脂質(zhì)代謝紊亂；大鼠肝臟組織功能降低，血清ALT，AST和T-Bil 顯著增加，肝臟顯微結(jié)構(gòu)受損；模型組大鼠血糖增加，產(chǎn)生胰島素抵抗。

肝臟脂質(zhì)沉積是非酒精性脂肪肝的一個潛在特征，高達70%的肥胖個體存在肝臟脂肪化。NAFLD 與其它代謝異常相關(guān)，包括高甘油三酯血癥和低高密度脂蛋白水平，葡萄糖耐受不良，胰島素抵抗和2 型糖尿病等[16]。肝臟脂質(zhì)含量調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運脂質(zhì)與肝臟攝取、合成、氧化和分泌脂質(zhì)之間存在復(fù)雜的相互作用。在健康人的肝臟，甘油三酯含量來自游離脂肪酸產(chǎn)生的脂肪組織。肝臟脂肪變性是胰島素抵抗發(fā)展的重要預(yù)測因子，通常先于其它異常的發(fā)展，包括脂肪細胞肥大和肥胖發(fā)展、脂肪細胞死亡、巨噬細胞浸潤和脂肪炎癥。

肝臟是參與機體糖代謝的重要器官，GLUT2是肝細胞中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體，主要通過胰島素及其受體信號分子來調(diào)節(jié)葡萄糖在肝臟中的分布，產(chǎn)生作用，調(diào)節(jié)機體血糖。慢性游離脂肪酸升高則可能通過下調(diào)GLUT2 的表達及抑制胰島素的生物合成，使對葡萄糖刺激的胰島素分泌受損[17]。而胰島素的信號傳遞主要是通過IRS2 調(diào)控肝臟糖原的合成及葡萄糖的利用。在胰島素信號傳導(dǎo)中，IRS2 可激活下游一系列酶，將細胞外信號傳遞到細胞內(nèi)。無論體內(nèi)或體外的試驗均證明，血液循環(huán)中游離脂肪酸對葡萄糖刺激的胰島素分泌有重要的作用，游離脂肪酸的升高對葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素合成和釋放起抑制作用。本文研究了肝臟中GLUT2 的表達，結(jié)果顯示：高脂飲食組大鼠肝臟中GLUT2 的表達降低，表明游離脂肪酸合成增多，抑制了胰島素的合成，引起糖脂質(zhì)代謝紊亂。

本研究結(jié)果表明：EPP 在改善肥胖的同時，可明顯抑制肥胖大鼠血糖增加和胰島素抵抗，恢復(fù)肥胖大鼠肝臟功能和結(jié)構(gòu)，這一保護作用可能與上調(diào)GLUT2、IRS2 的表達，影響糖脂代謝相關(guān)。

綜上所述，EPP 對肥胖誘發(fā)的代謝紊亂有明顯的改善作用，對肝臟損傷有顯著抑制作用。