基于海藻酸鈉/磷蝦蛋白的支架材料制備及其性能

殷聚輝， 郭 靜,2， 王 艷,2， 曹 政， 管福成,2， 劉樹興

(1. 大連工業(yè)大學(xué) 紡織與材料工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2. 遼寧省功能纖維及復(fù)合材料工程技術(shù)中心， 遼寧 大連 116034)

因糖尿病、外傷和手術(shù)灼傷而導(dǎo)致的皮膚缺損是常見現(xiàn)象。直徑1 cm以上的傷口或全層缺損需要植皮，以防止形成更嚴(yán)重的疤痕及由此導(dǎo)致的外觀毀損和功能障礙[1]。自體移植數(shù)量有限和自然資源供量不足使相關(guān)治療受限，而人工組織支架材料的應(yīng)用為患者的康復(fù)提供了更大的可能。

海藻酸鈉因具有良好的生物相容性[2]和生物降解性、低毒性及成膜性[3]成為傷口愈合、軟骨修復(fù)、藥物輸送等方面的優(yōu)選材料[4-6]，但單一海藻酸鈉制備的組織支架材料存在脆性大、強(qiáng)度低、耐水性差等[7]問題，因此對(duì)其改性受到了越來越多的關(guān)注。在眾多改性方法中，利用海藻酸鈉的聚陰離子性質(zhì)與具有陽離子特性的大分子，如纖維蛋白[8]、絲素蛋白和透明質(zhì)酸[9]，構(gòu)筑聚電解質(zhì)復(fù)合體系可有效改善支架材料的強(qiáng)度和生物相容性。其中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)的改變會(huì)極大影響到材料的各項(xiàng)性能。文獻(xiàn)[10]分析了海藻含量變化對(duì)藻酸鹽膠囊物理性質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，增加海藻酸鈉濃度會(huì)使其直徑和收縮率增大。陳娜麗等[11]以海藻酸鈉(SA)為軟模板，采用原位氧化聚合法制備了聚苯胺/海藻酸鈉(PANI/SA)電極材料，研究發(fā)現(xiàn)PANI/SA的比電容隨SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低。由此可見，溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)材料的性能有顯著的影響。南極磷蝦產(chǎn)量巨大，且富含與人體相似的蛋白質(zhì)源[12]，經(jīng)稀堿提取的磷蝦蛋白(AKP)在弱堿性環(huán)境中具有陽離子特性，將其與海藻酸鈉共混可明顯提高纖維的力學(xué)性能[13]，改善耐水性。本文研究在前期工作基礎(chǔ)[14-15]上，使用低溫誘導(dǎo)相分離-化學(xué)交聯(lián)法制備了SA/AKP支架材料，并研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)支架材料的微觀結(jié)構(gòu)和性能、細(xì)胞毒性等方面的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原 料

南極磷蝦粉：粒徑200～1 000 μm，含水率15%，遼寧漁業(yè)集團(tuán)有限公司；海藻酸鈉，相對(duì)分子質(zhì)量為3×106～5×106，青島明月海藻集團(tuán)有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、二水氯化鈣、鹽酸，均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水氯化鈣，分析純，西隴化工股份有限公司；L929成纖細(xì)胞，廣州吉妮歐生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8，合肥新恩源生物技術(shù)有限公司；75%乙醇，鐵嶺康泰消毒劑有限公司；PBS，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 AKP提取與SA/AKP支架材料的制備

先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉溶液，升溫到40 ℃，按浴比為1∶30加入南極磷蝦粉，攪拌并升溫到70 ℃，恒溫處理2 h，降溫到常溫，過濾，除去不溶物，向?yàn)V液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值到等電點(diǎn)，過濾，取濾餅，室溫風(fēng)干，得到南極磷蝦蛋白AKP，其相對(duì)分子質(zhì)量約20 000(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法)。

將AKP用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的NaOH溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值至7，然后加入SA，攪拌直至完全溶解，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%的SA/AKP溶液，其中SA與AKP質(zhì)量比為5∶1。將制備的溶液靜置脫泡，使用刮膜機(jī)刮膜、預(yù)冷凍、冷凍干燥、氯化鈣凝固浴交聯(lián)，水洗和干燥后制成SA/AKP支架材料，制備工藝流程見圖1。

