長(zhǎng)白落葉松HD-Zip基因?qū)ν庠醇に氐捻憫?yīng)模式1)

呂思毓 安旆其 王朋陽 劉牧田 呂汐 祁明惠 張磊

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

同源異型域—亮氨酸拉鏈(HD-Zip)蛋白屬于植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，對(duì)于植物組織分化也有重要意義。HD-Zip包含一個(gè)由61個(gè)氨基酸構(gòu)成的高度保守的同源異型域HD(Homeodomain,HD)和緊隨其后的亮氨酸拉鏈(Leucine zipper,LZ)結(jié)構(gòu)域[1]，共包括4個(gè)亞家族。

HD-Zip基因家族在林木的研究范圍非常廣泛，例如龍眼(拉丁名稱)體胚發(fā)生過程中鑒定得到的HD-Zip基因家族成員可能參與調(diào)控根的發(fā)育及果實(shí)的形成[2]；白樺(拉丁名稱)在應(yīng)答鹽脅迫的過程中有7條HD-Zip基因的表達(dá)量有變化[3]；小黑楊(拉丁名稱)中鑒定得到的63條HD-Zip基因在鹽脅迫條件下葉中有25個(gè)HD-Zip基因下調(diào)表達(dá)，21個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，莖中有42個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，11個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，根中有26個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，24個(gè)基因上調(diào)表達(dá)[4]；茶樹(拉丁名稱)的HD-Zip家族轉(zhuǎn)錄因子IV亞族的CsHB1基因在不同非生物脅迫處理下均能誘導(dǎo)表達(dá),且表達(dá)差異性明顯，證實(shí)該基因家族可以參與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫響應(yīng)、胚胎發(fā)育、分生組織形成等多種過程[5]。Soderma et al.[6]利用激素突變體進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ATHB6和ATHB7的表達(dá)主要依賴于ABA途徑在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)的,同時(shí)它們?cè)隗w內(nèi)的活性還受到絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(ABI1和ABI2)的調(diào)控。Komatsuda T, et al.[7]發(fā)現(xiàn)HAHB10參與GA的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；Himmelbach et al.[8]對(duì)模式植物擬南芥ATHB6的啟動(dòng)子表達(dá)分析后,發(fā)現(xiàn)ATHB6啟動(dòng)子的活性隨著外源ABA濃度的升高而上升。由此猜測(cè)ATHB6可能是與特異的ABA信號(hào)通路匹配的主要開關(guān)。

植物激素生理效應(yīng)復(fù)雜多樣，可以從影響細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)、分化到影響植物發(fā)芽、生根、開花、結(jié)實(shí)、性別決定、休眠、脫落等。吲哚—3—乙酸(IAA)是一種用作刺激植物生長(zhǎng)的激素，對(duì)植物抽枝或芽、苗等的頂部芽端形成有促進(jìn)作用[9]；赤霉素(GA3)可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提早成熟[10]，提高產(chǎn)量和打破休眠[7]，促進(jìn)發(fā)芽、分蘗、抽苔，提高果實(shí)結(jié)果率[11]；脫落酸(ABA)是一種抑制生長(zhǎng)的植物激素，它的作用與IAA等生長(zhǎng)類激素相反，對(duì)細(xì)胞的分裂與伸長(zhǎng)起抑制作用，還能抑制胚芽鞘、嫩枝、根和胚軸等器官的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[12]，一般來說，干旱、寒冷、高溫、鹽漬和水澇等逆境都能使植物體內(nèi)ABA迅速增加，同時(shí)抗逆性增強(qiáng)[13]。通過對(duì)長(zhǎng)白落葉松HD-Zip基因響應(yīng)IAA、GA3和ABA這3種外源激素處理的應(yīng)答模式分析可以為該基因家族在針葉樹種的主要功能研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為長(zhǎng)白落葉松分子育種遺傳改良提供重要的基因資源。

1 材料與方法

1.1 長(zhǎng)白落葉松HD-Zip基因

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期基因挖掘的數(shù)據(jù)，獲得2條HD-Zip家族基因，分別命名為L(zhǎng)oHDZ1和LoHDZ3，其分別屬于HD-Zip I亞家族HD-Zip II亞家族。

1.2 落葉松幼苗

試驗(yàn)所用的材料取自于黑龍江省雞西種源的長(zhǎng)白落葉松種子。選取飽滿表面有光澤的長(zhǎng)白落葉松種子，用去離子水浸泡約1周，期間換水3～4次，之后播種于V(豁土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=5∶3∶2的營(yíng)養(yǎng)土基質(zhì)(本試驗(yàn)用到的基質(zhì)都為按此比例配置的營(yíng)養(yǎng)土)中，覆膜保濕，植物生長(zhǎng)培養(yǎng)條件為16 h光照，8 h黑暗，濕度為75%，溫度恒定為22 ℃。

1.3 落葉松HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學(xué)分析

利用BioEdit軟件對(duì)長(zhǎng)白落葉松的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用ExPaSy在線軟件(http://web/expasy/org/protparam/)對(duì)HD-Zip基因的蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化屬性進(jìn)行分析。用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)2條落葉松HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用SWISS MODEL程序?qū)ι鲜?條蛋白序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模。

