心氣陰虛證心衰大鼠尿液代謝組學(xué)研究?

楊 夢(mèng)胡志?！骼?琳鐘森杰姚 濤程 彬邱 宏

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410208； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)診斷學(xué) 湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208)

慢性心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)是多種疾病(冠心病、高血壓等)的終末期階段，其發(fā)病率高、預(yù)后差，病死率高達(dá)40%，是心血管疾病死亡的重要原因[1]。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，具有整體、動(dòng)態(tài)、綜合分析的特點(diǎn)，其系統(tǒng)研究思路與中醫(yī)證候的整體論和系統(tǒng)觀相契合，因此可作為研究高血壓心衰中醫(yī)證候本質(zhì)的切入點(diǎn)[2]。本研究基于UPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)高血壓心衰心氣陰虛證大鼠的尿液代謝物進(jìn)行研究，探討該模型大鼠尿液整體代謝物水平的變化規(guī)律，從小分子代謝產(chǎn)物角度闡釋該模型的證候本質(zhì)及為臨床診治提供客觀化參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取鹽敏感(Dahl/SS)雄性大鼠13只，6周齡，體質(zhì)量(220±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006，動(dòng)物合格證號(hào)43004700037714。每籠飼養(yǎng)大鼠3只，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫維持在23～25 ℃，光照12 h的房間/黑暗周期，自由飲水。該實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(20170906)。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠N端前腦鈉肽(NT-proBNP)ELISA試劑盒，CUSABIO公司產(chǎn)品(貨號(hào)CSB-E08752 r)；L-2-氯苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海恒創(chuàng)生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、水，均為上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，所有化學(xué)藥品及溶劑均為分析純或色譜級(jí)。彩色多普勒超聲診斷儀(SonoScape-S2N型)，深圳開(kāi)立科技有限公司；小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(CODA型)；美國(guó)Kent Scientific 公司；高分辨質(zhì)譜儀(Xevo G2-XS QTof)、高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC)、色譜柱(ACQUITY UPLC BEH C18 (100×2.1 mm,1.7 μm)，均為Waters有限公司。

2 方法

2.1 模型制備

本課題組前期通過(guò)高鹽飼料(8%氯化鈉濃度)喂養(yǎng)Dahl/SS鹽敏感大鼠20周的方法建立高血壓心衰模型，并以“以方測(cè)證”法驗(yàn)證所屬中醫(yī)證型為心氣陰虛證，另通過(guò)低鹽飼料(0.3%氯化鈉濃度)喂養(yǎng)建立正常大鼠模型[3]。本研究選取前期制備的心氣陰虛證大鼠(7只)和正常大鼠(6只)進(jìn)行代謝組學(xué)研究。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 血壓檢測(cè) 采用小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x，每月檢測(cè)1次大鼠鼠尾血壓的變化，并觀察大鼠的行為和體征。

2.2.2 超聲心動(dòng)圖和血清NT-proBNP檢測(cè) 運(yùn)用彩超儀測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD),取得3個(gè)心動(dòng)周期的平均值,并按照Teichholtz公式計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)。隨后以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定血清 NT-proBNP 的含量。

2.3 尿液代謝組學(xué)分析

2.3.1 尿液樣本采集與制備 模型驗(yàn)證后，所有大鼠放置于代謝籠，采集24 h尿液，4℃2000 r/min離心10 min，沉淀雜質(zhì)提取上清，-80 ℃保存。檢測(cè)時(shí)室溫解凍尿液，預(yù)處理方法依據(jù)前期文獻(xiàn)[4]。

2.3.2 LC-MS分析條件 采用沃特世ACQUITYUPLC超高效液相串聯(lián)XevoG2-XSQTof高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜柱條件：ACQUITYUPLCBEHC18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)用于色譜分析，柱溫保持在45 ℃，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸)，B為乙腈(含0.1%甲酸)(梯度洗脫程序見(jiàn)表1)。樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用ESI正負(fù)離子掃描模式。相關(guān)參數(shù)設(shè)置：正離子模式毛細(xì)管電壓為3kv，負(fù)離子為-2 kV,取樣錐為40 V,震源偏移為80 V,源溫度為120 ℃,脫溶溫度為450 ℃,脫溶氣流量為800 L/h；錐形氣流為50 L/h，質(zhì)量范圍為50～1000 amu，掃描時(shí)間為0.1 s，碰撞能量(低能量)為6，坡道碰撞能量(高能)為20～35，掃描類型MSEcentroid。

