硫酸右旋糖苷通過影響M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抑制人胃癌細(xì)胞侵襲與遷移的作用機(jī)制

尚靜，焦龍杏，李夢琪，郭嘉欣，楊旭，常瑞，徐遠(yuǎn)義，黃允寧*

1寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬自治區(qū)人民醫(yī)院/西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，銀川 750001；2寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004

胃癌患者多數(shù)死于腹腔種植轉(zhuǎn)移[1]。腹腔種植轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[2-3]。程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)是腫瘤常見分子標(biāo)志物，存在于癌細(xì)胞表面并與細(xì)胞毒T細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)程序性死亡受體1(programmed death receptor 1，PD-1)結(jié)合，從而使活性T細(xì)胞失活，逃避免疫識別[4]，與不良預(yù)后相關(guān)。研究M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(M2 tumor-associated macrophages，M2-TAMs)對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，對于尋找新的胃癌治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。硫酸右旋糖苷(dextran sulfate，DS)是一種大分子糖類，具有來源廣、腹腔作用時(shí)間長、毒副作用小的特點(diǎn)。研究表明，DS對人胃癌細(xì)胞具有直接抑制作用，表現(xiàn)在可抑制人胃癌細(xì)胞黏附、血管生成，并促進(jìn)其凋亡、侵襲遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多個(gè)方面[5]。 有報(bào)道稱PD-L1在癌細(xì)胞中的表達(dá)與TAMs的數(shù)量有關(guān)[6]。DS除了上述直接作用外是否可通過巨噬細(xì)胞間接抑制人胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討DS通過影響M2-TAMs抑制人胃癌細(xì)胞HGC-27侵襲和遷移的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胃未分化腺癌細(xì)胞株HGC-27由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)贈與，THP-1人單核細(xì)胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 藥品 DS購自美國Sigma-Aldich公司(貨號D8906)。

1.1.3 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自美國Sigma-Aldich公司；IL-4和IL-13購自美國Peprotech公司；兔單克隆抗體CD163、小鼠單克隆抗體PD-L1購自英國Abcam公司。

1.1.4 裸鼠 雄性BALB/c裸鼠24只，4～6周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXX(京)2006-009]。

1.1.5 人胃癌組織標(biāo)本 收集寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2018年2月－2019年10月經(jīng)手術(shù)切除、術(shù)后病理確診為胃腺癌的組織標(biāo)本46例，所有患者術(shù)前均未接受放化療。

1.2 方法

1.2.1 M2的誘導(dǎo)與驗(yàn)證 取對數(shù)生長期THP-1細(xì)胞接種于10 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)PMA誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后，加入IL-4、IL-13為M2組，加入IL-4、IL-13以及DS為DS組，干預(yù)36 h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，利用免疫熒光和Western blotting檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD163的表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥品處理 將THP-1、胃癌HGC-27細(xì)胞置于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，取對數(shù)生長期THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，種板，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。稱取適量DS溶解于PBS中，混勻后經(jīng)22 μm過濾器滅菌，使用前用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至終濃度為0.3%。

1.2.3 構(gòu)建裸鼠胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移模型 BALB/c 裸鼠24只，隨機(jī)分為對照組與DS組，每組12只。將人胃癌HGC-27細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×107個(gè)/ml (0.2 ml/只)，兩組均腹腔注射。24 h后對照組裸鼠腹腔注射生理鹽水(1 ml/只)，DS組裸鼠腹腔注射0.3%的DS(1 ml/只)，14 d后處死。

1.2.4 免疫組化染色 將裸鼠大網(wǎng)膜及瘤組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水、包埋、切片、抗原修復(fù)后依次加入一抗及二抗孵育并顯色。倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色顆粒顯像為PD-L1、CD163表達(dá)陽性。

1.2.5 免疫組織熒光雙染 人胃癌組織病理切片經(jīng)脫蠟水化、抗原修復(fù)、封閉處理后，孵育不同種屬來源的一抗4 ℃過夜，熒光二抗孵育后，加DAPI，封片。在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，采集圖像。PD-L1和CD163主要分布于胞膜和胞質(zhì)，PD-L1蛋白用紅色熒光標(biāo)記，CD163蛋白用綠色熒光標(biāo)記，DAPI發(fā)藍(lán)色熒光用來標(biāo)記細(xì)胞核。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件測定光密度(OD)值，各組均取5張圖的平均OD值，應(yīng)用Adobe Photoshop CS5軟件合并圖片。