1.4 外源激素處理

待落葉松的針葉完全伸開后挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的小苗移栽至養(yǎng)苗盆于營(yíng)養(yǎng)土基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)至2～3個(gè)月后，用濃度為50 mg/L的IAA、GA3和ABA溶液以及水(對(duì)照)噴施落葉松苗，并分別于2、4、8、12、24、48、72、96 h取整株落葉松苗提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。ABA，IAA，GA33種激素處理濃度參照欒嘉豫[14]等人的報(bào)告。

1.5 RNA提取及cDNA合成

本試驗(yàn)采用PureLinkTMPlant RNA Reagent試劑盒提取激素處理后的長(zhǎng)白落葉松試驗(yàn)樣品RNA，提取步驟按照RNA提取試劑盒的方法進(jìn)行；采用反轉(zhuǎn)錄Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time(TaKaRa)試劑盒將長(zhǎng)白落葉松的試驗(yàn)樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.6 qRT-PCR

利用Primer5軟件設(shè)計(jì)基因定量引物(表1),利用EXCEL處理數(shù)據(jù)，分析HD-Zip基因的表達(dá)量。

表1 基因定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 落葉松HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因的理化性質(zhì)

將獲得的2條落葉松HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因序列，利用軟件工具等進(jìn)行分析的結(jié)果表明：LoHDZ1基因全長(zhǎng)為1 057 bp，CDS區(qū)域?yàn)?43 bp，相對(duì)分子質(zhì)量為12 439.37，其蛋白等電點(diǎn)為7.04，蛋白脂肪系數(shù)為72.34，蛋白疏水性平均系數(shù)為-0.682。LoHDZ3基因全長(zhǎng)為996 bp，CDS區(qū)域?yàn)?91 bp，相對(duì)分子質(zhì)量為37 507.45，蛋白的等電點(diǎn)為4.69屬酸性范圍內(nèi)，蛋白脂肪系數(shù)為66.31。

兩條基因蛋白脂肪系數(shù)均高于50，表明其蛋白熱穩(wěn)定性較高。LoHDZ1，LoHDZ3蛋白疏水性平均系數(shù)為-0.824，表現(xiàn)為親水性。信號(hào)肽分析和蛋白跨膜分析結(jié)果表明，LoHDZ1和LoHDZ3蛋白不具信號(hào)肽，均為非分泌蛋白及非跨膜蛋白(圖1)。

a為L(zhǎng)oHDZ3蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析；b為L(zhǎng)oHDZ3蛋白質(zhì)的信號(hào)肽組成；c為L(zhǎng)oHDZ3蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；d為L(zhǎng)oHDZ3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中紅色為螺旋，藍(lán)色為無規(guī)卷曲，白色為β轉(zhuǎn)角。

2.2 激素脅迫對(duì)長(zhǎng)白落葉松HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)影響

2.2.1GA3處理下的LoHDZ1、LoHDZ3的表達(dá)量

在長(zhǎng)白落葉松幼苗施用GA3處理之后，LoHDZ1與LoHDZ3基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)基本抑制，LoHDZ1基因表達(dá)量均明顯低于對(duì)照，LoHDZ3基因表達(dá)量也存在不同程度的下調(diào)表達(dá)，尤其是在2、4 h基因的表達(dá)量明顯低于未處理時(shí)期，說明噴施GA3后LoHDZ1和LoHDZ3基因活性受到抑制(表2)。

表2 LoHDZ1以及LoHDZ3在GA3處理下表達(dá)量

2.2.2IAA處理下的LoHDZ1、LoHDZ3的表達(dá)量

長(zhǎng)白落葉松幼苗中的LoHDZ1基因表達(dá)量在生長(zhǎng)素IAA處理后的2、4、12、48 h明顯上調(diào)表達(dá)，LoHDZ3在處理后12 h內(nèi)表達(dá)量略有增加，48 h達(dá)到最大，約為未處理的10倍左右。兩條基因的表達(dá)量在72 h之后與未處理相比發(fā)生明顯下調(diào)(表3)。

表3 LoHDZ1與LoHDZ3在IAA處理下表達(dá)量

2.2.3ABA處理下的LoHDZ1、LoHDZ3的表達(dá)量

經(jīng)過ABA激素處理植株之后，LoHDZ1與LoHDZ3的基因表達(dá)量與未處理時(shí)相比大多為下調(diào)表達(dá)，LoHDZ1基因受到了極大程度的抑制，可推測(cè)該基因?qū)τ贏BA激素的敏感度極高。即便是在處理后48 h表達(dá)量最大時(shí)也只有未處理時(shí)的1/5。LoHDZ3在2到12 h基因表達(dá)量明顯下降，在24 h時(shí)表達(dá)量為未處理時(shí)的1.5倍，72 h時(shí)表達(dá)量約為未處理時(shí)的1.3倍，可以初步推測(cè)LoHDZ3可以響應(yīng)ABA處理，可能與植株抗逆性有一定關(guān)系(表4)。

