復方生地合劑對MRL/lpr狼瘡小鼠TLR-NF-κB信號通路的調節(jié)作用?

陳薇薇，肖小莉，阿古達木，蘇 勵，蘇 曉△，徐 俊

(1. 上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院風濕科，上海 200071； 2. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院風濕科，上海 200032)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多系統(tǒng)廣泛累及的自身免疫性疾病，其發(fā)病機理為異常的免疫應答引發(fā)T、B細胞過度活化、自身抗體生成、炎癥因子釋放，最終損傷臟器組織[1-4]。目前西醫(yī)在急性活動期治療上發(fā)揮了積極作用，然而激素與細胞毒藥物的長期應用帶來的毒副作用卻是新難題。中醫(yī)藥辨治SLE依托經(jīng)典理論，在臨床中不斷實踐、不斷優(yōu)化，與西醫(yī)藥齊頭并進，在控制疾病、撤減激素方面取得實效，彰顯效佳毒小優(yōu)勢。上海市名中醫(yī)沈丕安教授從事SLE診療30余年，以陰虛立論確定了“養(yǎng)陰滋腎、清熱通絡”治療大法，研制自制制劑復方生地合劑治療活動型SLE。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制效應，且能減少糖皮質激素的用量，提高生存質量[5-7]。

SLE發(fā)病機制復雜，國內外多項研究發(fā)現(xiàn)如Toll樣受體(toll like receptors，TLRs)通過識別病原相關分子模式，經(jīng)過一系列信號傳導分子激活核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)，使T和B淋巴細胞異?；罨a生多種細胞因子，參與SLE的發(fā)病過程[8]。本研究在臨床取效的前提下，采用由美國Jackson實驗室Murphy和Roths等于1978年成功建立最為經(jīng)典的SLE動物模型——MRL/lpr狼瘡小鼠模型，探討復方生地合劑干預免疫應答上游TLR-MyD88-NF-κB 信號通路的調節(jié)作用。本實驗已通過上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

采用隨機數(shù)字表法將30只12周齡雌性SPF MRL/lpr狼瘡小鼠分為中藥組、西藥組和模型組各10只，體質量35.8～40.6 g。正常組采用12周齡雌性SPF級C57BL/6鼠10只。實驗動物均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司供應，許可證號SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院無特異病原體(SPF)級動物房，5只一籠，溫度保持在20～25 ℃，濕度保持在40%～70%。

1.2 主要試劑與儀器

M-TNF-alpha HS(杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司)；M-IFN-α(上海江萊生物科技有限公司)；PrimeScriptTM RT reagent Kit，SYBR? Premix Ex TaqTMII(TAKARA公司)；TRIzol Reagent(Ambion公司)；Anti-NF-κB p65 antibody，Anti-MyD88 antibody，Anti-TLR7 antibody，Anti-beta Actin antibody(英國abcam公司)；酶標儀(Thermo Multiskan MK3)；熒光定量PCR儀(羅氏，LightCycler?96)；電泳儀(北京六一廠)；轉膜儀(北京六一廠)。

1.3 給藥

模型組和空白組給予生理鹽水灌胃，中藥組給予復方生地合劑灌胃，西藥組給予強的松懸液灌胃。根據(jù)《人與動物間體表面積折算的等效劑量比值表》折算成小鼠藥物劑量[9]。復方生地合劑(本院中藥制劑室制)，由生地黃、生石膏、忍冬藤組成，給藥劑量為18.495 ml/(kg·d)，給藥濃度為2.8 g/ml(從預實驗低、中、高劑量濃度1.4 g/ml、2.8 g/ml、5.5 g/ml篩選而得的最佳有效濃度)。強的松為12.33 mg/(kg·d)。強的松片(上海上藥信誼藥廠有限公司，產品批號018180403)10 mg，溶于8.1 ml純凈水中配制出1.23 mg/ml濃度的潑尼松懸液，當天配置當天使用。灌胃量為0.1 ml/10 g，每天1次，連續(xù)給藥8周。

1.4 取材與指標檢測

1.4.1 取血 取小鼠眼眶血入EP管，室溫靜置2 h，3000rpm離心20 m收集上清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 取脾 將斷頸處死的小鼠酒精消毒后轉移至超凈工作臺，打開腹腔在腹腔左側胃后方暴露脾臟，用鑷子輕輕取出脾臟，分成3份裝入1.5mlEP管中，放入-80 ℃低溫冰箱凍存。

