LncRNA NNT-AS1通過靶向miR-496調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的分子機(jī)制

張欣萍 史天云 徐方方 徐全曉

(南陽市第一人民醫(yī)院 1婦科，河南 南陽 473000；2腫瘤分子生物學(xué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

卵巢癌是一種危害女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，由于女性生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌的復(fù)雜性導(dǎo)致卵巢癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率增加〔1〕。因而探討卵巢癌發(fā)生及發(fā)展規(guī)律對改善患者預(yù)后具有重要意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，研究顯示LncRNA表達(dá)變化與腫瘤發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切〔2〕。卵巢癌組織中LncRNA異常表達(dá)可促進(jìn)癌癥發(fā)生及發(fā)展〔3〕。長鏈非編碼RNA 煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶-反義RNA1(LncRNA NNT-A S1)是一種新型LncRNA，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA NNT-AS1在結(jié)腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，下調(diào)LncRNA NNT-AS1表達(dá)后可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔4〕。但LncRNA NNT-AS1在卵巢癌中的表達(dá)研究尚未見報(bào)道。LncRNA與微小核糖核酸(miRNA)可相互作用，并可通過調(diào)控一個(gè)或多個(gè)miRNA表達(dá)并參與蛋白質(zhì)編碼過程進(jìn)而形成住轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)〔5〕。通過生物學(xué)信息預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)LncRNA NNT-AS1可靶向調(diào)節(jié)微小核糖核酸(miR)-496，miR-496在骨肉瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-496表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及遷移〔6〕。目前國內(nèi)外對LncRNA NNT-AS1與miR-496在卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程中的生物學(xué)功能尚未闡明，因此本研究通過體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞探討LncRNA NNT-AS1與miR-496在卵巢癌下細(xì)胞增殖、遷移及侵襲中的作用及其可能機(jī)制，為靶向治療卵巢癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3與正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE-80均購自中科院上海生科院細(xì)胞庫。miR-496 mimic、miR-496抑制物及其各自陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen公司；LncRNA NNT-AS1 siRNA及其陰性對照均購自美國Dharmacon公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司；Matrigel購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自日本TaKaRa公司；MTT檢測試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海齊一生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自美國Sigma公司；熒光素酶活性檢測試劑盒及熒光素酶報(bào)告在載體均購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 采用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV3、IOSE-80細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，2 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)采用胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期卵巢癌SKOV3細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)30%左右時(shí)按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制LncRNA NNT-AS1表達(dá)即分別將LncRNA NNT-AS1 siRNA及其陰性對照轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，分別為si-NNT-AS1組、si-NC組。構(gòu)建LncRNA NNT-AS1過表達(dá)載體即分別將pcDNA與 pcDNA-NNT-AS1轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，分別為pcDNA組、pcDNA-NNT-AS1組。將miR-496 mimic及其陰性對照轉(zhuǎn)染至 SKOV3細(xì)胞，分別為miR-496組、miR-NC組。將anti-miR-496及其陰性對照分別與si-NNT-AS1共轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，分別為si-NNT-AS1+anti-miR-NC組、si-NNT-AS1+anti-miR-496組。各組均于轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)液。

1.2.2qRT-PCR檢測細(xì)胞LncRNA NNT-AS1、miR-496表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后收集對數(shù)生長期細(xì)胞，加入Trizol試劑提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，配置qRT-PCR反應(yīng)體系：2×STBR Green Taq PCR Mix 5 μl，cDNA樣本1.6 μl，基因正反向引物各0.2 μl，ddH2O 3 μl。置于PCR儀反應(yīng)，程序設(shè)置為95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，循環(huán)40次，72℃終延伸10 min。LncRNA NNT-AS1與miR-496均以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA NNT-AS1與miR-496相對表達(dá)量。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 取各組對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，利用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1.5×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞體積為20 μl，分別于接種24 h后加入MTT溶液(40 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO(200 μl/孔)，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，波長為490 nm時(shí)檢測各孔細(xì)胞光密度(OD)值，OD值大小表示細(xì)胞增殖能力強(qiáng)弱，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 分別取各組對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，采用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度(1.5×105/ml)，以200 μl/孔的密度加入Transwell上室，含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液加入Transwell下室(500 μl/孔)，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用甲醇固定Transwell上室，結(jié)晶紫染色后用棉簽試去未穿過底膜細(xì)胞，顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)處理：以1∶100稀釋Matrigel基質(zhì)膠與無FBS培養(yǎng)基，浸泡侵襲小室后再加入基質(zhì)膠(100 μl)，采用紫外線消毒殺菌過夜，同時(shí)在上下侵襲小室分別加入200 μl、600 μl無FBS培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%左右時(shí)收集各組細(xì)胞，重懸細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105/ml，Transwell下室加入含F(xiàn)BS培養(yǎng)基，上室加入重懸細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)40 h，采用乙醇固定小室，結(jié)晶紫染色，擦去未侵入基質(zhì)細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 分別將WT-NNT-AS1、MUT-NNT-AS1與miR-496 mimic共轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞中雙熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA NNT-AS1和miR-496在卵巢癌SKOV3細(xì)胞和卵巢上皮細(xì)胞IOSE-80中的表達(dá) 采用qRT-PCR檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞與卵巢上皮IOSE-80細(xì)胞中LncRNA NNT-AS1、miR-496表達(dá)水平，與IOSE-80細(xì)胞相比，SKOV3細(xì)胞中LncRNA NNT-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-496表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 NNT-AS1和miR-496在SKOV3細(xì)胞和IOSE-80細(xì)胞中的表達(dá)