1.2.6 免疫細(xì)胞熒光染色 誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞使其成為貼壁的巨噬細(xì)胞爬片。經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，0.2%TritonX-100通透20 min，10%山羊血清封閉30 min，一抗反應(yīng)4 ℃過夜，二抗反應(yīng)37 ℃ 1 h，滴加DAPI工作液，封片。CD163用FITC標(biāo)記，細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件，在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，獲得所選視野的平均光密度值。

1.2.7 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 裂解蛋白，EP管置冰上5 min后，振蕩30 s，重復(fù)5次，吸取上清。BCA法測蛋白濃度，100 ℃煮蛋白10 min。配膠、上樣，進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳，切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量各條帶的灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參，用各組目的蛋白與內(nèi)參蛋白表達(dá)灰度值的比值來表示相對蛋白量。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn) 共培養(yǎng)體系建立：將對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長90%～100%，用200 μl槍頭比著直尺畫橫線，PBS沖洗3次，拍照。取對數(shù)生長期M2，添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，將細(xì)胞分為4組：(1)對照組，僅培養(yǎng)HGC-27；(2)DS組，0.3%DS干預(yù)的HGC-27細(xì)胞；(3)M2組，將M2接種在Transwell小室上室內(nèi)，HGC-27細(xì)胞接種在下室；(4)DS+M2組，將M2接種在Transwell小室上室內(nèi)，0.3%DS干預(yù)的HGC-27細(xì)胞接種在下室；下室用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)3孔，培養(yǎng)24、48 h，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 稀釋基質(zhì)膠鋪于小室上室。待基質(zhì)膠凝固后，收集對數(shù)生長期HGC-2 7 細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/孔接種于小室上室。下室分別為：(1)對照組，10%FBS完全培養(yǎng)基；(2)DS組，加入0.3%DS的10%FBS完全培養(yǎng)基；(3)M2組，用10%FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的M2；(4)DS+M2組，加入0.3%DS的10%FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的M2。重復(fù)3孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，輕柔擦棄上室細(xì)胞與基質(zhì)膠，經(jīng)4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野拍照，計(jì)算各組中穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，若符合正態(tài)性和方差齊性，則兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。對于3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的重復(fù)測量數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測量資料的方差分析，因子間相關(guān)性分析采用Pearson法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1 經(jīng)誘導(dǎo)分化的THP-1細(xì)胞形態(tài)改變 經(jīng)PMA誘導(dǎo)48 h后，THP-1細(xì)胞由懸浮狀態(tài)變成貼壁狀態(tài)，具備M0形態(tài)；IL-4、IL-13繼續(xù)誘導(dǎo)M0 36 h后定向分化為M2，細(xì)胞伸出偽足，呈長梭形、多邊形，形態(tài)多樣，但在M0階段加入DS或在IL-4、IL-13干預(yù)同時(shí)加入DS 36 h后M2形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量相對減少(圖1)。

2.1.2 THP-1的誘導(dǎo)分化鑒定 結(jié)果顯示，M2特異性表型標(biāo)志物CD163表達(dá)處發(fā)綠色熒光，主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。與M0相比，M2特異性表型CD163表達(dá)升高，為M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功狀態(tài)(圖2)。

2.1.3 DS對M0誘導(dǎo)分化的影響 結(jié)果顯示，與M0組相比，DS組和M2組CD163表達(dá)增高(0.35±0.11 vs. 1.29±0.06，P＜0.01；0.35±0.11 vs. 1.56±0.11，P＜0.01)；與DS組相比，M2組CD163表達(dá)增高 (P＜0.05，圖3)。

2.1.4 各組人胃癌HGC-27細(xì)胞的侵襲能力 對照組的穿膜細(xì)胞數(shù)高于DS組(544.67±55.50 vs. 178.33±19.30，P<0.01)；M2組的穿膜細(xì)胞數(shù)高于對照組(912.00±41.07 vs. 544.67±55.50，P<0.01)；DS+M2組穿膜細(xì)胞數(shù)低于M2組(254.33±33.53 vs. 912.00±41.07，P<0.01)，DS組穿膜細(xì)胞數(shù)低于DS+M2組(178.33±19.30 vs. 254.33±33.53，P<0.05，圖4)。

圖1 THP-1細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of induced differentiation of THP-1 cells

