春秋兩季油樟葉的油細(xì)胞形態(tài)、精油成分及其抗氧化活性研究

程 賢，畢良武*，李勝男，陳玉湘，趙振東，莫開林

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042；2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081)

油樟是中國(guó)特有的樟科樟屬樹種，主要分布在我國(guó)的四川省，此外，湖南、廣東、重慶等省市也有種植[1]。油樟精油的主要成分包括醇類、烴類、酯類、醛類等[2]。醇類成分以1,8-桉葉油素和α-松油醇為主，烴類以萜類為主，包括γ-松油烯、α-蒎烯和石竹烯等[3]。油樟精油的主要成分具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用，是天然抗氧化劑的重要來源，具有廣闊的應(yīng)用前景[4-6]。李嘉欣等[7]采用DPPH、ABTS、FRAP法對(duì)樟樹精油的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究表明：油樟精油質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率約20%，對(duì)ABTS自由基也有一定的清除能力。王藝蓓等[8]用近紅外技術(shù)對(duì)加入油樟精油樣品的 DPPH和ABTS溶液進(jìn)行光譜分析，結(jié)果表明：油樟精油對(duì)兩種自由基具有較高的清除率。史峻銘等[9]研究表明采用低共熔溶劑微波輔助蒸餾法獲得的油樟精油對(duì)ABTS自由基的清除能力遠(yuǎn)高于DPPH自由基。由此可見，油樟精油在治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病，如癌癥、糖尿病和心血管疾病方面具有一定的藥用價(jià)值，在開發(fā)食品天然防腐劑及抗氧化劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，油樟精油的化學(xué)成分和生物活性研究仍然是油樟研究的重點(diǎn)。目前，對(duì)不同季節(jié)油樟葉的精油化學(xué)成分及抗氧化活性變化的研究未見報(bào)道，同時(shí)對(duì)于不同季節(jié)油樟油細(xì)胞形態(tài)變化也鮮有報(bào)道。本研究以不同季節(jié)采集的油樟葉為研究對(duì)象，首先利用光學(xué)顯微鏡對(duì)油細(xì)胞密度、直徑進(jìn)行對(duì)比研究，利用掃描電鏡(SEM)在超微水平上進(jìn)一步觀察油細(xì)胞；其次利用GC-MS對(duì)水蒸氣蒸餾法提取所得精油進(jìn)行成分分析，利用GC對(duì)精油主成分進(jìn)行含量測(cè)定；最后對(duì)精油的總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，初步探索不同季節(jié)對(duì)油樟葉精油品質(zhì)的影響，以期為油樟葉的科學(xué)采集提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

1,8-桉葉素(純度98%)、α-松油醇(純度95%)和γ-松油烯(純度95%)均購自上海麥克林生化科技有限公司；戊二醛水溶液(體積分?jǐn)?shù)2.5%)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸(Vc)、氫氧化鈉、雙氧水、無水乙醇和甲醇均為分析純。

島津GC-2014AF氣相色譜(GC)儀，配有Rtx-5型石英毛細(xì)管色譜柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μmol/L)，F(xiàn)ID 檢測(cè)器，日本島津儀器有限公司；7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀，美國(guó)安捷倫公司；S3400-I型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本日立公司；Eclipse E200生物顯微鏡，日本尼康儀器有限公司；LD-UPW-V超純水制備儀，上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司；AB135-S十萬分之一電子天平；FZ102型植物粉碎機(jī)；TGL-16B高速離心機(jī)。

1.2 油樟葉的采集

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li)，樹齡為10年，在四川省宜賓市翠屏區(qū)思坡鎮(zhèn)會(huì)詩村隨機(jī)選擇10棵樹作為樣株，分別于春季(2019年5月)和秋季(2019年11月)采集葉樣。每次采樣時(shí)，在每棵樣株的東、西、南、北不同方位分別等量采摘，并充分混合，作為試驗(yàn)用葉樣[10]。

