穩(wěn)心顆粒對心肌梗死大鼠模型心肌脂肪化及E6AP、C/EBPα表達影響?

龐 延，盧健棋△，朱智德，王慶高，溫志浩，梁逸強，林 浩，唐梅玲，許志亮

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530000)

據(jù)報告顯示，中國心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)死亡率已趕超腫瘤等其他疾病居于榜首，尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)在CVD中死亡率最高[1]。雖然目前經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)等技術(shù)得到快速發(fā)展，AMI死亡率有所下降，但AMI后惡性心律失常仍然是引起死亡的重要因素。研究提示[2]，接近90%的AMI有不同程度的心律失常，且發(fā)現(xiàn)約有32%的患者出現(xiàn)室性心律失常，其中室性心動過速(ventricular tachycardia, VT)約占75%。轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBPs)是脂肪細胞分化中的重要轉(zhuǎn)錄因子，E6AP (E6 assiociated Protein)是細胞編碼的一種泛素蛋白連接酶。Pooja Pal等團隊[3]研究首次證實，E6AP能夠通過降低C/EBPα的轉(zhuǎn)錄水平抑制心肌脂肪化，從而降低AMI后VT發(fā)生。西藥在AMI后VT預(yù)防及終止療效得到肯定，但因其副作用等因素在臨床應(yīng)用上仍存在一定的顧慮與限制。中醫(yī)藥治療具有多靶點、副作用小等特點。既往研究表明，穩(wěn)心顆粒聯(lián)合西藥治療能夠降低AMI患者血脂水平和降低室性期前收縮、非持續(xù)性室性心動過速等室性心律失常發(fā)生率，優(yōu)于單用西藥治療[4]。本研究通過觀察穩(wěn)心顆粒對心肌梗死模型大鼠心肌脂肪化及E6AP、C/EBPα表達影響，探討穩(wěn)心顆粒對心肌脂肪化作用機制，以期為穩(wěn)心顆粒在預(yù)防和降低AMI后VT發(fā)生提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠12只，1～3 d齡，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，實驗動物許可證：SCXK(滬)2013-0016。

1.2 主要藥物、試劑和儀器

穩(wěn)心顆粒(山東步長制藥股份有限公司，國藥準字Z10950026，藥物組成：黨參、黃精、三七、琥珀、甘松)；胺碘酮(杭州賽諾菲民生健康藥業(yè)有限公司，國藥準字H33020581 產(chǎn)品規(guī)格0.2 g，批準日期2018-04-16)；戊巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司，貨號H31020502)；牛血清白蛋白(Solarbio，貨號A8020)；膠原酶I(Gbico，貨號17100-017)；FBS(Gbico，貨號10099148)；高糖DMEM/F12液體培養(yǎng)基(Gbico，貨號C11330500BT)；胰酶(Solarbio，貨號T1350)；牛胰島素(上海源葉生物科技有限公司，貨號11070-73-8)；E6AP一抗(santa cruz,sc-166689)；C/EBPα一抗(santa cruz,sc-365318)；鼠二抗(抗E6AP)(Jackson，315-035-003)；鼠二抗(抗C/EBPα)(賽默飛，62-6820)；DLK蛋白一抗(Santa Cruz Biotechnology，貨號sc-376755)；熒光二抗：Goat anti-Mouse IgG (H+L)(molecular probes，貨號Catalog #A-21206)；Trizol(Takara，Cat：9109)SYBR Green mix(諾維贊，Cat：Q111-01)；E6AP過表達和干擾腺病毒NC濃縮液、腺病毒OE初液、腺病毒Ube3a-3#初液均由上海銳賽生物技術(shù)有限公司提供；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，型號Midi40)；共聚焦顯微鏡(廠家ZEISS，型號LSM710)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad,型號:575BR)；雙垂直電泳儀(北京六一，型號DYCZ-25D)，半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad,型號Yrdimes+ELITE200)。

2 方法

2.1 大鼠前脂肪細胞的原代分離及培養(yǎng)

無菌狀態(tài)下取1～3 d齡雄性SD健康大鼠，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，取大鼠頸、背部的皮下脂肪組織剪成小塊，加消化液(DMEM/F12 +20 g/L牛血清白蛋白，臨用時加1 g/L的膠原酶I)37 ℃消化30～50 min，過篩并收集濾液至離心管離心棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)液清洗再離心然后加含10% FBS的DMEM/F12吹打混勻，制成單細胞懸液，即獲得大鼠前體脂肪細胞。采用的前脂肪細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基含10 ml FBS、89 ml高糖DMEM/F12 液體培養(yǎng)基、1 ml青鏈霉素混合液，一定條件下培養(yǎng)2～3 d換液1次。細胞貼壁呈梭形、透亮，胞質(zhì)內(nèi)無脂滴，長滿80%時進行傳代，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 大鼠心肌細胞的原代分離及培養(yǎng)

