Neurospora crassa 產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件及酶學(xué)特性

曹 慧 張朋振 張騰月，2 程 鵬 楊佳萌 任世威 井佳騏

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽471000；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江524088)

木聚糖是由多個(gè)D-木糖殘基通過β-1，4 糖苷鍵連接而成[1]，是谷物及其副產(chǎn)品中非淀粉多糖的重要組分，是細(xì)胞壁中半纖維素的主要成分，是自然界中除纖維素外含量最豐富的多糖[2]，廣泛存在于玉米芯、秸稈、麥麩、甘蔗渣等農(nóng)作物廢棄物中[3]。木聚糖酶能夠水解木聚糖中的糖苷鍵并生成低聚木糖、木糖和阿拉伯糖降解產(chǎn)物[4]，在食品、飼料、造紙等行業(yè)有著廣泛的用途。在飼料行業(yè)中，木聚糖酶可以通過降低食糜黏度、減少飼料內(nèi)源損失、改善腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)來改善畜禽生產(chǎn)性能，提高養(yǎng)分和能量的利用效率[5]；在造紙行業(yè)中，用于紙漿漂白，提高紙漿白度，減少化學(xué)漂白劑用量[6]；在食品行業(yè)中，木聚糖酶能顯著提高全麥面包和冷凍面團(tuán)面品質(zhì)[7-8]。不同的應(yīng)用環(huán)境對酶的要求不同，因此開發(fā)適用于不同用途的木聚糖酶非常必要，目前的研究熱點(diǎn)主要是新酶的挖掘和酶分子改造[9-11]。

青藏高原被譽(yù)為世界屋脊，地球“第三極”，具有海拔高、輻射強(qiáng)、含氧量低、晝夜溫差大等特點(diǎn)，其獨(dú)特的自然地理環(huán)境賦予了青藏高原地區(qū)豐富而獨(dú)特的微生物資源[12-14]。本研究團(tuán)隊(duì)前期從青藏高原土壤中分離出一株高產(chǎn)木聚糖酶菌株Neurospora crassaSD10，對菌株產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為今后構(gòu)建木聚糖酶工程菌及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

從青藏高原(青海省海北州門源縣，37° N、101° E)海拔3 175 m處采集土壤，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離、篩選出菌株Neurospora crassaSD10并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：木聚糖5.0 g/L、NaNO33.0 g/L、K2HPO4·3H2O 1.31 g/L、KCl 0.5 g/L、蛋白胨3.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、pH值5.5～6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

木聚糖為自提玉米芯木聚糖，提取方法參考趙龍妹等[15]；3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑配制參考王明瑞等[16]；真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；瓊脂粉(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；磷酸氫二鉀(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；硫酸鎂(上海強(qiáng)順化工有限公司)；硝酸鈉(成都市科龍化工試劑廠)；氯化鉀(西隴化工股份有限公司)。

1.2 主要儀器設(shè)備

TGL-16G 高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、CX31 生物顯微鏡(OLYMPUS 有限公司)、超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)、LS-30 壓力蒸汽滅菌器、THZ-92C 氣浴恒溫振蕩器、SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州人和儀器廠)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液制備

菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min，培養(yǎng)72 h 后取發(fā)酵液12 000 r/min 離心10 min，制得上清液即為粗酶液。

1.3.2 木聚糖酶活力的測定

采用DNS 法測定木聚糖酶活力。75 μL 粗酶液(對照組粗酶液煮沸滅活)與675 μL 底物(1%木聚糖溶液)混勻，40 ℃水浴反應(yīng)10 min，立即加入750 μL DNS 終止反應(yīng)，沸水浴10 min 顯色，冷卻至室溫后，540 nm 波長測定吸光度。每組試驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)，取其平均值。

酶活力定義：在pH 值為7，40 ℃條件下，每分鐘水解1%木聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位，以“U/mL”表示。

1.4 酶學(xué)特性

1.4.1 溫度對木聚糖酶相對酶活力的影響

測定粗酶液在20、30、40、50、60、70 ℃的木聚糖酶活力以確定酶的最適反應(yīng)溫度。粗酶液在40、50、60、70 ℃保溫1 h后，40 ℃測定剩余木聚糖酶活力，確定酶的溫度穩(wěn)定性。

1.4.2 pH值對木聚糖酶活力的影響

測定粗酶液在pH 值為4、5、6、7、8、9、10 條件下的木聚糖酶活力以確定酶的最適反應(yīng)pH值。粗酶液與pH 值為4、5、6、7、8 的緩沖液1∶1 混勻，保溫1 h，40 ℃測定剩余木聚糖酶活力，確定酶的pH值穩(wěn)定性。

1.4.3 金屬離子對木聚糖酶活力的影響

在酶的反應(yīng)體系中分別加入10 mmol/L 的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+，以不添加金屬離子為對照組，40 ℃測定木聚糖酶活力。