表4 LoHDZ1與LoHDZ3在ABA處理下表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過3種不同類型的激素處理后，由于分別屬于HD-Zip I亞家族HD-Zip II亞家族，所以LoHDZ1與LoHDZ3基因的表達(dá)模式并不完全一致。從模式植物擬南芥以及水稻的研究來看,HD-Zip家族轉(zhuǎn)錄因子亞家族I和II基因表達(dá)受干旱、高鹽、ABA和冷害等環(huán)境的誘導(dǎo),這兩類基因參與激素信號(hào)途徑,通過調(diào)控與激素途徑相關(guān)基因和下游基因互作來調(diào)控植物細(xì)胞擴(kuò)增、分裂和分化，從而提高植物耐逆性[15]，HD-Zip I亞家族主要在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫、葉片發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用，而HD-Zip II蛋白的功能為介導(dǎo)植物對(duì)環(huán)境改變的應(yīng)答并調(diào)節(jié)其發(fā)育過程[16]。HD-Zip I亞家族的相關(guān)研究表明其功能較為廣泛，例如番茄[17]、甘蔗[18]等植物中HD-Zip I亞家族基因在不同組織部位的表達(dá)特異性能證實(shí)該類基因可能參與調(diào)控植株不同組織器官生長(zhǎng)發(fā)育的過程，特別是甘蔗GT1基因是HD-Zip I同源基因，在HD-Zip I家族蛋白的主要結(jié)構(gòu)域上表現(xiàn)出高度的保守性，表明甘蔗GT1基因也可能參與了甘蔗關(guān)鍵發(fā)育過程的調(diào)控[18]。蘋果當(dāng)中鑒定得到22條HD-ZipⅠ基因可以分別響應(yīng)赤霉素、細(xì)胞分裂素、茉莉酸、乙烯和脫落酸的順式作用元件[19]。其中MdHZ1和MdHZ17可能與果實(shí)的后熟進(jìn)程有較為緊密的聯(lián)系，可以作為候選基因進(jìn)行果實(shí)后熟相關(guān)方面的深入研究。HD-Zip II轉(zhuǎn)錄因子控制激素調(diào)控發(fā)育的過程，缺失后將對(duì)植物生長(zhǎng)素分布和響應(yīng)產(chǎn)生影響[20]。例如油棕EgHOX1屬于HD-Zip II亞家族基因，其在胚胎發(fā)生誘導(dǎo)的早期組織培養(yǎng)階段檢測(cè)到高水平表達(dá)，但外源生長(zhǎng)素對(duì)其誘導(dǎo)作用不明顯，而脫水和滲透脅迫對(duì)其誘導(dǎo)作用明顯[21]。桃樹中的HD-Zip II亞家族基因PpHB.G7在成熟果實(shí)中表達(dá)量高[22]。

在生長(zhǎng)素IAA處理長(zhǎng)白落葉松幼苗后，LoHDZ1的表達(dá)量在4 h內(nèi)明顯上調(diào)表達(dá)，而LoHDZ3基因的表達(dá)量只是略有增加，說明其對(duì)生長(zhǎng)類激素處理響應(yīng)程度不同，LoHDZ1更容易被IAA調(diào)控表達(dá)。GA3處理后2條基因與對(duì)照相比表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，因?yàn)槌嗝顾刂饕δ苁谴龠M(jìn)植物生長(zhǎng)，也能促進(jìn)或控制內(nèi)源生長(zhǎng)素的合成與降解，避免生長(zhǎng)素濃度過高及抑制時(shí)間過長(zhǎng)致使植株生長(zhǎng)減緩、停止甚至死亡。而ABA處理后LoHDZ1表達(dá)量較對(duì)照相比明顯下調(diào)，LoHDZ3在24和72 h時(shí)表達(dá)量升高，其余時(shí)期的表達(dá)量也均低于未處理時(shí)期。ABA對(duì)生長(zhǎng)的作用與IAA、GA等相反，同時(shí)在植物對(duì)脅迫環(huán)境抗逆性中發(fā)揮重要作用。由此推斷LoHDZ1受到ABA的抑制，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，不參與調(diào)控非生物脅迫過程，擬南芥第II亞類HD-Zip蛋白基因中有9個(gè)成員: ATHB2/HAT4,ATHB4,HAT1，HAT2,HAT3,HAT9,HAT14,HAT17和HAT22[23]。Steindler et al.[24]發(fā)現(xiàn)ATHB2的表達(dá)水平會(huì)影響生長(zhǎng)素的信號(hào)途徑，表明其可能參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程；過量表達(dá)擬南芥HAHB10后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉子的形狀、顏色,以及植株生長(zhǎng)率、開花時(shí)間和生命周期都受到了影響,而用GA處理轉(zhuǎn)基因植株之后,植株形狀指標(biāo)又會(huì)恢復(fù)原狀[25],表明HAHB10參與擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過程。而LoHDZ3在用赤霉素處理后相對(duì)于對(duì)照組呈現(xiàn)明顯的差異性表達(dá)，推測(cè)其功能可能與大多數(shù)HD-Zip II亞家族基因一致，參與調(diào)控植物對(duì)脅迫的應(yīng)答并調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育部分過程。