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    動物源性食品中氨芐青霉素殘留檢測研究進展

    2021-04-17 14:26:36李席席李芳康懷彬
    食品工業(yè) 2021年2期
    關鍵詞:氨芐青霉素傳感

    李席席,李芳, ,康懷彬, *

    1. 河南科技大學食品與生物工程學院(洛陽 471023);2. 食品加工與安全國家級實驗教學示范中心(洛陽 471023)

    氨芐青霉素(AMP),又稱氨芐西林,是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素,通過抑制胞壁黏肽合成酶,加速破壞細菌的細胞壁,最終致使細菌膨脹裂解[1]。氨芐青霉素具有耐酸不耐酶、殺菌活性強、低毒性和廣譜廉價等優(yōu)點[2],經(jīng)常被用于治療動物呼吸道、尿道、腸胃系統(tǒng)、奶牛乳房炎等疾病,被廣泛應用于養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中[3],因此造成動物源性食品中氨芐青霉素殘留的問題[4]。長期食用含有氨芐青霉素殘留的動物源性食品(乳制品、肉類、水產(chǎn)品、蛋類、蜂蜜等)會增強機體內(nèi)細菌的耐藥性,加重對肝腎等功能的損害[5]。因此許多國家和組織都對動物源性食品中氨芐青霉素的添加量進行嚴格控制。歐盟藥典規(guī)定動物源性食品中AMP≤4 μ g/kg[6],美國規(guī)定牛奶中AMP≤10 μ g/kg[7],中華人民共和國農(nóng)業(yè)部在2002年修訂頒布的《動物性食品中獸藥高殘留限量》中規(guī)定動物性食品中AMP≤50 μ g/kg,并限制牛奶中AMP≤10 μ g/kg[8]。用于檢測氨芐青霉素殘留的方法有很多,常用方法主要有微生物法、儀器分析法、免疫分析法和生物傳感檢測[9]。

    1 微生物法(MIT)

    微生物檢測法主要是依據(jù)抗微生物藥物對特異性微生物的代謝過程有抑制作用和生理作用[10],從而對樣品中抗生素殘留進行定性或定量檢測[11],通過觀察培養(yǎng)基上抑菌圈的大小進行評估[12]。微生物法主要包括紙片(PD)法、氯化三苯基四氮唑(TTC)法和杯碟(CP)法等。

    1.1 紙片(PD)法

    嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片擴散法通常被用來監(jiān)測微生物生長是否被抑制,抗生素存在時,紙片周圍會出現(xiàn)一圈透明的抑菌圈,根據(jù)抑菌圈的大小推算待測樣品中抗生素濃度的大小。吳謙等[13]用微生物抑制法對動物源性食品中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留進行檢測。結(jié)果顯示:重復性和再現(xiàn)性標準差分別在3.094%~11.14%和3.141%~13.30%,重現(xiàn)性和再現(xiàn)性很好,可用于肉、魚、蝦和牛乳等動物源性食品中氨芐青霉素殘留的檢測。馬麗蘋等[14]采用濾紙片法對牛乳中青霉素類藥物殘留進行檢測,測得青霉素鈉最低檢測限為1 ng/mL。

    1.2 氯化三苯基四氮唑(TTC)法

    TTC法是GB/T 4789.27—2008所規(guī)定的其中一種方法,依據(jù)抗生素會抑制嗜熱鏈球菌正常生長所構(gòu)建的一種顯色法。若待測樣品中不存在抗生素或抗生素的濃度過低時,嗜熱鏈球菌快速生長,TTC被還原變成紅色;反之,嗜熱鏈球菌生長被抑制,TTC無法被還原,保持原始顏色,根據(jù)TTC的顏色變化達到對抗生素測定的目的[15]。Tajick等[16]用TTC法對牛奶樣品中的氨芐青霉素進行檢測,測得氨芐青霉素殘留的檢測限為0.004 μg/mL。黃怡君等[17]用TTC法對牛奶中青霉素殘留進行檢測,測得最低檢出量為3 μg/kg。