無菌狀態(tài)下取1～3 d齡SD健康雄性大鼠，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后迅速開胸取出心臟，置于4 ℃二氮嗪強化Celsior液中保存。剪去除主動脈的一切血管及脂肪，將心臟迅速懸吊在灌流裝置上，循環(huán)灌洗心臟3次，待心肌軟化剪下心室肌組織，在酶液里浸泡切成碎片，置入離心管內(nèi)振蕩10 min 37 ℃，用尼龍網(wǎng)過濾去上清液，加入酶液繼續(xù)離心振搖，直到心肌組織充分消化獲取心肌細胞，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 病毒轉(zhuǎn)染

細胞密度達到30%進行感染，感染前棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮的培養(yǎng)基，再分別加腺病毒NC濃縮液(10 μl)、腺病毒OE初液(100 μl)、腺病毒Ube3a-3#初液(100 μl)混勻，放入CO2培養(yǎng)箱中，感染8 h/過夜進行換液，在孔板中加入新鮮的完全培養(yǎng)基，感染24 h觀察熒光，感染48 h/72 h使熒光率達到50%以上，持續(xù)培養(yǎng)使細胞密度融合到100%進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)2 d后重復(fù)1次，再繼續(xù)培養(yǎng)4 d。

2.4 分組及前脂肪細胞誘導(dǎo)分化

無藥血清組(空白組)給予大鼠MI后的無藥血清；E6AP腺病毒組給予E6AP腺病毒轉(zhuǎn)染的大鼠MI后的無藥血清；E6AP封閉組采用RNAi技術(shù)封閉E6AP，給予MI后的無藥血清；E6AP過表達組采用轉(zhuǎn)染野生型E6AP，使其過表達并給予MI后的無藥血清；胺碘酮組給予MI后的含胺碘酮血清10%;穩(wěn)心顆粒組給予MI后的含穩(wěn)心顆粒血清10%。各組置于10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并與同來源的小鼠心肌細胞共培養(yǎng)，各組均加細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ(含10 ml FBS、89 ml DMEM/F12液體培養(yǎng)基、1 ml青鏈霉素混合液、牛胰島素1 mg/L、IBM×0.5 mmol/L、DE×1.0 μmol/L)，2 d后換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ(含10 ml FBS、89 ml DMEM/F12 液體培養(yǎng)基、1 ml青鏈霉素混合液、牛胰島素1 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1～2 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)4 d。

2.5 油紅O染色

棄去培養(yǎng)液，10%甲醛PBS固定，0.35%油紅O母液(含0.35 g油紅、100 ml異丙醇)與去離子水3∶2混合，濾紙過濾，靜置數(shù)分鐘，取上層液對細胞進行染色10 min，去離子水沖洗后顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 熒光定量(PCR)檢測C/EBPα、E6AP的mRNA 表達

提取總RNA，擴增mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，熒光定量 PCR 法檢測C/EBPα、E6AP mRNA表達。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：E6AP：上游AGGGGACGTGGACACAAATC，下游TGGATCCACTCGAGGACCTT，片段長度：127 bp；C/EBPα：上游GTCGGTGGATAAGAACAGCAACG，下游AGGCGGTCATTGTCACTGGTC，片段長度：144 bp；Atcb(內(nèi)參)：上游GCTATGTTGCCCTAGACTTCGA，下游GATGCCACAGGATTCCATACC，片段長度：173 bp。采用2-△△Ct法進行各基因表達的相對定量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組前脂肪細胞C/EBPα、E6AP的mRNA表達結(jié)果

表1示，E6AP過表達組E6AP表達明顯高于各組，除E6AP過表達組以外，穩(wěn)心顆粒組E6AP表達明顯高于各組(P<0.05)，胺碘酮組E6AP表達明顯高于空白組和E6AP腺病毒組、E6AP封閉組(P<0.05)；由此表同組E6AP與C/EBPα表達趨勢可以看出，E6AP與C/EBPα表達成負性關(guān)系，但C/EBPα表達中胺碘酮組與穩(wěn)心顆粒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組脂肪細胞C/EBPα和E6AP基因mRNA相對表達量比較

3.2 各組前脂肪細胞油紅染色結(jié)果

圖1示，油紅染色的是脂肪顆粒，紅染越多說明細胞內(nèi)積累脂肪越多分化越明顯。由油紅染色結(jié)果可知，E6AP封閉組油紅染色程度最深，而E6AP過表達組染色最淺，胺碘酮組和穩(wěn)心顆粒組染色程度相對于空白組有較為明顯的減少。

圖1 各組前脂肪細胞油紅染色結(jié)果(放大200倍)