圖2 細(xì)胞免疫熒光檢測CD163的表達(dá)(×40)Fig.2 CD163 expression detected by cellular immunofluorescence (×40)

圖3 Western blotting檢測各組CD163的表達(dá)情況Fig.3 CD163 expression in each group (Western blotting)

2.1.5 各組人胃癌HGC-27細(xì)胞的遷移能力 重復(fù)測量資料的方差分析結(jié)果顯示，多組間比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=738.72，P＜0.05)，表明組間遷移距離存在差異。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，24 h對照組遷移距離大于DS組[(183.04±2.50) μm vs. (94.78±4.69) μm，P＜0.01]；M2組遷移距離大于對照組[(194.74±6.43) μm vs. (183.04±2.50) μm，P＜0.05]；DS+M2組遷移距離小于M2組[(110.86±7.56) μm vs. (194.74±6.43) μm，P＜0.01]；DS+M2組遷移距離大于DS組[(110.86±7.56) μm vs. (94.78±4.69) μm，P ＜0.0 1]。在4 8 h 對照組遷移距離大于D S 組[(278.77±11.66) μm vs. (167.62±6.79) μm，P＜0.01]；M2組遷移距離大于對照組[(436.13±3.89) μm vs. (278.77±11.66) μm，P＜0.01]；DS+M2組遷移距離小于M 2 組[(3 1 1.2 8 5±2.7 7) μ m v s. (436.13±3.89) μm，P＜0.01]；DS+M2組遷移距離大于DS組[(311.285±2.77) μm vs. (167.62±6.79) μm， P＜0.01](圖5)。

圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組人胃癌HGC-27細(xì)胞的侵襲能力Fig.4 Detection of invasive ability of human gastric cancer HGC-27 cells in each group (Transwell invasion assay)

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組人胃癌HGC-27細(xì)胞遷移能力Fig.5 Detection of migration ability of human gastric cancer HGC-27 cells in 24 h and 48 h groups (wound healing test)

2.2 動物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 DS對胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響 胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移瘤顏色灰白，質(zhì)地硬。與對照組相比，DS組的胃癌細(xì)胞腹腔種植轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，體積明顯縮小(圖6)。

2.2.2 DS對大網(wǎng)膜瘤組織中CD163表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，CD163陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，呈棕黃色，DS組CD163陽性細(xì)胞OD值低于對照組(0.37±0.20 vs. 1.37±0.30，P<0.01，圖7)。

2.3 人胃癌組織

2.3.1 免疫組化檢測不同分化程度胃癌CD163的表達(dá) 低分化腺癌(PD)的CD163表達(dá)與高分化腺癌(WD)和癌旁組織(PT)相比均增高(P<0.05)；與癌旁組織(PT)相比，高分化腺癌(WD)的CD163表達(dá)無顯著增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖8)。

圖6 DS對胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響Fig.6 Effect of DS on intraperitoneal implantation of metastatic tumor of gastric cancer

2.3.2 免疫組織熒光染色檢測PD-L1與CD163的表達(dá)及相關(guān)性 結(jié)果顯示，PD-L1表達(dá)處發(fā)紅色熒光，主要分布于細(xì)胞膜，CD163表達(dá)處發(fā)綠色熒光，主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。與PD-L1(+)組比較，PD-L1(-)組熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.05)。將圖片合并后可見紅光位于腫瘤實(shí)質(zhì)、綠光位于腫瘤間質(zhì)，且CD163表達(dá)越強(qiáng)，PD-L1陽性表達(dá)越強(qiáng)，CD163與PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.40，P<0.05，圖9)。

3 討 論

癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是胃癌患者死亡的主要原 因[6]。術(shù)后化療可清除微轉(zhuǎn)移灶及殘余腫瘤，是治療胃癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的有效方法。大多數(shù)靜脈化療藥物不能到達(dá)腹腔，導(dǎo)致其功效降低，而直接注射入腹腔的藥物更容易達(dá)到有效濃度，DS正是這種具有腹腔注射應(yīng)用潛力的藥物之一。

圖7 免疫組化檢測DS對大網(wǎng)膜瘤組織中CD163表達(dá)的影響Fig.7 Effect of DS on CD163 expression in greater omentum tumor (immunohistochemistry)

