石斛酚抑制高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡及炎癥反應機制

劉意 金湘東 賈寶輝 馬宇 許麗敏

(1鄭州鐵路職業(yè)技術學院醫(yī)學技術與工程學院，河南 鄭州 450052；2鄭州大學第五附屬醫(yī)院眼科；3鄭州大學第一附屬醫(yī)院眼科)

糖尿病(DM)是一種高糖引起的血管慢性病變代謝病，其臨床癥狀以并發(fā)癥為主，包括糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病〔1,2〕。糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是世界失明人群的主要原因〔3,4〕，因此針對其高效低毒藥物的研發(fā)具有重要意義。石斛(Dendrobii Herba)是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有悠久的抗DM臨床應用歷史〔5〕，但關于石斛酚抗DM活性知之甚少。石斛或石斛酚具有抗細胞毒、抗轉移的保護作用〔6〕，但其在DM引起的視功能障礙中的作用及機制尚未有報道。AKT的一般途徑稱為磷酸肌醇-3-激酶-蛋白激酶(PI3K-PK)B/Akt途徑或PI3K/AKT/mTOR途徑，以其涉及的上游和下游蛋白命名〔7〕。本研究通過建立高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內皮細胞模型，觀察石斛酚治療對其凋亡、氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1材料 視網(wǎng)膜血管內皮細胞HREC購自ATCC；EGM2-MV內皮細胞培養(yǎng)基購自瑞士Lonza公司；石斛酚(批號：809AKR1B101)購自Prospec Tany Technogene Itd；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒均購自大連碧云天；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒購自北京索萊寶公司。胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒、ECL發(fā)光液、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組 對照組：視網(wǎng)膜血管內皮細胞HREC用含有10%胎牛血清的EGM2-MV內皮細胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。模型組：參考陳泰弘等〔8〕的方法，建立視網(wǎng)膜血管內皮細胞損傷模型。低劑量組：將模型組細胞進行50 μg/ml石斛酚處理48 h；中劑量組：將模型組細胞進行60 μg/ml石斛酚處理48 h；高劑量組：將模型組組細胞進行70 μg/ml石斛酚處理48 h。

1.3MTT法檢測細胞活力 將1.2各組細胞制成混懸液，調整密度至104個/ml，然后接種至96孔板，取適量1.2各組細胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液上清，然后每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩使結晶充分融解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞活性與細胞OD值呈正比。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 用 500 μl 的結合緩沖液懸浮細胞，分別加入5 μl Annexin V-/FITC避光反應20 min后再加入5 μl PI避光反應20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內上流式細胞儀結束檢測。細胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.5Western印跡檢測細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、酶切caspase-3、PI3K、p-AKT、T-AKT的蛋白表達 取適量對數(shù)生長期1.2各組細胞，RIPA裂解后用BCA進行定量，變性離心后取上清進行蛋白上樣。按照Western印跡實驗常規(guī)操作流程進行電泳-轉膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。Image J分析目的條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量 按照SOD試劑盒、GSH-PX測定試劑盒、MDA檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒要求分別檢測細胞上清液中ROS、MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞活力的影響 與對照組〔(100.00±0.27)%〕相比，模型組細胞活性〔(42.18±8.64)%〕顯著降低；與模型組相比，低、中、高劑量組細胞活性〔(65.60±6.73)%、(79.58±8.04)%、(59.69±9.17)%〕顯著升高，與低劑量組相比，中劑量組細胞活性顯著升高，與高劑量組相比，中劑量組細胞活性顯著升高(均P<0.05)。

2.2石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡的影響 與對照組相比，模型組細胞早期凋亡率和總體凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組均顯著降低，與高劑量組組相比，中劑量組均顯著降低(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 檢測視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡

表1 石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡的影響

2.3石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡蛋白的影響 與對照組相比，模型組細胞中酶切caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組顯著降低，與高劑量組相比，中劑量組顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

1～5：對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，下圖同圖2 caspase-3和酶切caspase-3蛋白表達

表2 石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡蛋白的影響

2.4石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞氧化應激的影響 與對照組相比，模型組細胞中ROS、MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組細胞中ROS、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組細胞中ROS、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高，與高劑量組相比，中劑量組細胞中ROS、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞氧化應激的影響

2.5石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞AKT信號通路的影響 與對照組相比，模型組細胞中PI3K、p-AKT蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，與模型組相比，低、中、高劑量組細胞中PI3K、p-AKT蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組細胞中PI3K、p-AKT蛋白表達顯著升高，與中劑量組相比，高劑量組顯著降低(P<0.05)，各組T-AKT蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3，表4。

圖3 檢測視網(wǎng)膜血管內皮細胞AKT信號通路蛋白

表4 石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞AKT信號通路的影響

3 討 論

細胞凋亡是維持體內細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基礎，其通過清除衰老和病變的細胞保證機體健康〔9,10〕。李雅嘉等〔11〕、徐萬里等〔12〕研究報道，石斛酚對高糖誘導下的視網(wǎng)膜細胞、人臍靜脈內皮細胞均具有明顯的抗凋亡功效。研究首先構建了高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞，通過石斛酚治療后發(fā)現(xiàn)，石斛酚可抑制高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞的凋亡及酶切caspase-3的蛋白表達，說明石斛酚對高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞確實存在抗凋亡作用，為石斛酚的功能機制研究提供參考依據(jù)。Yoo等〔13〕研究報道，石斛蘭中四種酚類化合物分別為4-羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸，且這四種酚類化合物對脂多糖誘導的小鼠單核巨噬細胞白血病細胞中TNF-α的產(chǎn)生具有明顯的抑制作用，揭示石斛酚的抗炎活性。Li等〔14〕建立了DM小鼠模型，石斛酚可有效降低小鼠血糖、體重、低密度脂蛋白和膽固醇的水平并增加小鼠胰島素水平，改善小鼠脂肪肝和糖尿病腎病，深入研究顯示，石斛酚可降低MDA含量，增加內容物的抗氧化能力，另外還有降低IL-6和TNF-α表達的抗炎作用，首次揭示了石斛酚改善小鼠DM及其并發(fā)癥的功能，其機制可能與石斛酚的抗炎、抗氧化應激有關。本研究結果表明，石斛酚可抑制高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞中促炎因子的分泌，促進抗炎因子的分泌，發(fā)揮明顯的抗炎作用，與Li等〔14〕研究結果一致，揭示了石斛酚在高糖誘導視網(wǎng)膜血管內皮細胞中的抗炎作用及石斛酚在DM并發(fā)癥中的潛在治療價值。

AKT家族激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于AGC激酶的一般類別(蛋白質的AMP/GMP激酶和PKC亞家族)，其在人類中具有518個成員，且哺乳動物Akt的結構和功能高度保守〔15～19〕。 陳泰弘等〔7〕報道，在高糖低氧誘導的視網(wǎng)膜微血管內皮細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路得到明顯抑制，經(jīng)過銀杏內酯B治療后該通路被異常激活，細胞的凋亡和炎性損傷能力被抑制。本研究結果說明AKT信號通路被明顯抑制，與陳泰弘等〔7〕研究結果相一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)石斛酚治療的高糖誘導的視網(wǎng)膜微血管內皮細胞中PI3K、p-AKT的表達明顯升高，AKT信號通路再次得到激活，甚至活性恢復到正常細胞水平，說明石斛酚治療功能的作用機制與激活AKT信號通路密切相關。