表1 洗脫梯度程序比較

2.4 數(shù)據(jù)處理

從UPLC-TOF/MS分析儀采集的信號(hào)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，利用ProgenesisQIv2.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、峰對(duì)齊和歸一化等預(yù)處理，得到一個(gè)由代謝物的保留時(shí)間、離子模式和質(zhì)核比等組成的二維數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA14.0軟件(瑞典UmetricsAB公司的主成分分析法(principal component analysis，PCA)，偏最小二乘法分析(partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析法(orthogonal partial least squares method,OPLS-DA)進(jìn)行模式識(shí)別分析，篩選差異性代謝物。選取OPLS-DA模型第一主成分變量權(quán)重值(variable important in projection，VIP)>1的代謝物有重要貢獻(xiàn)的變量，結(jié)合單因素方差分析結(jié)果尋找差異代謝物。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血壓比較

每月使用小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠鼠尾血壓的變化，發(fā)現(xiàn)模型組喂食高鹽飼料1個(gè)月后，其鼠尾血壓值(收縮壓、舒張壓)高于正常組，收縮壓高于160 mmHg，舒張壓則高于100 mmHg，連續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月后模型組大鼠收縮壓已達(dá)到190 mmHg以上，已成高血壓模型；而正常組連續(xù)喂養(yǎng)5個(gè)月收縮壓基本維持在120 mmHg左右，尚未成高血壓模型(各組血壓每月變化見(jiàn)圖1圖2)。

注：與正常組造模后比較：P<0.01；與模型組造模比較：P<0.01圖1 各組大鼠血壓收縮壓監(jiān)測(cè)圖

注：與正常組造模后比較：P<0.01；與模型組造模比較：P<0.01圖2 各組大鼠血壓舒張壓監(jiān)測(cè)圖

3.2 各組大鼠LVEF、FS和NT-proBNP比較

喂養(yǎng)20周后，模型組大鼠均出現(xiàn)心率增快、呼吸急促、體質(zhì)量減輕等癥狀，隨后對(duì)2組大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查和血清NT-proBNP含量檢測(cè)。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組LVEF、LVFS值顯著下降，NT-proBNP值上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，評(píng)定模型組大鼠成為心衰模型。

注：與正常組比較：P<0.01圖3 各組大鼠LVEF、FS值比較

注：與正常組比較：P<0.01圖4 各組大鼠NT-proBNP值

3.3 中醫(yī)證型評(píng)價(jià)

根據(jù)課題組的國(guó)家自然科學(xué)基金課題研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參麥注射液干預(yù)15 d后，對(duì)高血壓心衰大鼠的治療效果顯著優(yōu)于參附注射液，基于“以方測(cè)證”理論驗(yàn)證高血壓心衰大鼠所屬證型為心氣陰虛證[3,5]。

本次研究在“以方測(cè)證”的基礎(chǔ)上，觀察模型大鼠的行為及體征情況，發(fā)現(xiàn)模型組自喂高鹽飼料后，出現(xiàn)精神亢奮，抓時(shí)反抗劇烈，時(shí)有尾部、腿部出血等亢奮表現(xiàn)；后期模型組大鼠精神不振，蜷臥少動(dòng)，體質(zhì)量減輕，飲水量、尿量增多。參照1986年修訂的[6]《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》,通過(guò)以下表現(xiàn)情況對(duì)該模型大鼠的體征及行為進(jìn)行評(píng)價(jià):心率增快反映心悸癥狀,呼吸急促反映氣短癥狀，精神萎靡、蜷縮懶動(dòng)反映神疲乏力、少氣懶言等癥狀，抓起反抗劇烈反映煩躁易怒癥狀，發(fā)現(xiàn)該模型大鼠較好地反映心氣陰虧虛證的相關(guān)證候特點(diǎn)，與“以方測(cè)證”結(jié)果相符合，系列實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均顯示該模型能作為心氣陰虛證動(dòng)物模型進(jìn)行研究。