1.4.3 酶聯(lián)免疫方法檢測外周血小鼠抗雙鏈dsDNA 抗體、IFN-α和TNF-α水平的表達 取適量血清按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 定量聚合酶鏈反應測定脾組織TLR7/9，髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary-response gene 88,MyD88)，NF-κB的基因表達 取凍存的各組小鼠脾組織勻漿，提取總RNA。逆轉錄合成cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，進行基因實時熒光定量PCR檢測。運用Primer Premier 5結合 Dnastar分析軟件及網(wǎng)上BLAST分析，設計并由華大基因合成引物。引物序列如下：GAPDH-F：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，GAPDH-R：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA，產物大小123 bp；TLR7-F:AGATGCTTTGCAATTGCGCT，TLR7-R：ACCAGACAAACCACACAGCA，產物大小158 bp；TLR9-F3：CCTGGTTCCAAGGTCTGGTC，TLR9-R3:AGGCGGGTTAGGTTCTGAAAG，產物大小103 bp；MyD88-F：TGTTCTTGAACCCTCGGACG，MyD88-R：TTCCAGCTCTCGGATCTCCA，產物大小92 bp；NF-κB1-F：TCCGCTATGTGTGTGAAGGC，NF-κB1-R：TTGCAAATTTTGACCTGTGGGT，產物大小94 bp。PCR 反應體系20 μL。PCR程序為95 ℃預變性30 s，PCR反應 95 ℃，5s，60 ℃，34 s，40～45循環(huán)，溶解階段95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s。上機擴增檢測，利用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.4.5 蛋白質印跡分析法測定脾組織TLR7、MyD88、NF-κB的蛋白表達 按蛋白抽提試劑盒程序提取并行蛋白定量和變性后分離電泳，PVDF 轉膜，一抗孵育，4 ℃孵育過夜。二抗37 ℃孵育1 h。加入顯色底物，用Image lab顯影，采用Image J軟件對圖像進行灰度值分析。用目標蛋白的灰度值和對應內參蛋白β-catin的灰度值比值作為樣本中目標蛋白的相對表達量，并將此作為參數(shù)對目標蛋白進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般情況

模型組毛發(fā)脫落、皮膚血管炎、淺表淋巴結腫大較其余3組明顯。中藥組8只、西藥組9只、模型組7只和空白組10只小鼠存活至實驗終點。中藥組死亡2只，分別于治療第2、3周死亡；西藥組死亡1只，于治療第5周死亡。模型組3只，分別于治療第1、7、8周死亡，空白組無死亡。死亡小鼠死亡前1周均有體質量下降、活動力下降現(xiàn)象，毛發(fā)脫落、皮膚血管炎、淺表淋巴結腫大癥狀明顯，解剖發(fā)現(xiàn)其頸部、腹腔淋巴結腫大，未發(fā)現(xiàn)有氣管異物等。

在脾臟組織取材時因個別小鼠脾臟組織過小，空白組和中藥組各8個，西藥組9個，模型組7個樣本完成檢測。檢測過程中個別脾臟組織的條帶不顯影，每組7個樣本完成檢測。

2.2 外周血dsDNA抗體水平

表1示，MRL/lpr小鼠外周血清dsDNA抗體、TNF-α和IFN-α平均異常升高(P<0.01，P<0.01，P<0.05)，復方生地合劑可以減低MRL/lpr小鼠外周血清的dsDNA抗體、TNF-α和IFN-α水平均水平(P<0.05)。

表1 各組小鼠外周血dsDNA抗體及TNF-α和IFN-α水平比較

2.3 脾臟組織TLR-MyD88-NF-κB通路相關基因表達

表2示，MRL/lpr小鼠外周血清的TLR7mRNA、TLR9mRNA、MyD88mRNA和NF-κBmRNA水平均異常升高(P<0.01)，復方生地合劑可以下調MRL/lpr小鼠脾臟組織的TLR7mRNA、TLR9mRNA、MyD88mRNA和NF-κBmRNA表達(P<0.05)。

2.4 脾臟組織TLR-MyD88-NF-κB通路相關蛋白表達

圖1 各組TLR7蛋白表達

圖2 各組MyD88蛋白表達

圖3 各組NF-κB p65蛋白表達

表3 各組小鼠脾臟組織TLR-MyD88-NF-κB通路相關蛋白表達比較

表3示，MRL/lpr小鼠脾臟組織的TLR7、MyD88和NF-κB蛋白表達異常上調(P<0.01)，復方生地合劑可以下調MRL/lpr小鼠脾臟組織TLR7、MyD88和NF-κB的蛋白表達(P<0.01)。