2.2抑制LncRNA NNT-AS1表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響 si-NNT-AS1組SKOV3細(xì)胞中LncRNA NNT-AS1表達(dá)水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。MTT檢測結(jié)果顯示si-NNT-AS1組SKOV3細(xì)胞OD值明顯低于si-NC組(P<0.05)，見表2，表明LncRNA NNT-AS1沉默可抑制SKOV3細(xì)胞增殖。

表2 抑制 NNT-AS1表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響

2.3抑制LncRNA NNT-AS1表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲的影響 si-NNT-AS1組遷移細(xì)胞數(shù)目與侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著低于si-NC組(P<0.05)，見圖1，表3。表明抑制LncRNA NNT-AS1表達(dá)可抑制SKOV3細(xì)胞遷移及侵襲。

圖1 卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

表3 抑制NNT-AS1表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.4LncRNA NNT-AS1靶向調(diào)控miR-496的表達(dá) 利用生物信息網(wǎng)站預(yù)測LncRNA NNT-AS1可能與miR-496有相似結(jié)合位點(diǎn)序列，見圖2。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示LncRNA NNT-AS1可抑制miR-496熒光素酶活性，見表4。采用qRT-PCR分別檢測抑制LncRNA NNT-AS1表達(dá)及LncRNA NNT-AS1過表達(dá)轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞中miR-496表達(dá)變化，結(jié)果顯示si-NNT-AS1組miR-496表達(dá)水平(1.03±0.08)顯著高于si-NC組(0.39±0.04，P<0.05)，pcDNA-NNT-AS1組miR-496表達(dá)水平(0.17±0.03)顯著低于pcDNA組(0.42±0.04，P<0.05)。表明LncRNA NNT-AS1可負(fù)向調(diào)控miR-496表達(dá)。

圖2 NNT-AS1的3′UTR中含有與miR-1496互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5miR-496過表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 分別將miR-496 mimic及陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示miR-496組miR-496表達(dá)水平顯著高于miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞OD值、遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)及侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)均顯著降低(P<0.05)，見表5，表明miR-496過表達(dá)可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

表5 miR-496過表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.6抑制miR-496表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制NNT-AS1表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用 為了證明 LncRNA NNT-AS1是通過調(diào)控miR-496表達(dá)對SKOV3細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮作用，將si-NNT-AS1與anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，si-NNT-AS1與anti-miR-496共轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞，qRT-PCR檢測顯示si-NNT-AS1+anti-miR-496組SKOV3細(xì)胞中miR-496表達(dá)水平顯著低于si-NNT-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，si-NNT-AS1+anti-miR-496組細(xì)胞OD值、遷移細(xì)胞數(shù)目及侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著高于si-NNT-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，見表6。

表6 抑制miR-496表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制NNT-AS1表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

3 討 論

卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲是降低腫瘤治療效果及導(dǎo)致患者死亡的主要原因，腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲過程與多種生物分子及調(diào)控通路的相互調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)，目前研究卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲主要集中在神經(jīng)營養(yǎng)因子及黏附因子等方面〔7〕。近年來，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可參與細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)過程，LncRNA表達(dá)異?？纱龠M(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔8,9〕。LncRNA在卵巢癌中的作用成為研究熱點(diǎn)，既往研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19與LncRNA FOXD2-AS1在卵巢癌組織或細(xì)胞中均呈高表達(dá)并可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔10,11〕。關(guān)于LncRNA與miRNA在卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用研究較少，因此探討LncRNA與miRNA的相互作用有助于卵巢癌診斷及治療。

LncRNA NNT-AS1在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡〔12〕。Li等〔13〕研究表明骨肉瘤細(xì)胞中LncRNA NNT-AS1表達(dá)水平升高并可通過抑制miR-320a表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生及發(fā)展。本研究結(jié)果提示LncRNA NNT-AS1可能在卵巢癌的發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因作用。Wang等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)LncRNA NNT-AS1可通過抑制miR-363表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲。沉默LncRNA NNT-AS1表達(dá)可抑制乳腺癌增殖及遷移等生物學(xué)過程，Li等〔15,16〕研究發(fā)現(xiàn)LncRNA NNT-AS1可增強(qiáng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力并抑制細(xì)胞凋亡，敲低LncRNA NNT-AS1可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)下細(xì)胞周期阻滯。本研究結(jié)果說明LncRNA NNT-AS1可能主要通過增強(qiáng)SKOV3細(xì)胞增殖活性、遷移及侵襲能力進(jìn)而參與卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程。應(yīng)用starBase網(wǎng)站預(yù)測出LncRNA NNT-AS1可互補(bǔ)結(jié)合miR-496。LncRNA NNT-AS1可直接靶向調(diào)控miR-496表達(dá)。

miR-496在骨肉瘤組織及細(xì)胞中均呈低表達(dá)，miR-496過表達(dá)后可抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移及侵襲〔17〕。相關(guān)研究表明miR-496表達(dá)降低還可促進(jìn)乳腺癌發(fā)生及發(fā)展〔18〕。本研究結(jié)果提示miR-496可能在卵巢癌發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌基因作用。周靜怡等〔19〕研究表明結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-496表達(dá)水平降低，miR-496過表達(dá)可能通過抑制Wnt /β-catenin 通路進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及遷移。Li等〔20〕研究報(bào)道指出抑制Wnt /β-catenin通路可抑制卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲。說明miR-496可能通過抑制SKOV3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲進(jìn)而參與卵巢癌發(fā)生及發(fā)展。為驗(yàn)證LncRNA NNT-AS1靶向調(diào)控miR-496表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展，本研究共同抑制LncRNA NNT-AS1、miR-496表達(dá)觀察細(xì)胞活性、遷移及侵襲變化，結(jié)果說明抑制miR-496表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制NNT-AS1表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用。提示LncRNA NNT-AS1可通過降低miR-496表達(dá)繼而促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程。