圖1 SA/AKP支架的制備過程Fig.1 Schematic diagram of preparation of SA/AKP scaffold

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 表面形貌觀察

采用JSM-7800F型掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子公司)觀察SA/AKP支架的斷面形貌，加速電壓為10 kV。SA/AKP支架平均孔徑和孔徑分布通過Nano Measurer軟件和高斯擬合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。

1.3.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)試

采用Spectrum-One B型紅外光譜儀(FT-IR，美國(guó)PE公司)分析SA/AKP支架材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將SA/AKP支架材料粉碎，用KBr 壓片制樣，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.3 孔隙率與透氣性測(cè)試

孔隙率：使用液體置換法測(cè)量SA/AKP支架孔隙率[16]。

透氣性：稱量瓶中稱取適量去離子水，用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP的樣品密封瓶口，分別標(biāo)為D1、D2、D3、D4、D5，以未放置樣品的稱量瓶為對(duì)照組，標(biāo)號(hào)D0，在干燥器中避光放置24 h，透氣率公式[17]為

式中：R為樣品透氣率；Dn為n號(hào)樣品24 h失水量，g；D0為對(duì)照組24 h失水量，g。

1.3.4 液體吸收性

使用容量瓶配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液作為生理鹽水備用；仿人體血清由氯化鈉和氯化鈣的溶液組成，溶液含142 mmol鈉離子和2.5 mmol的鈣離子，此含量與人體血清相當(dāng)。剪取2 cm×2 cm 樣品，置于干燥器中恒溫干燥24 h，稱量W0，再將樣品分別置于生理鹽水、仿人體血清、去離子水中12 h，用吸水紙輕拭將表面水分吸干后稱量W1。吸液率K通過下式求得：

1.3.5 力學(xué)性能測(cè)試

將SA/AKP支架材料剪切成長(zhǎng)為40 mm、寬為5 mm 的樣條，每個(gè)系列抽取10個(gè)樣品，用YG004型電子單纖維強(qiáng)力機(jī)(常州市第一紡織設(shè)備有限公司)測(cè)試支架斷裂強(qiáng)度。其中，拉伸速度為20 mm/min， 夾具間隙為30 mm。斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率通過下式可得：

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM image of different mass fraction SA/AKP scaffold

式中：P為斷裂強(qiáng)度，N/mm2；F為斷裂強(qiáng)力，N；S為橫截面積，mm2；E為斷裂伸長(zhǎng)率,%；L0為樣品初始長(zhǎng)度，mm；L為斷裂時(shí)的長(zhǎng)度，mm。

1.3.6 細(xì)胞毒性測(cè)試

采用浸提液法對(duì)支架材料進(jìn)行毒性測(cè)試，將SA/AKP支架材料用75%乙醇浸洗5 min，然后用磷酸緩沖溶液PBS浸洗5 min，反復(fù)3次后加入純培養(yǎng)基直至沒過材料，靜置24 h后作為浸提液備用。在96孔板中接種L929成纖細(xì)胞懸液，在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃、5%CO2)，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入10 μL先前制備好的SA/AKP支架材料浸提液，不加浸提液的為空白組。將培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h。取出L929細(xì)胞培養(yǎng)板，向板的每個(gè)孔中加入110 μL CCK-8培養(yǎng)基混合液，將細(xì)胞板在培養(yǎng)箱中孵育30 min后取出，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔吸光度，取平均值并通過對(duì)照組評(píng)定材料的細(xì)胞毒性，以細(xì)胞的增殖度為標(biāo)準(zhǔn)(見表1)劃分安全等級(jí)[18]。

表1 細(xì)胞增殖率與毒性水平的對(duì)應(yīng)關(guān)系Tab.1 Correspondence between cell proliferation rate and cytotoxicity level