圖8 免疫組化檢測不同分化程度胃癌CD163的表達(dá)(×20)Fig.8 Immunohistochemical detection of CD163 expression in different differentiated gastric cancer (×20)

圖9 免疫組織熒光染色檢測PD-L1與CD163的表達(dá)(×20)Fig.9 Expression of PD-L1 and CD163 detected by immunofluorescence staining

腫瘤的進(jìn)展伴隨著微環(huán)境的改變，如腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌的趨化因子、細(xì)胞因子和其他因子[8-9]，以及局部缺氧、炎癥和高水平乳酸的存在，可使血液中的單核細(xì)胞系列被招募到腫瘤微環(huán)境中成為TAMs[10]，發(fā)育成具有不同免疫防御和免疫監(jiān)視功能的兩大類，即經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M1)和交替激活的巨噬細(xì)胞(M2)，M1具有促炎和抗腫瘤、防止腫瘤免疫逃逸的作用，M2具有抗炎和促腫瘤、幫助腫瘤免疫逃逸的作用[11]。

本研究中，M2組CD163的表達(dá)高于DS組，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致，表明DS能夠抑制M0向M2方向的極化，其機(jī)制可能是DS作用于激活M2極化的細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TGF-β和單核細(xì)胞集落刺激因子[12]或者其他影響M2極化的信號通路。侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，DS對HGC-27細(xì)胞的侵襲、遷移有抑制作用，M2對HGC-27細(xì)胞的侵襲、遷移有促進(jìn)作用，DS可以抑制M2促HGC-27細(xì)胞的侵襲、遷移作用。因此，可以將DS干預(yù)M0并抑制其向M2分化的相關(guān)機(jī)制作為下一步研究的主要 內(nèi)容。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，裸鼠腹腔內(nèi)種植的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量及體積隨癌細(xì)胞注射時(shí)間的延長而明顯增多、增大。與對照組相比，DS可以抑制人胃癌細(xì)胞增殖及腹腔種植轉(zhuǎn)移。免疫組化結(jié)果顯示，DS可以抑制M2-TAMs特異性表型標(biāo)志物CD163的表達(dá)，表明DS可以減少M(fèi)2-TAMs的數(shù)量。因此，DS可能通過影響M2-TAMs這一間接作用抑制人胃癌細(xì)胞HGC-27 的增殖、侵襲和遷移。

癌細(xì)胞可以通過上調(diào)免疫檢查點(diǎn)蛋白如PD-L1來逃避免疫監(jiān)視，這種逃逸可以通過使用免疫檢查點(diǎn)阻斷劑(ICB)來抵消，如帕普利珠單抗和納武單抗，它們可以中斷PD-1與PD-L1之間的相互作用[13]。 免疫組化和免疫熒光檢測結(jié)果表明，M2-TAMs的浸潤程度可能與臨床病理特征有關(guān)，病理惡性程度越高，胃癌微環(huán)境中M2-TAMs細(xì)胞數(shù)量越多。PD-L1陽性的胃癌標(biāo)本中CD163陽性細(xì)胞密度明顯高于PD-L1陰性的胃癌標(biāo)本，證實(shí)了PD-L1陽性的人胃癌細(xì)胞周圍有明顯的M2浸潤，PD-L1表達(dá)與CD163陽性的巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)，提示M2-TAMs可能促進(jìn)了人胃癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。這些結(jié)果也提示M2-TAMs浸潤可作為PD-L1表達(dá)的預(yù)測標(biāo)志物，M2-TAMs可作為潛在的治療靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，在肝細(xì)胞癌、胰腺癌和胃癌中，腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)與TAM的數(shù)量有關(guān)[6,14]。Kasikara等[15]發(fā)現(xiàn)TAMs受體(Tyro3、Axl、Mertk)上調(diào)了乳腺癌細(xì)胞系中PD-L1的表達(dá)，支持了M2-TAMs可能激活腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的觀點(diǎn)。M2-TAMs激活腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究，本課題組目前正在對這一機(jī)制進(jìn)行評估。

綜上所述，DS可抑制M2促HGC-27細(xì)胞的侵襲和遷移作用，并下調(diào)CD163的表達(dá)，其作用機(jī)制可能是通過抑制M0向M2方向的極化，降低M2促腫瘤作用，從而影響腫瘤的生長。本研究為DS抑制裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制提供了理論支持，并為開發(fā)預(yù)防和治療胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的有效藥物提供了新的依據(jù)。