    1.3 杯碟(CP)法

    中國出口肉品中青霉素殘留檢測的主要方法是CP法(SN 0539—1996)。張可煜等[18]用藤黃八疊球菌為實驗菌種,用杯碟法來定量分析殘存在豬、牛及雞肉中的青霉素,測得檢測下限為0.025 IU/g。

    微生物檢測法是最傳統(tǒng)的抗生素殘留檢測方法之一。該方法檢測對象比較廣,適用于大多數(shù)動物源性食品中抗生素殘留的檢測。在檢測過程中不需要使用大型儀器,操作簡單、低成本、樣品回收率高,具有很好的重復性和再現(xiàn)性等優(yōu)點。但樣品測定時間久、特異性差、靈敏度低、易產(chǎn)生假陽性結(jié)果,最終導致誤差較大等缺點。此外,該方法只能對青霉素總量進行測定,不能檢測抗生素的具體組成和含量[19]。

    2 儀器分析法

    儀器分析法是依據(jù)檢測樣品中抗生素的特定基團或與某些基團所產(chǎn)生得一些特定反應達到對抗生素含量的測定。用于氨芐青霉素殘留檢測的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。

    2.1 高效液相色譜(HPLC)法

    HPLC用高壓下的液體作為流動相,將色譜柱上洗脫下來的有效成分使用不同檢測器進行測定。該方法準確性強、靈敏度高,能夠?qū)悠分邪逼S青霉素殘留進行痕量檢測[20]。馬燕紅等[21]通過HPLC對動物源食品中4種青霉素類藥物殘留進行檢測,結(jié)果顯示所測得的4種青霉素類藥物在0.01~2 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關系,R2>0.999,檢出限3 μg/kg,定量限10 μg/kg,回收率69.9%~100.3%,RSD 1.58%~9.15%,可進一步用于豬、牛、羊、雞、魚等不同樣品中青霉素類藥物殘留的檢測。該方法采用直接進樣,無需衍生化,樣品前處理步驟簡單、快速。但樣品經(jīng)液液提取和固相萃取柱凈化后,會導致某些穩(wěn)定性差的青霉素藥物回收率不理想,檢測結(jié)果易受基質(zhì)影響,此外該方法檢測成本較高,不易普及。

    2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法

    液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時具有液相色譜較高的分離能力和質(zhì)譜可靠的定性信息。該方法操作簡單、快速、高效,可對樣品進行定性定量分析[22]。Silvia[23]用HPLC-MS 對牛奶中氨芐青霉素殘留進行測定,測得最低檢測限為10 μg/kg。張炯愷[24]用HPLC-MS/MS測定乳制品中10大類90種獸藥殘留的檢測方法。對牛奶樣品進行處理后,用C18色譜柱洗脫分離、外標法定量分析。結(jié)果顯示青霉素類抗生素在1~20 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性相關性,R2>0.995,檢出限0.3 μ g/kg,定量限1 μ g/kg。加標回收率62.4%~134.8%,RSD 5%~10%。貢松松等[25]用超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜(UHPLC-QTOF MS)技術對生鮮牛乳中80種抗生素和激素進行快速檢測。樣品經(jīng)過處理后,用混合標準品進行定性定量分析,結(jié)果顯示生鮮牛乳中氨芐青霉在50~100 μg/L有良好線性范圍,其檢出限50 μg/L,定量限100 μg/L。對樣品進行加標回收率測定,加標回收率50.2%~119%,RSD0.3%~19.0%之間。王多嬌等[26]用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定牛奶中9種青霉素類抗生素殘留量的檢測方法。牛奶樣品處理后除去蛋白、脂肪,用HLB小柱凈化、富集。并用青霉素混合標準溶液進行定量定性分析,結(jié)果表明牛奶中氨芐青霉素濃度在0.1~100 μg/L范圍內(nèi)有很好線性關系,其中檢出限0.4 μg/kg,定量限1 μg/kg,對樣品高、中、低3個濃度進行回收率測定,回收率74.8%~84.9%,RSD 7.04%~10.5%。對比高效液相色譜法,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法能同時檢測多種抗生素,具有較寬檢測范圍和較低的檢測線,靈敏度比較高等優(yōu)點。但是該方法最大的缺點是儀器價格昂貴,不適合大范圍推廣使用。