1.5 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 營養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)酶的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，考察不同碳源[羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、葡萄糖、蔗糖、麩皮、木聚糖、玉米秸稈、玉米芯、花生秧]及碳源添加量(1%、2%、3%、4%、5%)對目標(biāo)菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的影響。考察不同氮源(尿素、硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉、豆粉)及氮源添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%)對目標(biāo)菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的影響?？疾觳煌饘匐x子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+)及金素離子添加量(0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)對目標(biāo)菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的影響。在28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h測定木聚糖酶活力。

1.5.2 培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基上，分別考察培養(yǎng)溫度(18、23、28、33、38 ℃)、pH 值(5、6、7、8、9)、搖床轉(zhuǎn)速(170、200、230 r/min)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)對目標(biāo)菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的影響，恒溫振蕩培養(yǎng)72 h測定木聚糖酶活力。

1.5.3 營養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果基礎(chǔ)上，以最佳碳源、氮源、金屬離子為自變量，以酶活力為考察指標(biāo)。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，按照L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.5.4 菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定

目的菌株在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下培養(yǎng)，每6 h 取樣稱重并測定木聚糖酶活力，繪制菌株的產(chǎn)酶曲線和生長曲線。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析及差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 酶學(xué)特性研究

2.1.1 溫度對木聚糖酶相對酶活力的影響

以木聚糖酶相對酶活力最大值為100%。如圖1(A)所示，木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在20～50 ℃之間相對酶活力隨溫度的升高而增大，在40～70 ℃之間相對酶活力保持在60%以上。

圖1 溫度對菌株SD10木聚糖酶相對酶活力的影響

如圖1(B)，木聚糖酶相對酶活力在40～50 ℃相對酶活力能保持在80%以上，說明此酶在與動(dòng)物體溫接近的溫度下(40 ℃)有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)相對酶活力迅速下降。

2.1.2 pH值對木聚糖酶相對酶活力的影響

以木聚糖酶相對酶活力最大值為100%。結(jié)果如圖2(A)所示，在pH 值4～6 之間相對酶活力隨pH值的升高而增大，pH 值大于7 時(shí)相對酶活力快速下降。因此，該木聚糖酶相對酶活力最適反應(yīng)pH 值為6。

圖2 pH值對菌株SD10木聚糖酶相對酶活力的影響

如圖2(B)所示，木聚糖酶相對酶活力在pH值4～8的范圍內(nèi)有良好的穩(wěn)定性，相對酶活力均在80%以上。

2.1.3 金屬離子對木聚糖酶相對酶活力的影響

以對照組木聚糖酶相對酶活力為100%。如圖3所示，F(xiàn)e2+、Zn2+、K+對木聚糖酶相對酶活力有促進(jìn)作用，Na+、Mg2+、Ca2+對木聚糖酶活力有較弱的抑制作用，Mn2+、Cu2+對木聚糖酶相對酶活力有較強(qiáng)的抑制作用。

圖3 金屬離子對菌株SD10木聚糖酶相對酶活力的影響

2.2 菌株SD10發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

菌株SD10利用麩皮、玉米秸稈、玉米芯、花生秧產(chǎn)木聚糖酶的能力優(yōu)于葡萄糖、蔗糖、CMC-Na、木聚糖產(chǎn)木聚糖酶活力(見圖4)。麩皮為碳源時(shí)，木聚糖酶活力最高，其次是玉米秸稈和玉米芯；葡萄糖、蔗糖為碳源時(shí)，酶活力較低。因此，選取麩皮作為最佳碳源。

圖4 不同碳源對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖5 麩皮添加量對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖5所示，麩皮的添加量由1%增加到3%時(shí)木聚糖酶活力逐漸增加，添加量為3%以后木聚糖酶活力逐漸下降。可能是由于麩皮濃度過大形成較厚的懸浮物，使麩皮與發(fā)酵液混合不均勻，影響營養(yǎng)物質(zhì)的利用，降低發(fā)酵過程中的溶氧量，不利于發(fā)酵產(chǎn)酶[17]。因此，選3%為麩皮最佳添加濃度。

2.2.2 氮源對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖6 不同氮源對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖7 蛋白胨添加量對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖6所示，蛋白胨為氮源時(shí)，菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力最高，豆粉、硝酸鈉為氮源時(shí)酶活力次之。因此，選擇蛋白胨為最佳氮源。如圖7 所示，蛋白胨添加量由1%增加到3%時(shí)，木聚糖酶活力逐漸升高。添加量為3%時(shí)，木聚糖酶活力最高，添加量繼續(xù)增大，木聚糖酶活力下降。因此，選取3%為蛋白胨的最佳添加濃度。

2.2.3 金屬離子對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖8 不同金屬離子對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖8 所示，培養(yǎng)基中添加Mn2+時(shí)，菌株SD10 產(chǎn)木聚糖酶活力最高，Mg2+、Na+次之。因此，選Mn2+為最佳金屬離子。