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

2.1 SA/AKP支架材料形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的SEM照片、孔徑分布分別如圖2、3所示。

從圖可看到：SA/AKP支架材料具有致密微孔結(jié)構(gòu)，在SA/AKP溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%和3.5%時(shí)，微孔大小形狀相對(duì)雜亂，孔徑大小差異較大；溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，微孔大小均一，平均孔徑為54.11 μm，形狀規(guī)整；溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到4.5%以后，溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大，出現(xiàn)粘連，孔隙結(jié)構(gòu)被破壞。據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，細(xì)胞最適宜生長(zhǎng)的孔徑為20～125 μm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)的SA/AKP支架孔徑大小適合人體細(xì)胞生長(zhǎng)，為本研究提供了前提條件。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的孔徑分布圖Fig.3 Pore size distribution image of different mass fraction SA/AKP scaffold

2.2 SA/AKP支架材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

SA和AKP以及SA/AKP支架的FT-IR光譜如圖4所示。從圖可看出：AKP在1 657 cm-1(酰胺Ⅰ譜帶)與1 533 cm-1(酰胺Ⅱ譜帶)處出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的特征吸收峰；SA在1 420 cm-1(COO-對(duì)稱伸縮振動(dòng))與1 632 cm-1(不對(duì)稱伸縮振動(dòng))處，2 922 cm-1(—CH伸縮振動(dòng))與3 408 cm-1(—OH伸縮振動(dòng))處出現(xiàn)明顯特征吸收峰。而SA/AKP支架未出現(xiàn)新峰，但羥基、氨基特征峰向右偏移至3 435 cm-1處。

圖4 SA和AKP以及SA/AKP支架的FT-IR光譜Fig.4 FT-IR spectra of SA and AKP and SA/AKP scaffold

這是因?yàn)楹Ｔ逅徕cCOO-與Ca2+產(chǎn)生螯合作用，使得OH…O類型氫鍵減少，成鍵電子云密度升高而導(dǎo)致羥基峰右移。圖中1 632和1 420 cm-1處COO-不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰位置向低波束移動(dòng)到1 615 cm-1和1 417 cm-1處。這說明SA與AKP支架在引入Ca2+之后，Ca2+與COO-產(chǎn)生了多重交聯(lián)反應(yīng)，即Ca2+與COO-發(fā)生螯合作用，同時(shí)Ca2+與AKP中含有的COO-反應(yīng)生成凝膠，正是這種作用提高了支架材料的強(qiáng)度和耐水性。

2.3 SA/AKP支架材料孔隙率與透氣率分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的孔隙率和透氣率如圖5所示。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的孔隙率和透氣率Fig.5 Porosity and air permeability of different mass fraction SA/AKP scaffold

從圖可看出，隨SA/AKP溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，支架材料的孔隙率和透氣率逐漸降低。這是因?yàn)殡S著SA/AKP溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，SA/AKP體系內(nèi)有效分子數(shù)增多，分子之間作用增強(qiáng)，水含量減少，預(yù)凍形成冰晶數(shù)量降低，導(dǎo)致孔隙率下降，而透氣率也因?yàn)榭紫堵氏陆刀陆?。海藻酸鈉在二價(jià)陽離子作用下會(huì)發(fā)生膠凝反應(yīng)，主要是古洛糖醛酸片段的Na+與二價(jià)Ca2+發(fā)生離子交換，形成四配位基型“蛋盒”結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定了支架材料的孔隙結(jié)構(gòu)，使其具有較好的孔隙率和透氣率。SA/AKP支架的透氣性模型如圖6所示。水分子和氧氣等通過相互連接的孔洞進(jìn)出支架，實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)的運(yùn)輸。溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí), SA/AKP支架孔隙率為86.4%，透氣率為58.9%，滿足了支架材料的需求[20]。具備良好孔隙率和透氣率的支架可促進(jìn)成纖細(xì)胞的生長(zhǎng)，給皮下組織提供生長(zhǎng)所需氧氣和排出廢氣，并保持適當(dāng)?shù)沫h(huán)境潮濕度，從而有利于表皮組織的生長(zhǎng)，是制備組織工程支架的重要前提。