    3 免疫分析(IAs)法

    IAs依據(jù)抗原或半抗原與相應抗體可特異性結(jié)合的性質(zhì),利用酶或其他有色、發(fā)光物質(zhì)對特定抗體(抗原)標記,使其作為選擇性試劑對相應待測抗原(抗體)進行定性或定量分析的一種方法。常用免疫分析方法包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、放射性免疫技術(RIA)、膠體金免疫層析(CGIA)法、熒光免疫檢測(FIA)方法等。

    3.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法

    ELISA將被測目標物標記的抗體與某種蛋白標記的抗原結(jié)合到某種固相載體的表面,一般選用96孔板作載體,并保留免疫活性,與含有辣根過氧化物酶標記的二抗結(jié)合,加入酶反應底物,酶催化底物反應發(fā)生顏色改變,可以根據(jù)顏色的深淺來進行定性或定量分析[27]。劉偉怡等[28]用動物試驗建立青霉素類抗生素廣譜性酶聯(lián)免疫分析方法,用于快速檢測牛奶中青霉素類抗生素殘留的檢測。測得8種青霉素類抗生素最低可檢測濃度2.22 μ g/mL,檢測限0.14 μ g/mL。對其進行特異性測試,結(jié)果比較穩(wěn)定,幾乎無交叉反應現(xiàn)象。對牛奶樣品進行檢測,加標回收率74.0%~

    106.3%,變異系數(shù)小于0.21%。李佳儀[29]利用基因工程技術制備了抗氨芐青霉素抗體,并建立間接競爭ELISA檢測方法。結(jié)果顯示氨芐青霉素濃度在0.01~1 000 ng/mL具有良好線性關系,R2=0.988 7,檢測線和靈敏度分別為0.83和18.43 ng/mL。板間變異系數(shù)精密度測定值在0.96%~26.82%。在特異性驗證方面,發(fā)現(xiàn)氨芐青霉素與卡那霉素、四環(huán)素和氯霉素幾乎不發(fā)生交叉反應,與阿莫西林交叉反應率為46.63%。對樣品進行測定時,發(fā)現(xiàn)在10~2 000 ng/mL范圍內(nèi)有較高的回收率?;厥章试?5.22%~96.89%之間,說明該方法可以用來檢測食品樣品中氨芐青霉素殘留。

    ELISA技術多采用單克隆抗體制備,有特異性好、專一性高、快速、簡便等優(yōu)點。但由于氨芐青霉素是小分子化合物,存在抗原合成程序復雜、抗體質(zhì)量不穩(wěn)定、方法特異性差等問題,并且該方法在操作過程中需要多次洗板,過程比較繁瑣,耗時較長。

    3.2 放射性免疫技術(RIA)

    RIA是以特異性免疫反應為基礎,應用放射性同位素對受體進行標記,以完成對靶標檢測的新型檢測技術。張佳[30]利用14C標記的青霉素G和β-酰胺類獸藥共同競爭微生物細胞上的特異性受體,樣品中含有β-酰胺類抗生素,就會減少微生物細胞上14C標記的青霉素G的含量,通過檢測14C標記的青霉素G的含量,來判斷樣品中抗生素殘留量。該方法分別對豬肉,牛肉、雞肉、魚肉、蝦肉,添加不同標準品分別為青霉素G,氨芐青霉素等6種青霉素類抗生素進行驗證,所有加標樣品測定結(jié)果均為陽性,篩選準確率100%。該方法具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點[31],但是放射性同位素對人體有一定的傷害,需要專業(yè)人員進行操作,且費用較高,不易普及。