3.3 各組前脂肪細胞C/EBPα、E6AP的蛋白表達結(jié)果

表2圖2示，E6AP過表達組E6AP表達明顯高于空白組和E6AP腺病毒組、E6AP封閉組(P<0.05)，其腺病毒轉(zhuǎn)染有效；穩(wěn)心顆粒組E6AP蛋白表達明顯高于胺碘酮組(P<0.05)，但C/EBPα表達中，胺碘酮組與穩(wěn)心顆粒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：1：空白組；2：E6AP腺病毒組；3：E6AP封閉組；4：E6AP過表達組5：胺碘酮組；6：穩(wěn)心顆粒組圖2 各組前脂肪細胞C/EBPα、E6AP蛋白Western Blot 結(jié)果

4 討論

急性心肌梗死是一種冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧引起心肌壞死的臨床綜合征。Katia Orvin等團隊[5]研究7669例AMI患者發(fā)現(xiàn)，伴有室性心律失常發(fā)生率為3.8%(早期(≤48 h)2.1%，晚期(≥48 h)1.7%)，出現(xiàn)快速室性心律失常患者住院率及1年死亡率顯著高于非快速室性心律失?；颊?。以往研究認為[6-7]，AMI后VT發(fā)生主要與梗死心肌纖維化、存活心肌細胞和膠原沉積等瘢痕區(qū)域形成了折返性VT底層基質(zhì)改變心電電傳導(dǎo)密切相關(guān),而心肌脂肪化是瘢痕介導(dǎo)VT的底層基質(zhì)，提示心肌脂肪化在影響AMI后VT發(fā)生重要地位。綜上所述，預(yù)防和降低VT發(fā)生在降低AMI死亡風(fēng)險中具有重大意義。Pooja Pal團隊[3]已證實，E6AP能夠通過降低C/EBPα的轉(zhuǎn)錄能力和心肌脂肪化從而AMI后VT發(fā)生，提示上調(diào)E6AP抑制C/EBPα轉(zhuǎn)錄可能是預(yù)防和降低AMI發(fā)生VT的重要靶點。

表2 各組脂肪細胞C/EBPα和E6AP蛋白相對表達量比較

心梗后心律失常屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“怔忡”“驚悸”等范疇。結(jié)合眾多醫(yī)家對本病的認識，認為本病多為本虛標(biāo)實，以氣血陰陽虧虛為本，瘀血、痰濁、寒凝、氣滯等多種因素為標(biāo)[8]。穩(wěn)心顆粒以黨參為君補中益氣; 黃精益氣養(yǎng)陰為臣; 三七、琥珀活血化瘀、鎮(zhèn)靜安神為佐藥；甘松理氣加強活血為使藥，共奏安神定悸、益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀功效，臨床常用于治療心律失常。研究提示[9-11]，穩(wěn)心顆粒在治療心梗后室性心律失常具有良好療效，得到多名國內(nèi)著名專家認可并成為共識，可能與穩(wěn)心顆粒能夠改善冠脈供血，改善微循環(huán)延緩心室重構(gòu)和抑制鈉通道及L-鈣通道，穩(wěn)定心肌膜電位等機制有關(guān)。胺碘酮作為III類廣譜抗心律失常藥物，能夠有效抑制心房及心肌傳導(dǎo)纖維的快鈉離子內(nèi)流，降低心肌細胞自律性和傳導(dǎo)速度，發(fā)揮抗心律失常作用。但胺碘酮具有擴張外周血管降低血壓、影響甲狀腺功能等副作用，臨床應(yīng)用存在一定缺陷[12]。

本研究結(jié)果提示，穩(wěn)心顆粒組和胺碘酮組都能明顯上調(diào)前脂肪細胞E6AP表達和抑制C/EBPα表達。結(jié)合各組前脂肪細胞油紅染色結(jié)果可知，E6AP水平上調(diào)能夠抑制前脂肪細胞分化，這與C/EBPα表達對前脂肪細胞的分化作用相反。由此可推測，胺碘酮和穩(wěn)心顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)E6AP水平及負性調(diào)節(jié)C/EBPα表達抑制心肌細胞脂肪化，但結(jié)果顯示穩(wěn)心顆粒E6APmRNA及蛋白表達明顯高于胺碘酮組，但在C/EBPα表達中2組無明顯差異?？紤]本研究所檢測基因較單一，其檢測基因所涉及上游下游相關(guān)因子和相關(guān)通路影響尚不明確，其是否存在多通路多蛋白參與E6AP調(diào)控尚不得知，且細胞離開復(fù)雜的體內(nèi)內(nèi)環(huán)境調(diào)控，研究結(jié)果不能完全反映藥物在體內(nèi)的影響，未來仍需進行多通路、多蛋白組學(xué)的研究，同時對干預(yù)藥物最佳濃度及安全性進行探索，進一步實施體內(nèi)試驗進行療效驗證。