侵襲性念珠菌病耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

張伶玲 綜述，劉泉波 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地/兒童感染免疫重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

真菌感染，尤其是念珠菌感染正在以驚人的速度迅速上漲。據(jù)估計(jì)，全球有超過(guò)500萬(wàn)種真菌，約有300種真菌可引起人類疾病[1]。侵襲性念珠菌病(IC)是住院患者最多見(jiàn)的真菌感染疾病。最新的全球報(bào)告估計(jì)，每年有75萬(wàn)多例IC病例，導(dǎo)致超過(guò)5萬(wàn)例死亡[2]。近些年，念珠菌感染的流行病學(xué)不斷發(fā)生變化，非白色念珠菌感染逐漸增多，占許多地區(qū)IC的50%以上。我國(guó)一項(xiàng)對(duì)河北地區(qū)15家三級(jí)教學(xué)醫(yī)院的研究表明，IC中非白色念珠菌檢出比例已超過(guò)白色念珠菌，分別為58.21%和41.79%[3]，這與中國(guó)侵襲性真菌檢測(cè)網(wǎng)(CHIF-NET)2010—2014年多中心侵襲性酵母菌感染的臨床研究結(jié)果相似[4]。由于目前治療侵襲性真菌感染疾病的藥物種類少，耐多藥念珠菌越來(lái)越多地被報(bào)道，這嚴(yán)重影響著人類健康。因此了解念珠菌的耐藥現(xiàn)狀及真正理解藥物耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制對(duì)減少耐藥性的發(fā)生至關(guān)重要。

1 念珠菌的耐藥現(xiàn)狀

與治療細(xì)菌感染的抗生素類似，念珠菌屬對(duì)抗真菌藥物的耐藥性嚴(yán)重威脅著公眾健康。根據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)2019年《抗生素耐藥性威脅報(bào)告》，每年有超過(guò)34 000例病例，其中1 700例死于耐藥念珠菌。丹麥的一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果表明常見(jiàn)的念珠菌中，白色念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥率僅為0.4%，在近平滑念珠菌和熱帶念珠菌中接近6.0%，光滑念珠菌更是達(dá)到了9.1%[5]。而全球SENTRY監(jiān)測(cè)項(xiàng)目指出，熱帶念珠菌對(duì)氟康唑這單一藥物就達(dá)到了11.6%的耐藥率，與光滑念珠菌的11.9%接近[6]。棘白菌素類藥物的耐藥性也不可小覷，美國(guó)一家醫(yī)院的研究表明，10年時(shí)間光滑念珠菌對(duì)該藥物的耐藥率從4.9%上升至12.3%[7]，這遠(yuǎn)高于SENTRY報(bào)道的0～2.8%[6]。我國(guó)念珠菌耐藥問(wèn)題也越來(lái)越引人關(guān)注。CHIF-NET對(duì)國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院的調(diào)查研究指出，2010—2014年白色念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥率不足1.0%，而光滑念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別為19.0%和18.7%，熱帶念珠菌對(duì)2種藥物的耐藥率均達(dá)到了20.0%以上[8]?？梢?jiàn)，無(wú)論國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，念珠菌耐藥問(wèn)題都較為嚴(yán)重，尤其是非白色念珠菌。

2 對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制

2.1ERG11基因突變和過(guò)度表達(dá) 唑類藥物的靶酶14-α脫甲基酶(ERG11p)，是麥角甾醇生物合成途徑的關(guān)鍵酶。ERG11基因突變改變了ERG11p分子結(jié)構(gòu)，使唑類藥物無(wú)法與靶酶有效結(jié)合而發(fā)生耐藥。已經(jīng)證明ERG11的點(diǎn)突變，特別是發(fā)生在105～165、266～287和405～488氨基酸之間的3個(gè)“熱點(diǎn)”區(qū)域，可以降低念珠菌對(duì)唑類藥物的敏感性[9]。值得注意的是，突變位點(diǎn)的差異對(duì)不同唑類藥物影響不同[10-11]。例如，釀酒酵母菌中Y140F/H的改變會(huì)顯著降低短鏈唑類藥物(氟康唑和伏立康唑)的活性，但不會(huì)影響長(zhǎng)鏈唑類藥物(伊曲康唑和泊沙康唑)的活性[11]。ERG11基因過(guò)度表達(dá)使14-α脫甲基酶增多，唑類藥物不能與過(guò)多的靶酶結(jié)合，從而引起耐藥性的產(chǎn)生。這一點(diǎn)在JIANG等[12]對(duì)熱帶念珠菌的研究中得以證明。但是關(guān)于ERG11基因的改變對(duì)不同念珠菌耐藥性產(chǎn)生的影響仍需要更進(jìn)一步的研究。