圖9 Mn2+的添加量對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖9 所示，Mn2+的添加量為0.1%時(shí)，菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力最高，因此，選取0.1%為金屬離子Mn2+的最佳添加濃度。

圖10 培養(yǎng)溫度對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

2.2.4 培養(yǎng)溫度對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響如圖10 所示，培養(yǎng)溫度在18～33 ℃時(shí)，隨著溫度升高，木聚糖酶活力逐漸增大，33 ℃時(shí)酶活力達(dá)最高值，高于33 ℃后木聚糖酶活力下降。因此，選取33 ℃作為最佳培養(yǎng)溫度。

2.2.5 培養(yǎng)基初始pH 值對菌株SD10 產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖11 初始pH值對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖11所示，培養(yǎng)基初始pH值為5～8時(shí)，木聚糖酶活力隨pH 值增大而升高，在pH 值為8 時(shí)，木聚糖酶活力達(dá)到最大。因此，選擇pH 值8 為培養(yǎng)基初始pH值。

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖12 搖床轉(zhuǎn)速對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖12所示，隨著搖床轉(zhuǎn)速增加，木聚糖酶活力升高。搖床轉(zhuǎn)速為230 r/min 時(shí)，木聚糖酶活力最大。因此，選取230 r/min為培養(yǎng)時(shí)的搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.7 接種量對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

圖13 接種量對菌株SD10產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

如圖13 所示，接種量為2%時(shí)，木聚糖酶活力達(dá)到最高。接種量過大，菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積聚抑制酶的合成，木聚糖酶活力持續(xù)下降。選取2%的接種量為最佳接種量。

2.2.8 營養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

以麩皮添加量(A)、蛋白胨添加量(B)、Mn2+添加量(C)為自變量，菌株SD10木聚糖酶活力為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，按照L9(34)正交表設(shè)計(jì)（見表1），試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由正交試驗(yàn)結(jié)果，通過R 值比較分析，對木聚糖酶活力的影響順序?yàn)镃＞A＞B，Mn2+添加量(C)是對木聚糖酶活力影響最大的因素，最佳培養(yǎng)基配方為A1B1C1(麩皮添加量30 g/L、蛋白胨添加量20 g/L、Mn2+添加量0.5 g/L)。

表1 菌株SD10營養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 菌株SD10正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 菌株生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定

圖14 菌株SD10的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

如圖14 所示，菌株SD10 的生長時(shí)期分別為：0～30 h 為遲緩期，生長曲線較平緩，菌體數(shù)量較少；30～60 h 為對數(shù)期，菌體數(shù)量快速增多，菌體代謝旺盛；60～66 h為穩(wěn)定期，菌體的數(shù)量達(dá)到最大值；66 h以后為衰亡期，菌體數(shù)量開始下降。菌株SD10 所產(chǎn)木聚糖酶在0～18 h 時(shí)木聚糖酶活力處于較低水平且增速較慢，18～78 h木聚糖酶活力快速增大，在84 h時(shí)達(dá)到最大值，90 h之后開始下降。

3 討論

木聚糖是半纖維素的主要成分，處于纖維素與木質(zhì)素的交界處，維持纖維抱合力和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性[18]，所以木聚糖酶對木質(zhì)纖維素的降解有重要作用。本研究選取菌株Neurospora crassa具有完整的木質(zhì)纖維素降解酶系，能夠合成多種纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶，同時(shí)可以避免由纖維二糖積累引起的反饋抑制[19-20]。Neurospora crassa不僅具備強(qiáng)大的蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌能力，菌體內(nèi)還含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素B12和多種酶類，而且具有培養(yǎng)簡單，生長迅速，無霉菌毒素生成等優(yōu)點(diǎn)[21-22]，因此可安全用于生產(chǎn)發(fā)酵。

本研究中Neurospora crassaSD10 木聚糖酶具有良好pH 值穩(wěn)定性，在酸性和中性環(huán)境下都能維持80%以上的酶活力。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，菌株SD10最高酶活力達(dá)到9.4 U/mL，較初篩時(shí)提高了19.9 倍。在后續(xù)研究中可通過基因工程技術(shù)進(jìn)一步提高木聚糖酶表達(dá)水平，改善木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，為以后的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從青藏高原土壤中篩選得到一株高產(chǎn)木聚糖酶菌株Neurospora crassaSD10，對其進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果表明，菌株SD10產(chǎn)酶的最佳條件為：麩皮30 g/L、蛋白胨20 g/L、Mn2+0.5 g/L、培養(yǎng)溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速230 r/min、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間84 h、初始pH值8.0。菌株SD10所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在40～50 ℃有較好的穩(wěn)定性，能保持80%以上的酶活力。該酶最適反應(yīng)pH 值為6.0，在pH 值4.0～8.0 之間酶活力穩(wěn)定維持在80%以上；Fe2+、Zn2+、K+對酶活力有促進(jìn)作用，Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+對酶活力有抑制作用。