1.3 油細(xì)胞形態(tài)研究

1.3.1光學(xué)顯微鏡測(cè)量 在油樟葉片中下部且無葉脈處，剪取5 mm×5 mm的樣本，浸泡在5%的氫氧化鈉水溶液中，在65 ℃恒溫箱內(nèi)放置48 h，取出后先用水沖洗2次，然后于雙氧水中浸泡15 min，最后取出樣本置于載玻片上，小心蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。盡快使用生物顯微鏡對(duì)處理好的樣本進(jìn)行觀察和拍攝，在10倍視野下拍攝樣本，并記錄油細(xì)胞數(shù)目作為該樣本中油細(xì)胞的密度，在40倍視野下借助Image View軟件中的測(cè)量工具對(duì)油細(xì)胞直徑進(jìn)行測(cè)量[11]。

1.3.2掃描電鏡分析 在油樟葉片中下部且無葉脈處，剪取2 mm×10 mm的樣本，立即投入電鏡固定液(2.5%的戊二醛水溶液)，抽氣至樣本沉底，在室溫環(huán)境下固定2 h，經(jīng)過冷凍干燥后，放入離子濺射儀中，在5 Pa的真空度、30 mA的電流下噴金鍍膜30 s。使用掃描電子顯微鏡對(duì)處理好的樣本進(jìn)行觀察和拍攝[12]。

1.4 油樟精油的提取及成分研究

1.4.1精油的提取 將油樟葉片適度粉碎，碎片約5 mm×5 mm，準(zhǔn)確稱量40 g粉碎后的葉片放入蒸餾器中，連接好揮發(fā)油提取器，開始加熱蒸餾，待揮發(fā)油提取器中有冷凝水流出開始計(jì)時(shí)，5 h后停止加熱，收集上層精油，并精確稱質(zhì)量，在2～8 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。針?duì)兩種試驗(yàn)用葉樣分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，以油樟葉片的干質(zhì)量計(jì)算精油的提取得率。

1.4.2GC-MS分析 將提取所得油樟精油樣品用乙醇稀釋5倍，使用0.45 μm濾頭過濾，采用GC-MS分析其化學(xué)成分和含量。GC-MS分析所采用的氣相條件：色譜柱為Rtx-5石英毛細(xì)管柱；載氣為He，1.6 mL/min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；進(jìn)樣量為0.2 μL；分流比為100 ∶1；色譜柱升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升至280 ℃保持20 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，電離源溫度為230 ℃，電子轟擊能量為70 eV，掃描質(zhì)核比(m/z)范圍為50～500。

1.4.3GC分析 分別精密稱取1,8-桉葉素、α-松油醇和γ-松油烯3種對(duì)照品，用乙醇配制成約120 g/L的對(duì)照品母液。各取100 μL的3種對(duì)照品母液混合，得到各對(duì)照品質(zhì)量濃度約為40 g/L的混合對(duì)照品母液，梯度稀釋至約0.05、1、5、10和20 g/L，膜過濾以供GC測(cè)量分析，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，GC峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密移取提取所得油樟精油樣品，用乙醇稀釋40倍，微孔濾膜過濾以供GC測(cè)量分析。GC分析采用GC-MS分析時(shí)所使用的氣相條件。

1.5 油樟精油抗氧化活性研究

1.5.1總抗氧化能力 用無水乙醇將提取所得油樟精油樣品配制成不同質(zhì)量濃度梯度(0.01～10.00 g/L)的待測(cè)液，按照總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作。在520 nm 測(cè)定樣品吸光度，以抗壞血酸(Vc)溶液為陽性對(duì)照，以無水乙醇作為空白對(duì)照。在37 ℃時(shí)，每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度值每分鐘增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位，由此計(jì)算油樟精油的總抗氧化能力(U/mL)[13]。

1.5.2DPPH自由基清除能力 用無水乙醇將提取所得油樟精油樣品配制成不同質(zhì)量濃度梯度(0.01～10.00 g/L)的待測(cè)液，取不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液0.5 mL，加入0.5 mL DPPH乙醇溶液，混勻室溫放置30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度，以Vc溶液為陽性對(duì)照，以無水乙醇作為空白對(duì)照。根據(jù)公式計(jì)算油樟精油的DPPH自由基(DPPH·)清除率[14]。

式中：ηDPPH·—DPPH·清除率，%；At—樣品吸光度；A0—空白吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，平行實(shí)驗(yàn)≥3次，并使用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 油細(xì)胞差異分析

a.春季spring，×10；b.春季spring，×40;c.秋季autumn，×10；d.秋季autumn，×40圖1 油樟葉片中油細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Oil cell morphology in leaves of C.longepaniculatum

