響應(yīng)面法優(yōu)化苦菜蛋白質(zhì)提取工藝

賀瑩

呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033000）

苦菜（Sonchus oleraceusL.）系菊科苦苣菜屬，一年生或二年生草本植物，莖直立或斜生，折斷有白色乳汁，基生葉羽狀深裂，全形長橢圓形或倒披針形，葉片邊緣呈鋸齒狀；瘦果褐色，為長圓形，助間有橫皺紋[1]?？嗖酥饕?6種氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸，占氨基酸總量的43%，從苦菜中提取分離出的蛋白質(zhì)，無動(dòng)物蛋白所含的膽固醇，營養(yǎng)價(jià)值高，易于被人體吸收，具有十分廣闊的市場(chǎng)潛力和前景[2-3]。

目前苦菜產(chǎn)品的開發(fā)正處于起步階段，苦菜乳酸飲料[4]、苦菜復(fù)合果蔬汁、苦菜凍干粉等苦菜產(chǎn)品的推出深受消費(fèi)者的喜愛。但苦菜在其蛋白質(zhì)資源、產(chǎn)品加工等方面研究的深度不夠，這就極大限制了對(duì)苦菜的深度應(yīng)用開發(fā)。我們需要加深對(duì)苦菜蛋白質(zhì)的研究，為苦菜進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)和理論支持，因此課題的研究成果有一定實(shí)用價(jià)值[5-6]。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

苦菜：采于山西呂梁田間；考馬斯亮藍(lán)G250，牛血清蛋白（BSA）；氫氧化鈉、酚酞以及氯化鈉分析純，天津鳳船化學(xué)試劑科技有限公司。

L550型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器制造有限公司；LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋、HPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-2A），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSA224S電子天平、PHS-3E pH計(jì)，上海精密化學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)研究方案

1.2.1 蛋白含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[7]測(cè)定：采用UV-3100PC型紫外可見分光光度計(jì)，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以吸光度為縱坐標(biāo)率，各標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，并建立回歸方程為

式中：Y為吸光度；X為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，μ g/mL。

1.2.2 原料處理

將采摘的新鮮苦菜清洗干凈并稱質(zhì)量，然后將其置于80 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干5 h，將風(fēng)干的苦菜用高速粉碎機(jī)粉碎，過孔徑0.180 mm篩，置于一次性干燥密封袋備用[8-9]。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.3 苦菜蛋白質(zhì)的提取工藝

提取工藝流程：原料采摘清洗→風(fēng)干→粉碎→鹽溶→調(diào)pH→加熱浸提→過濾→離心分離→上清液（蛋白質(zhì)提取液）→測(cè)定。

操作要點(diǎn)：準(zhǔn)確稱取1 g苦菜樣品置于燒杯中，加入0.2 mol/L的氯化鈉溶液，用1 mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH，然后將其置于恒溫水浴鍋中攪拌提取[10]，一段時(shí)間后將其取出進(jìn)行過濾，然后將濾液于6 000 r/min下離心15 min，3次，合并上清液，進(jìn)而采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中苦菜蛋白質(zhì)的含量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以苦菜中蛋白提取量為指標(biāo)，研究pH、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.1 pH對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2.0 h條件下，研究不同pH 2.6，2.8，3.0，3.2和3.4對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.4.2 料液比對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在pH 3.0，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2.0 h條件下，研究不同料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.4.3 提取溫度對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間2.0 h條件下，研究不同提取溫度55，60，65，70和75 ℃對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃條件下，研究不同提取時(shí)間1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取pH（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）4個(gè)因素，以苦菜蛋白質(zhì)提取量（Y）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)[11-12]，探索苦菜蛋白質(zhì)提取的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素、水平見表1。

1.2.6 計(jì)算公式

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0繪圖軟件繪制單因素對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響趨勢(shì)圖，采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，試驗(yàn)安排見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖2可知，在料液比1∶20 g/mL，提取溫度60℃，提取時(shí)間2.0 h條件下，隨著pH的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量也隨之發(fā)生變化，pH為3.0時(shí)苦菜蛋白提取量開始增加，pH為3.2時(shí)苦菜蛋白質(zhì)提取量達(dá)到峰值；隨著pH的逐漸升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此，試驗(yàn)選取pH 3.2為苦菜蛋白質(zhì)提取的最適pH。

圖2 pH對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

2.1.2 料液比對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖3可知，在提取溫度60 ℃，pH 3.0，提取時(shí)間2.0 h，不同料液比條件下，苦菜蛋白質(zhì)提取量整體呈先增加后減少的趨勢(shì)，在料液比為1∶25 g/mL時(shí)苦菜蛋白質(zhì)提取量最高，其他比例蛋白提取量相對(duì)較低。綜合考慮，試驗(yàn)選取1∶25 g/mL為苦菜蛋白質(zhì)提取的最適料液比。