    3.3 膠體金免疫層析(CGIA)法

    CGIA有空間分辨的優(yōu)勢,可達到同時檢測多種藥物的目的,能實現(xiàn)快速檢測(一般5~10 min),可通過視覺定性或儀器定量。袁曉春[32]建立一種快速定性檢測乳制品中抗生素殘留的多重膠體金免疫層析法。樣品在測量前不需要處理,可以直接進行檢測,整個過程檢測速度快,檢測時間在8 min以內(nèi)。測得牛奶中抗生素殘留量,均低于我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的MRL值,其中氨芐青霉素最低檢測限4 μg/L。膠體金作為一種性質(zhì)優(yōu)良、合成簡便的納米材料,成本低廉,操作簡單,同時結(jié)合免疫層析空間分辨、快速簡便等優(yōu)點。傳統(tǒng)的膠體金免疫層析法主要通過視覺定性分析,檢測結(jié)果易受環(huán)境因素和檢測者等主觀因素影響,易出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。基于膠體金光學讀取儀的膠體金免疫層析快速定量檢測法通過儀器定量分析,可以彌補傳統(tǒng)的膠體金免疫層析方法的缺點,結(jié)果更可靠,適合現(xiàn)場快速篩查[33]。

    3.4 熒光免疫檢測方法(FIA)

    FIA主要通過熒光素標記的抗體與抗原相結(jié)合,充分洗滌分離后,用熒光檢測儀觀察抗原抗體復合物的熒光強度,進而對樣品中痕量物質(zhì)進行定量測定。FIA專一性強、高靈敏度等優(yōu)點,可用于測量含量較低的生物活性化合物,并將其列為獸藥殘留監(jiān)控的重點。Benito-Pena等[34]用FIA對β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留進行檢測。測得氨芐青霉素的回收率在99%~105%之間,其檢測限為5 μ g/L。尹致丹[35]采用直接競爭型FIA檢測牛奶中氨芐青霉素。其原理:將抗原包被在96孔板上,加入一定量的抗體和氨芐青霉素標準品(待測樣品)進行競爭反應,待反應結(jié)束后,充分洗滌96孔板。在96孔板上加入過量QDs-二抗偶聯(lián)物孵育,通過測定熒光強度進行定量分析。該方法對牛奶樣品進行加標回收率測定,測得回收率94.0%~106.2%,變異系數(shù)2.1%~9.2%,檢測限2.5 μg/L。其檢測結(jié)果與ELISA和HPLC兩種方法進行對比,結(jié)果幾乎一致。但是該方法受基質(zhì)影響比較大,并且二抗制備比較復雜。

    4 生物傳感檢測

    生物傳感檢測是通過檢測目標物對傳感器識別元件(生化受體)的影響,并將其轉(zhuǎn)化成電信號,以此實現(xiàn)定量或者半定量的特異性檢測。生物受體的主要類型有抗體、酶、全細胞及適配體等。生物傳感檢測有較高的靈敏度、分析速度比較快、易操作、易微型化、制作成本低等優(yōu)點[36]。常用于檢測氨芐青霉素殘留的生物傳感檢測法主要有電化學生物傳感檢測、光學生物傳感檢測和光電生物傳感檢測。

    4.1 電化學生物傳感檢測

    電化學生物傳感檢測通常將識別元件(抗體、適配體、酶等)修飾在電極表面,通過測定電流、電勢或阻抗的變化達到對抗生素測定的目的。Mohammad-Razdari等[37]用還原型氧化石墨烯和金納米顆粒構(gòu)建青霉素G超靈敏檢測的阻抗式適配體傳感器,檢測極限低至0.8 fM,采用該方法對牛奶、綿羊奶、山羊奶和水牛奶的加標樣品中的青霉素G進行測定,回收率92%~104%。Sahihazar等[38]構(gòu)建基于多壁碳納米管的阻抗式生物傳感器,可用檢測阿莫西林、青霉素G和氨芐青霉素殘留。該方法與傳統(tǒng)傳感器相比,具有較高靈敏度、低成本的優(yōu)點。朱俊亞等[39]用碳二亞胺交聯(lián)法制備適配體生物傳感器法用于牛奶中氨芐青霉素殘留的檢測。測得氨芐青霉素檢測限為1.0×10-12mol/L。對牛奶樣品進行加標回收率,測得加標回收率95.24%~101.30%,RSD<4.38%(n=5)。Liu等[40]用多層Co-MOF@TPN-COF新型納米材料構(gòu)建電化學適配傳感器檢測氨芐青霉素殘留,測得氨芐青霉素超低檢測限為2.0 ng/mL,可用于檢測人體血清、河水和牛奶中氨芐青霉素殘留,具有良好的再現(xiàn)性、穩(wěn)定性和適用性。Taghdisi等[41]用DNA結(jié)構(gòu)和無標記適體構(gòu)建檢測氨芐青霉素殘留的電化學適體傳感器。其檢測限低至1 pmol/L,用于牛奶樣品中氨芐青霉素殘留的痕量檢測。Wang等[42]利用核酸內(nèi)切酶對雙鏈DNA特異性的剪切作用,當樣品中沒有抗生素存在時,適配體可以與修飾在金電極表面的互補鏈雜交形成雙鏈DNA,隨后核酸內(nèi)切酶將dsDNA剪切成DNA碎片殘留在溶液中,電子和電極表面?zhèn)鲗Р粫芊菍щ娊橘|(zhì)DNA的影響,獲得的電化學信號增強;反之,當樣品中存在抗生素時,適配體與抗生素結(jié)合,無法與修飾在金電極表面的互補鏈配對形成dsDNA,因此核酸內(nèi)切酶無法剪切修飾在金電極表面的ssDNA層,電子和電極表面?zhèn)鲗茏?,導致電化學信號減弱。通過電信號強弱的改變,用來檢測抗生素殘留。該方法測得氨芐青霉素檢測限為32 pmol/L,低于歐盟規(guī)定的最大殘留限量(9.93 nmol/L),可用于檢測牛奶和水樣品中氨芐青霉素殘留檢測。