2.1.1油細(xì)胞形態(tài) 圖1(a)和(c)為普通光學(xué)顯微鏡10倍視野下所拍攝的春秋兩季油樟葉片中油細(xì)胞的形態(tài)。由圖可知油樟葉片中的油細(xì)胞以單個(gè)的形式分布于薄壁組織中，大多數(shù)分布在脈間區(qū)，少數(shù)分布在脈上，因此油細(xì)胞與其他組織細(xì)胞相比較，在分布形式上具有明顯的區(qū)別[15]。隨機(jī)挑選3張10倍視野下拍攝的照片，并統(tǒng)計(jì)該視野下油細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表明：春季和秋季油樟葉片的油細(xì)胞密度分別為(41±3)和(38±2)個(gè)/mm2，說明春季油樟葉片中油細(xì)胞密度偏大。圖1(b)和(d)為普通光學(xué)顯微鏡40倍視野下所拍攝的油樟葉片中油細(xì)胞的形態(tài)，由圖可知油細(xì)胞為圓形或橢圓形。隨機(jī)挑選1張40倍視野下拍攝的照片，并測(cè)量該視野下油細(xì)胞的直徑，結(jié)果表明：春季和秋季油樟葉片的油細(xì)胞直徑分別為(51.87±1.64)和(36.89±2.64) μm，說明春季油樟葉片中油細(xì)胞直徑偏大。推測(cè)是春季油樟葉光合速度較快，吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力較強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了油細(xì)胞的形成和增長(zhǎng)。

2.1.2亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 圖2(a)和(d)為分別為春秋兩季油樟葉片中油細(xì)胞的SEM圖，在2 000倍視野下可以觀測(cè)到油樟葉片中油細(xì)胞為橢圓球，細(xì)胞邊緣明顯，與光學(xué)顯微鏡的觀測(cè)結(jié)果一致，隨機(jī)選擇2處油細(xì)胞的邊緣位置放大至20 000倍，在超微水平上進(jìn)一步觀察油細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，如圖2(b)、(c)、(e)和(f)所示。

春季spring：a.×2 000；b.×20 000；c.×20 000秋季autumn：d.×2 000；e.×23 000；f.×21 000圖2 油樟葉片中油細(xì)胞的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of oil cell in C.longepaniculatum leaves

由于圖中細(xì)胞壁僅有初生纖維素壁層，初步推斷采集的葉片樣本中油細(xì)胞均尚未發(fā)育成熟[16]，可能處于細(xì)胞發(fā)育的第一階段。圖1(b)和1(d)所拍攝的油細(xì)胞尚未呈現(xiàn)為一個(gè)大油囊，細(xì)胞質(zhì)尚未完全解體，屬于油細(xì)胞發(fā)育第一階段的特征。因此，圖2(b)、(c)、(e)、(f)和圖1(b)、(d)的拍攝結(jié)果相互驗(yàn)證，均表明本研究所采集的春季和秋季油樟葉中油細(xì)胞均處于細(xì)胞發(fā)育的第一階段。春秋兩季細(xì)胞壁厚度的平均值分別在1.65和0.63 μm左右，說明春季油樟葉油細(xì)胞在細(xì)胞發(fā)育第一階段的細(xì)胞壁厚度大于秋季油樟葉，可能與春季油樟葉光合速度較快有關(guān)。

2.2 油樟精油提取得率及成分分析

2.2.1油樟精油提取得率 分別計(jì)算春季和秋季油樟葉扣除水分后的油樟精油提取得率，結(jié)果表明：春季和秋季油樟葉的精油提取得率分別為4.45%和3.09%。所采集的油樟葉中油細(xì)胞處于細(xì)胞發(fā)育的同一階段，但是春季油樟葉油細(xì)胞密度和細(xì)胞直徑均大于秋季油樟葉，這可能是導(dǎo)致春季油樟葉精油提取得率高于秋季油樟葉的重要原因。

2.2.2油樟精油化學(xué)成分 將春季和秋季油樟葉提取所得精油進(jìn)行GC-MS分析，通過NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫以及PubMed數(shù)據(jù)庫，共鑒定出16個(gè)化學(xué)物，利用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的含量，最終結(jié)果見表1。由表1可知，春秋兩季所采集油樟葉精油的主要化學(xué)成分相同，1,8-桉葉油素為含量最高的成分，相對(duì)峰面積超過50%，在秋季油樟葉中含量高。α-松油醇相對(duì)峰面積超過20%，在春季油樟葉中含量高。β-水芹烯相對(duì)峰面積超過5%，在春季油樟葉中含量高。其他相對(duì)峰面積超過1%的化合物分別是β-蒎烯、4-松油醇和γ-松油烯，均在秋季油樟葉中含量高。