圖6 SA/AKP支架的透氣性模型Fig.6 Mechanism diagram of air permeability of SA/AKP scaffold

2.4 液體吸收性分析

對(duì)于燒傷、燙傷、潰瘍等傷口，一般會(huì)有膿液流出，所以支架應(yīng)該具有良好的液體吸收性。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的吸液率如圖7所示。

圖7 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的吸液率Fig.7 Liquid absorbency of different mass fraction SA/AKP scaffold

可看出，隨溶液中SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，SA/AKP支架對(duì)仿人體血清、生理鹽水、去離子水的液體吸收性逐漸降低。首先這是因?yàn)殡S溶液中SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，材料孔隙率下降導(dǎo)致吸水率降低，其次是因?yàn)槎嘀鼐W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致閉孔或微小孔，限制了水分子的進(jìn)入，液體吸收模型如圖8所示，被吸收的液體儲(chǔ)存在支架材料的孔洞結(jié)構(gòu)中。當(dāng)SA/AKP溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，SA/AKP支架對(duì)仿人體血清、生理鹽水、去離子水的吸收率分別為1 661.2%、 1 539.0%、 1 283.2%，滿足支架對(duì)液體吸收性要求。

圖8 SA/AKP支架的吸液模型Fig.8 Mechanism diagram of liquid absorption of SA/AKP scaffold

2.5 力學(xué)性能分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的力學(xué)性能如圖9所示。

圖9 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的力學(xué)性能Fig.9 Mechanical properties of different different mass fraction SA/AKP scaffold

由圖可看到，隨溶液中SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，支架的斷裂強(qiáng)度呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡SSA/AKP溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，體系交聯(lián)點(diǎn)增多，相同界面上承受應(yīng)力的有效面積增加，故斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均增加。當(dāng)溶液中SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，斷裂強(qiáng)度達(dá)到15.5 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率達(dá)到6.6%。結(jié)合支架孔洞結(jié)構(gòu)和吸液性認(rèn)為，SA/AKP溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)最優(yōu)。

2.6 細(xì)胞毒性分析

圖10示出采用CCK-8法檢測(cè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SA/AKP材料浸提液對(duì)成纖細(xì)胞增殖的影響。結(jié)合表1細(xì)胞增殖率與毒性水平的對(duì)應(yīng)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架浸提液的細(xì)胞相對(duì)增殖率均大于100%，毒性水平為0級(jí)，不具有細(xì)胞毒性。毒性測(cè)試表明，材料對(duì)細(xì)胞增殖，分化有一定的促進(jìn)作用。因此可認(rèn)為，這種材料具有優(yōu)異的細(xì)胞相容性和生物安全性，可作為醫(yī)用材料使用。

圖10 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA/AKP支架的細(xì)胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of different mass fraction of SA/AKP scaffolds

3 結(jié) 論

本文利用低溫誘導(dǎo)相分離-化學(xué)交聯(lián)法制備了海藻酸鈉/磷蝦蛋白(SA/AKP)支架材料，并探討了支架材料的形貌結(jié)構(gòu)、孔隙率、力學(xué)性能及生物相容性。結(jié)果表明：SA/AKP支架材料的孔隙率和透氣率隨SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)；對(duì)仿人體血清、生理鹽水、去離子水的吸收性隨SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而減少；材料的斷裂強(qiáng)度與斷裂伸長(zhǎng)率隨SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加。不同SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)的支架的浸提液的分級(jí)均大于90%，毒性為0級(jí)。在SA/AKP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，SA/AKP支架材料的孔徑大小在20～96 μm之間，孔徑大小均一，形狀規(guī)整；透氣率為58.9%，孔隙率為86.4%，滿足了支架材料的需求；對(duì)仿人體血清、生理鹽水、去離子水吸收率分別為 1 661.2%、 1 539.0%、 1 283.2%； 斷裂應(yīng)力和斷裂伸長(zhǎng)率分別達(dá)到15.5 MPa、6.6%；毒性為0級(jí)，材料具有優(yōu)異的細(xì)胞相容性和生物安全性。本文研究為SA/AKP組織工程支架提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為新型組織支架材料的應(yīng)用提供了一種新思路。