3.4 LC-MS分析結(jié)果

采用代謝組學(xué)(UPLC-Q/TOF-MS)技術(shù)對(duì)正常組與模型組大鼠尿液進(jìn)行分離與鑒別，得到基峰離子色譜圖(base peak chromatogram，BPC)。從圖5可知，正常組大鼠的BPC圖在峰高度與保留時(shí)間與模型組大鼠不同，說(shuō)明2組大鼠的內(nèi)源性代謝物存在顯著差異。

3.5 多元統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)采用無(wú)監(jiān)督的主成分分析(PCA)，以探尋組間聚類效果。PCA得分圖顯示，2組樣本點(diǎn)基本處于橢圓形散點(diǎn)圖(95%置信區(qū)間)內(nèi)，在空間分布上明顯分開(kāi)且無(wú)交叉和重疊，表明模型大鼠和正常大鼠的代謝模式存在明顯差異。隨后采用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)，PLS-DA得分圖(見(jiàn)圖6b)展示了2組之間有明顯的分離情況，R2Y∶0.997，Q2∶0.933，兩值均較為貼近1，反映擬合與預(yù)測(cè)能力較好。由圖6c所示，OPLS-DA模型的可解釋變量R2X、R2Y及可預(yù)測(cè)度(Q2)分別為0.769、0.999、0.949，說(shuō)明該模型能很好地解釋和預(yù)測(cè)2組樣本之間的差異。同時(shí)為檢測(cè)模型是否“過(guò)擬合”，故采取7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)法。圖6示，截距R2和Q2值分別為0.964、-0.452，體現(xiàn)了模型的可靠性，說(shuō)明基于LC-TOF/MS建立的OPLS-DA模型，能好地解釋各組之間的差異。

注：正離子模式下：A.心氣陰虛證心衰大鼠；B.正常組大鼠；負(fù)離子模式下；C.心氣陰虛證大鼠；D.正常組大鼠圖5 心氣陰虛證心衰大鼠與正常大鼠LC-MS基峰圖

注：藍(lán)色正常組(正方形)；紫色為模型組(三角形)。a為PCA圖；b為PLS-DA圖；c為OPLS-DA圖；d 200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)圖圖6 心氣陰虛證心衰大鼠與正常組大鼠PCA、PLS-DA、OPLS-DA及200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)圖得分圖

3.6 差異代謝物篩選結(jié)果

表2、3示，根據(jù)差異代謝物的質(zhì)核比，通過(guò)儀器自帶的快速鑒定系統(tǒng)(OSI/SMMS)結(jié)合HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)和METLIN(http:∥metlin.scripps.edu)2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定尿液差異代謝物，以VIP大于1且P值小于0.05為篩選條件，最終得到25種組間差異性代謝物。為更好地表明正常組與模型組之間的代謝物差異，將25種代謝物進(jìn)行層次聚類分析。圖7可以看出，2組之間差異代謝物可聚為兩類，表明所篩選的代謝物合理。與正常組比較，模型組中的肌酸、肌醇、煙酸、尿苷、L-精氨酸、黃嘌呤等物質(zhì)含量下降，泛酸、5-L-谷?；?牛磺酸、脯氨?；?蘇氨酸等物質(zhì)含量上升。

表2 心氣陰虛證大鼠與正常大鼠間9種差異代謝物(ESI+)

表3 心氣陰虛證大鼠與正常組大鼠間16種差異性代謝物(ESI-)

代謝組學(xué)立足于整體性關(guān)聯(lián)指標(biāo), 從整體角度觀察生物體中的內(nèi)源性代謝物改變規(guī)律, 以把握與之關(guān)聯(lián)的代謝網(wǎng)絡(luò)變化特征。心氣陰虛證是心衰的常見(jiàn)證候，常出現(xiàn)于心衰病程的早期或中期。慢性心力衰竭多因心肌能量生成不足或能量代謝障礙，導(dǎo)致基因表達(dá)異常而形成的一種超負(fù)荷心肌病[7]。機(jī)體心衰時(shí),心肌缺血缺氧，心肌結(jié)構(gòu)受損，伴隨能量和底物代謝改變。本研究采用高通量的LC-MS非靶向技術(shù)，探討高血壓心衰心氣陰虛證模型的尿液代謝組學(xué)特征，共挖掘出25種差異代謝物，主要涉及能量代謝、氨基酸代謝等多個(gè)層面。