表1 不同季油樟葉的精油成分Table 1 Volatile compounds identified in C.longepaniculatum leaves essential oil from different seasons

2.2.3油樟精油主成分含量 為了進(jìn)一步精確地比較春秋兩季油樟精油主要成分的含量，借助GC對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。首先利用GC對(duì)1,8-桉葉素、α-松油醇和γ-松油烯對(duì)照品所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制出3種對(duì)照品的校正曲線，結(jié)果見表2。

表2 GC測(cè)定主要成分含量結(jié)果Table 2 The contents of main compounds measured by GC

3條校正曲線的校正系數(shù)均≥0.999，在相應(yīng)的定量范圍內(nèi)可用于樣品中主要成分的含量計(jì)算。計(jì)算結(jié)果表明：3個(gè)主要成分在油樟精油中含量順序由大到小為1，8-桉葉素>α-松油醇>γ-松油烯，其中1，8-桉葉素和γ-松油烯在秋季精油中略高，α-松油醇在春季精油中略高，這與GC-MS峰面積歸一化法計(jì)算結(jié)果一致。對(duì)3次測(cè)量結(jié)果分別進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明T檢驗(yàn)的P值均大于0.05，3種主要成分在春秋兩季油樟精油中的含量沒有顯著性差異。

2.3 油樟精油抗氧化活性分析

2.3.1總抗氧化能力 春秋兩季油樟葉提取所得油樟精油及Vc在不同質(zhì)量濃度時(shí)的總抗氧化能力見圖3(a)。由圖可見，2種油樟精油的總抗氧化能力都隨著溶液質(zhì)量濃度的增加先增強(qiáng)而后趨于穩(wěn)定，與Vc總抗氧化能力隨質(zhì)量濃度變化的趨勢(shì)相同。春秋兩季油樟葉提取所得油樟精油的總抗氧化能力在溶液質(zhì)量濃度為0.8～2.0 g/L時(shí)達(dá)到最大，分別為6.50和5.50 U/mL，約等于Vc總抗氧化能力的40%，其中春季油樟葉提取所得油樟精油總抗氧化能力略高。

2.3.2DPPH·清除能力 隨著油樟精油和Vc的質(zhì)量濃度增加，各種物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除率均表現(xiàn)為先增加最后趨于穩(wěn)定(見圖3(b))。當(dāng)質(zhì)量濃度低于1.0 g/L時(shí)，油樟精油的DPPH·清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加。計(jì)算各物質(zhì)的IC50值，春秋兩季油樟葉提取所得油樟精油的IC50均為0.2 g/L。由此可知，油樟精油在清除DPPH·方面具有較好活性，并且兩種油樟精油的清除DPPH·自由基能力基本沒有差異。

a.總抗氧化能力total antioxidant capability;b.DPPH·圖3 油樟精油的體外抗氧化性能Fig.3 The in vitro antioxidant properties of C.longepaniculatum essential oil

3 結(jié) 論

3.1利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)春秋兩季油樟葉中油細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行差異分析。結(jié)果表明：春季油細(xì)胞的細(xì)胞密度、細(xì)胞直徑和細(xì)胞壁厚度均大于秋季油細(xì)胞。

3.2春季油樟葉的油樟精油提取得率高于秋季葉，GC-MS的鑒定結(jié)果表明春秋兩季油樟精油主要成分均為1，8-桉葉素、α-松油醇和γ-松油烯。1,8-桉葉素和γ-松油烯在秋季油樟精油中的含量略高，α-松油醇在春季油樟精油中含量略高。

3.3春秋兩季的油樟精油抗氧化能力與溶液濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性，溶液質(zhì)量濃度為0.8～2.0 g/L時(shí)達(dá)到最大，約等于Vc總抗氧化能力的40%，春季油樟精油總抗氧化能力略高。春秋兩季油樟精油在清除DPPH自由基方面具有較好活性，IC50均為0.2 g/L，基本無差異。