2.1.3 提取溫度對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖4可知，在料液比1∶20 g/mL，pH 3.0，提取時(shí)間2.0 h，不同提取溫度條件下，苦菜蛋白質(zhì)提取量隨提取溫度的升高而增加，這是由于苦菜蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增大。當(dāng)提取溫度為65 ℃時(shí)，苦菜蛋白質(zhì)提取量為3.42 mg/g。提取溫度達(dá)到65 ℃后，苦菜蛋白質(zhì)的提取量隨著提取溫度的升高而繼續(xù)增加，但增加的幅度明顯減慢，因此，提取溫度選擇65℃比較合適。

圖3 料液比對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

圖4 提取溫度對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

由圖5可知，在pH 3.0，料液比1∶20 g/mL，提取溫度60 ℃的條件下，隨著提取時(shí)間的增長，苦菜蛋白質(zhì)的提取量越大，當(dāng)提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，提取效果最好。當(dāng)提取時(shí)間超過2.0 h時(shí)，苦菜蛋白質(zhì)提取量開始下降，說明提取時(shí)間過長會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而使得苦菜蛋白質(zhì)的提取量下降。因此，試驗(yàn)選取2.0 h為苦菜蛋白質(zhì)提取的最適提取時(shí)間。

圖5 提取時(shí)間對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取pH、料液比、提取溫度及提取時(shí)間為考察因素，根據(jù)響應(yīng)面分析法中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，苦菜蛋白質(zhì)提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立

利用Design-Expert 7.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到苦菜蛋白質(zhì)提取量與pH（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）的二次回歸模型為

式中：各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值的大小表示各影響因素對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響大小，系數(shù)的正負(fù)表示該因素影響的方向，各因素對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響由大到小依次為B＞C＞D＞A。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析（表3），可以看出模型p=0.000 6＜0.01，表明該模型具有極顯著性，說明條件不同，苦菜蛋白質(zhì)的提取量有顯著差異；失擬項(xiàng)p=0.134 1＞0.05，說明在試驗(yàn)所選各因素水平范圍內(nèi)，擬合程度好，此模型可用于對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從表3可以看出，在試驗(yàn)所選各因素水平范圍內(nèi)，B影響極顯著（p＜0.01），C影響顯著，A、D影響不顯著，二次項(xiàng)A2，B2，C2和D2對(duì)模型影響極顯著。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

由圖6可知，隨著提取pH的升高、料液比的增大，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢(shì)。由圖7可知，隨著pH的遞增、提取溫度的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高然后降低的趨勢(shì)。由圖8可知，隨著提取時(shí)間的增長，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高然后降低的趨勢(shì)；隨著pH的遞增，苦菜蛋白質(zhì)提取量也呈現(xiàn)逐漸升高后下降趨勢(shì)。由圖9可知，隨著提取溫度的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量呈現(xiàn)逐漸升高然后降低的趨勢(shì)；隨著料液比的遞增，苦菜蛋白質(zhì)提取量也呈現(xiàn)逐漸升高后下降趨勢(shì)。由圖10可知，隨著提取時(shí)間的增長，提取率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢(shì)；隨著料液比的遞增，苦菜蛋白質(zhì)提取量同樣呈現(xiàn)先升高后趨于平緩。由圖11可知，隨著提取時(shí)間的增長，提取率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢(shì)；隨著提取溫度的升高，苦菜蛋白質(zhì)提取量同樣呈現(xiàn)先升高后趨于平緩。由此可知，各因素之間交互作用的影響與單因素影響不一致，各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值影響不顯著。

圖6 pH與料液比交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖7 pH與提取溫度交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖8 pH與提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖9 料液比與提取溫度交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖10 料液比與提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面與等高線

圖11 提取溫度與提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面與等高線

2.2.4 最佳提取條件驗(yàn)證

由Design-Expert 7.0軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，分析可得苦菜蛋白質(zhì)提取量的最佳試驗(yàn)條件是pH為3.23，料液比1∶26.15 g/mL，提取溫度65.4 ℃，提取時(shí)間2.51 h，在此條件下的理論提取量為3.5 mg/g。根據(jù)上述優(yōu)化提取條件的試驗(yàn)結(jié)果，為了操作方便，將苦菜蛋白質(zhì)的提取工藝條件調(diào)整為pH 3.2，料液比1∶26 g/mL，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間2.5 h，經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，得到最佳條件下苦菜蛋白質(zhì)提取量為3.54 mg/g，與理論苦菜蛋白質(zhì)提取量無顯著性差異，由此說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程模型及最佳條件可靠。

3 結(jié)論

以苦菜為原料，采用鹽溶、酸熱綜合方法提取苦菜蛋白質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到各因素對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響趨勢(shì)圖，在此基礎(chǔ)上通過四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，全面且直觀地分析了各因素對(duì)苦菜蛋白質(zhì)提取量的影響，以及各因素之間的交互作用，建立回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型合理可靠，表明影響苦菜蛋白質(zhì)提取量的主要因素是料液比與提取溫度?？嗖说鞍踪|(zhì)最佳提取工藝條件為pH 3.2，料液比1∶26 g/mL，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間2.5 h，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到苦菜蛋白質(zhì)的提取量為3.54 mg/g。試驗(yàn)得到的工藝參數(shù)可為生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。