圖7 25種差異代謝物熱圖

4 討論

4.1 能量代謝

首先，參與能量代謝的代謝物有泛酸、順式-烏頭酸、肌酸等。泛酸為乙酰輔酶A(COA)前體，涉及糖、蛋白質(zhì)、能量代謝等多個(gè)層面，泛酸的高水平表達(dá)可增強(qiáng)CoA產(chǎn)生，進(jìn)而參與三羧酸循環(huán)以供給能量[8]。模型組大鼠中泛酸的含量上升，可能是在心氣陰虛證大鼠中，因心肌缺血導(dǎo)致能量代謝障礙, 大鼠會(huì)激活泛酸和CoA合成途徑, 提高心肌的缺血適應(yīng)能力，緩解心衰癥狀。三羧酸循環(huán)是糖、脂、氨基酸代謝的終端代謝路徑, 亦為三者的聯(lián)系紐帶。以上研究結(jié)果提示，心氣陰虛證心衰大鼠已經(jīng)發(fā)生三大營(yíng)養(yǎng)素的代謝異常。順式-烏頭酸為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物, 與機(jī)體的能量生成密切關(guān)聯(lián)。肌酸可將線粒體中能量以磷酸肌酸形式轉(zhuǎn)輸至肌原纖維，供給所需的ATP[9]。模型組大鼠中肌酸、順式-烏頭酸明含量下降，說(shuō)明心衰時(shí)心肌處于缺血狀態(tài)，能量代謝途徑受到損傷，導(dǎo)致產(chǎn)能減少，無(wú)法生成足夠的ATP以供機(jī)體需要，從而加重心衰的進(jìn)程。這可能與心氣陰虛證心衰大鼠后期出現(xiàn)精神不振、蜷臥少動(dòng)等有關(guān)。

4.2 氨基酸代謝

在已鑒定的25種差異代謝物中，氨基酸類的有1-甲基組氨酸、色氨酸、5-L-谷?；?牛磺酸、犬尿酸等，說(shuō)明心氣陰虛證大鼠體內(nèi)氨基酸代謝路徑發(fā)生紊亂。1-甲基組氨為組氨酸代謝的產(chǎn)物，組氨酸在機(jī)體中經(jīng)由酶催化后可產(chǎn)生組胺。組胺是一種強(qiáng)烈的血管擴(kuò)張劑，可通過(guò)激活腺甘酸環(huán)化酶使體內(nèi)cAMP的含量升高，提高心肌收縮力以增加血液供應(yīng)，緩解心衰癥狀[10]。模型組中的1-甲基組氨含量降低，說(shuō)明生成的組氨含量減少，不能發(fā)揮其擴(kuò)血管作用，進(jìn)一步損害心功能。這可能與心衰時(shí)心氣陰虧虛，不能推動(dòng)血液運(yùn)行及化生血液、脈道不充、陰液不足有一定關(guān)聯(lián)。

犬尿酸、3-脫氫奎尼酸、5-羥基吲哚酸是色氨酸代謝支路的最終產(chǎn)物。色氨酸屬于必需氨基酸，其代謝的重要臟器為腎，體內(nèi)約95%色氨酸在腎中經(jīng)犬尿氨酸途徑代謝，從而生成犬尿氨酸等產(chǎn)物[11]。臨床研究證據(jù)顯示,色氨酸通過(guò)cAMP導(dǎo)致膜電位超極化，從而與心衰危重狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組中犬尿酸、5-羥基吲哚乙酸的含量下降，推測(cè)心衰早期因氣陰虧虛、氣不能行血及生血，致腎臟氣血灌注不足、腎失所養(yǎng)，最終導(dǎo)致腎絡(luò)瘀滯，從而使色氨酸代謝發(fā)生紊亂。本次實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，4-吡多酸的變化，由于犬尿氨酸酶需要以維生素B6作為輔酶，故推測(cè)4-吡多酸參與心衰大鼠色氨酸代謝途徑。