    4.2 光學生物傳感檢測

    光學生物傳感檢測主要由感應元件(抗體、酶、適配體等生物材料)和光信號檢測對象組成。Adrian等[43]利用檢測波長的光學生物傳感器測定牛乳磺酰胺、氟喹諾酮、β-內(nèi)酰胺和四環(huán)素等超過30種抗生素。呂晶等[44]用核酸適配體熒光法檢測氨芐青霉素。樣品中沒有氨芐青霉素時,適配體可以吸附在納米金表面形成保護層,維護納米金在鹽溶液中的分散狀態(tài);樣品中存在氨芐青霉素時,適配體與氨芐青霉素穩(wěn)定結(jié)合,無法起到保護作用,納米金在鹽溶液中集聚。分散狀態(tài)的納米金可以淬滅羅丹明B的熒光,而集聚后的納米金對羅丹明B的熒光沒有影響。通過反應體系熒光信號的強弱實現(xiàn)氨芐青霉素的定量檢測。該方法測得氨芐青霉素檢測限為0.494 nmol/L,與國際相關檢測標準相比較低。并對樣品進行加標回收率測定,加標率92%~108.07%,RSD 1.19%~3.79%。

    4.3 光電生物傳感檢測

    光電生物傳感器是由光信號檢測器、生物感應元件和電化學檢測器共同組成的一種新型檢測方法。Gao等[45]將氨芐青霉素適體作為識別元件固定在CdS/Eu-MOF修飾電極上,構(gòu)建對氨芐青霉素特定光電流響應的自供電光電適體傳感器。對湖水和牛奶樣品中氨芐青霉素殘留進行檢測,其檢測線9.3×10-11mol/L。Ge等[46]用BiFeO3/utg-C3N4的優(yōu)異光電性能,制備一種開-關光電適體傳感器,用于檢測氨芐青霉素殘留,檢出限3.3×10-13mol/L,具有很高選擇性和靈敏度。

    5 結(jié)語

    微生物分析法、儀器分析法和免疫分析法均屬于傳統(tǒng)檢測方法,每種檢測方法各有優(yōu)缺點。而生物傳感檢測是近幾年應用比較多的檢測方法,其識別元件和信號元件比較廣。選用適配體作為識別元件,主要原因是由于適配體可以通過體外篩選、PCR擴增等技術進行批量生產(chǎn),有高的親和性、特異性強及批次間差異較小等優(yōu)點[47-48],能夠彌補傳統(tǒng)檢測方法中的不足。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)將適配體和納米材料相結(jié)合應用在生物傳感方面,不僅能提高傳感器的靈敏度,還具有檢測快速、高效的優(yōu)點,為開發(fā)新型抗生素檢測方法提供依據(jù)。

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