3 討論

MRL/lpr小鼠是由C57BL/6 J、AKR/J、LG/J和C3H/HeDi四類品系小鼠交配到第12代時產生[10-11]，是自發(fā)性SLE的常用動物模型，其表現(xiàn)與人類SLE癥狀相似，可觀察到明顯的全身性淋巴結腫大，dsDNA抗體、Sm抗體等各種抗體也在2～3月齡時隨日齡而上升[10]。dsDNA抗體作為SLE特異性抗體，在MRL/lpr狼瘡鼠中陽性率達90%以上[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，復方生地合劑與強的松都能降低MRL/lpr狼瘡鼠外周血中dsDNA抗體水平，即能進一步抑制抗原抗體復合物形成和補體激活，減少炎癥和組織損傷。

研究發(fā)現(xiàn)[13]，感染會增加SLE的發(fā)病率和死亡率，而TLRs在機體感染病原體后發(fā)起的免疫應答中起決定性作用，并通過內源性配體參與誘導的急性和慢性炎癥過程。TLR識別病原體成分后，經(jīng)信號傳導途徑激活轉錄因子NF-κB，進而活化T和B淋巴細胞，調節(jié)與免疫有關的基因表達，分泌各種細胞因子參與SLE的發(fā)病[14-15]。TLRs的激活導致免疫細胞的活化產生許多細胞因子，直接參與SLE發(fā)病。業(yè)已證實，TLR多態(tài)性與SLE易感性增加有關。TLR7和TLR9通過對自身核酸以及相關免疫復合物的識別，在SLE發(fā)病機制中尤為重要[16-23]。由免疫復合物激活TLR7、TLR9，繼而導致TNF-α和IFN-α的表達[24-25]。

本研究在TNF-α和IFN-α的結果表明，MRL/lpr小鼠外周血的TNF-α和IFN-α水平異常升高，支持TNF-α和IFN-α參與SLE的觀點。中藥組的TNF-α和IFN-α水平低于模型組，提示復方生地合劑可以降低MRL/lpr小鼠外周血TNF-α和IFN-α水平。鑒于TNF-α和IFN-α是TLR信號通路上的重要炎性因子，推測復方生地合劑可能通過清熱解毒涼血作用減少TLR的激活，而降低免疫應答下游細胞因子TNF-α和IFN-α水平，展現(xiàn)了中醫(yī)藥“損其有余”的治療理念。

本研究在TLR-MyD88-NF-κB通路相關基因和蛋白表達方面的結果提示，復方生地合劑可以下調MRL/lpr小鼠脾臟組織TLR7(TLR9)、MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表達，即具有抑制TLR-MyD88-NF-κB通路信號傳導作用，天然免疫的啟動和獲得性免疫的發(fā)生發(fā)展隨之減少或減輕。

綜合免疫上游TLR-MyD88-NF-κB通路信號與免疫下游TNF-α和IFN-α的抑制結果，分析復方生地合劑作用機理可能從免疫應答上游環(huán)節(jié)抑制或減少抗原與免疫細胞表面的TLR7、TLR9結合，減少抗原遞呈和通路依賴的MyD88，避免NF-κB和后續(xù)減少T、B細胞活化，免疫應答下游的炎癥因子和自身抗體隨之減少，進而減輕臟器組織損傷。

上海市名中醫(yī)沈丕安教授將SLE辨為熱瘀毒滯積，先天真陰不足，邪毒腎損，腎陰虧損，陰虛內熱，據(jù)此制定治療原則以養(yǎng)陰清熱、涼血通絡為主，研制了自制制劑復方生地合劑治療SLE。復方生地合劑由生地黃、生石膏、忍冬藤組成。以生地黃為君藥，滋補腎陰、清熱涼血，現(xiàn)代藥理報道，生地黃具有抑制免疫作用，其有效成分為甾醇類，且具有抗炎作用[26]；生石膏清熱瀉火，加強生地的清熱涼血作用，解氣分血分之熱，為臣藥；忍冬藤清熱解毒通絡，藥性善于走竄，作為使藥助生地、生石膏驅衛(wèi)氣營血之熱，涼臟腑經(jīng)脈之血，解表里之毒，通四肢關節(jié)之絡通達全身、疏經(jīng)通絡。現(xiàn)代藥理報道，忍冬藤含有木樨草素有顯著抗炎活性和抗菌作用[26]。生地黃、生石膏和忍冬藤相須相使，共奏養(yǎng)陰清熱、涼血通絡之效。全方緊湊而力專，滋陰而不留邪，清熱而不傷正，涼血而不留瘀。復方生地合劑可能通過養(yǎng)陰清熱涼血解毒作用，減少或減輕感染，TLR對病原體成分的識別相應減少，截斷一系列免疫級聯(lián)反應，保護機體免受免疫炎性損傷與破壞，發(fā)揮抑制免疫和抗炎作用。