5- L-谷酰基-?；撬?5-L-Glutamyl-taurine)由牛磺酸通過(guò)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶產(chǎn)生。牛橫酸是一種存在于多種組織(心肌等)中的游離氨基酸，經(jīng)肝臟合成可抑制缺血性損傷引起的活性氧(ROS)異常增加，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，調(diào)控炎癥因子表達(dá)，并可維持細(xì)胞中Ca2+平衡，穩(wěn)定細(xì)胞膜等[14]。本研究中模型對(duì)照組大鼠牛磺酸含量上升，說(shuō)明?；撬岽x旺盛,能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)，以緩解心肌損傷程度[15]。

4.3 糖脂類代謝

糖脂類物質(zhì)代謝方面，半乳糖經(jīng)由代謝旁路還原為半乳糖醇或可氧化為半乳糖酸[16]。煙酸于生物體中轉(zhuǎn)化為煙酰胺，后者與其他物質(zhì)組成輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ，從而參加脂代謝、生物氧化、糖代謝等路徑，該物質(zhì)水平降低反映“煙酸-煙酰胺”代謝路徑受抑制。LySoPE(0∶0/20∶0)、LysoPE(0∶0/14∶0)和LysoPE(0∶0/20∶4(5Z、8Z、11Z、14Z)均屬于溶血磷脂酰乙醇胺，是磷脂代謝產(chǎn)物。研究表明，磷脂代謝紊亂與心肌組織的生理病理變化息息相關(guān)[17]，其含量異?？赏茰y(cè)心衰磷脂代謝發(fā)生紊亂。肌醇作為組織滲透劑，常與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)及脂肪酸的氧化相關(guān)。模型組肌醇含量下降，提示體內(nèi)能量代謝和脂質(zhì)代謝紊亂[18]。

此外本研究發(fā)現(xiàn)，心衰的發(fā)生與嘧啶代謝、嘌呤代謝及兒茶酚胺生物合成相關(guān)。去甲腎上腺素為兒茶酚胺類產(chǎn)物，可促進(jìn)血管收縮、興奮心臟[19]。心氣陰虛證組中的去甲腎上腺素含量減少，說(shuō)明酪氨酸代謝發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致兒茶酚胺含量異常。其含量降低會(huì)影響其對(duì)心臟的調(diào)節(jié)作用，從而產(chǎn)生一系列病變，這與心氣陰虛證患者出現(xiàn)心悸、神疲乏力、盜汗等癥狀及心功能異常有一定關(guān)聯(lián)。腺嘌呤、黃嘌呤酸同屬嘌呤類產(chǎn)物，其中黃嘌呤可在酶作用下生成尿酸，導(dǎo)致尿酸的高含量表達(dá)，這一系列改變?yōu)樾难芗膊〉奈ｋU(xiǎn)因素。尿苷是嘧啶代謝的產(chǎn)物，可調(diào)控心肌能量代謝與抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用[20-21]。心氣陰虛證組中的尿苷含量下降，可能與心衰時(shí)導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損，使細(xì)胞內(nèi)RNA的合成受損，導(dǎo)致體內(nèi)尿苷的含量下降。

本次研究利用LC-MS技術(shù)探討高血壓心衰心氣陰虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)，篩選出25種差異性代謝物可能為該病證模型的生物標(biāo)志物，通過(guò)分析與之相關(guān)的代謝途徑，闡明與該病證相對(duì)應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常后物質(zhì)和功能的改變，進(jìn)一步為揭示該病證的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。本研究為前瞻性實(shí)驗(yàn)，樣本量較少，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上增加樣本數(shù)，結(jié)合多種代謝組學(xué)檢測(cè)手段進(jìn)行相互驗(yàn)證，并可結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等現(xiàn)代研究技術(shù)進(jìn)一步探討該病證的生物學(xué)基礎(chǔ)，以期為心衰的臨床診治提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。