2.2藥物外排泵的過(guò)度表達(dá) 藥物外排泵是一種將細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的特殊蛋白泵。外排泵編碼基因的過(guò)度表達(dá)使跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增多，減少了胞內(nèi)藥物濃度而產(chǎn)生耐藥。與念珠菌耐藥相關(guān)的外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有2種，一種是利用三磷酸腺苷(ATP)水解作為能量來(lái)源的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，另一種是利用膜電位驅(qū)動(dòng)外排的主要易化擴(kuò)散載體家族。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cdr1和Cdr2的過(guò)度表達(dá)常與白色念珠菌耐藥有關(guān)，尤其是接受長(zhǎng)期抗真菌治療的患者[13]。除Cdr1和Cdr2外，Snq2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在光滑念珠菌耐藥性的產(chǎn)生中也起著重要作用[14]。與Cdr1和Cdr2同源的CkABC1和CkABC2也參與了克柔絲念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥。GOHAR等[15]研究結(jié)果表明，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族介導(dǎo)的藥物外排，尤其是CgSnq2和CgCdr1在光滑念珠菌對(duì)氟康唑耐藥性的產(chǎn)生中具有重要意義。屬于主要易化擴(kuò)散載體家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mdr1，參與了白色念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥，克柔絲念珠菌中還沒(méi)有探索到耐藥相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[16]。DHA1亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CgAqr1、CgQdr2、CgTpo1和CgTpo3也與光滑念珠菌耐藥有關(guān)[17]。因此，無(wú)論根據(jù)涉及耐藥相關(guān)基因的數(shù)量或是臨床耐藥菌株中觀察到的過(guò)度表達(dá)頻率，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族相關(guān)基因過(guò)度表達(dá)可能是念珠菌屬耐藥的主要機(jī)制。

2.3鋅族轉(zhuǎn)錄因子突變 與念珠菌屬耐藥相關(guān)的鋅族轉(zhuǎn)錄因子主要是UPC2、TAC1、MRR1及PDR1。UPC2調(diào)控ERG11基因的表達(dá)，其功能獲得性(GOF)突變的發(fā)生會(huì)改變ERG11基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致基因的過(guò)度表達(dá)及對(duì)藥物的敏感性降低[18]。Cdr1及Cdr2表達(dá)量的多少與TAC1有關(guān)，研究證明，Cdr1可能是TAC1介導(dǎo)唑類藥物耐藥的主要原因[19]。而Mdr1基因的表達(dá)水平受到MRR1的調(diào)控，其GOF突變使靶基因的表達(dá)發(fā)生改變而參與耐藥發(fā)生。已經(jīng)證明Mdr1在氟康唑和伏立康唑耐藥中起作用，盡管其對(duì)其他唑類抗真菌藥物如伊曲康唑和泊沙康唑的最低抑菌濃度值變化不大[10]。存在于光滑念珠菌中的PDR1主要參與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CgCdr1、CgCdr2和CgSnq2的調(diào)節(jié)，CgPDR1的點(diǎn)突變會(huì)增加CgCdr1和CgCdr2的表達(dá)，與臨床分離株對(duì)唑類藥物的耐藥息息相關(guān)[20]。

2.4改變代謝途徑 麥角甾醇生物合成由25種不同的酶級(jí)聯(lián)催化，合成途徑中其他成分的改變?nèi)绂?5,6-去飽和酶Erg3功能的喪失，也參與念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥。ERG3基因的失活使代謝通路發(fā)生改變，減少了毒性中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，引起對(duì)不同唑類藥物的相互耐藥[21]。雖然該耐藥機(jī)制較為罕見(jiàn)，但在臨床菌株中已經(jīng)觀察到此現(xiàn)象。ERG相關(guān)基因的表達(dá)受到Upc2和Ndt80的調(diào)控。當(dāng)破壞Upc2或Ndt80時(shí)，ERG11、ERG25、ERG6、ERG2、ERG3及ERG4的表達(dá)顯著降低，并可以恢復(fù)對(duì)唑類藥物的敏感性。與Upc2相比，Ndt80在近平滑念珠菌耐藥性的產(chǎn)生中發(fā)揮的作用更強(qiáng)[22]。

2.5線粒體活性的改變 早期研究有報(bào)道線粒體缺陷引起的唑類藥物耐藥，這可能是減少了線粒體中ATP的產(chǎn)生和活性氧的種類[23]。CYTb基因編碼線粒體氧化呼吸鏈中的細(xì)胞色素b，主要參與念珠菌屬體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)。FAN等[24]在對(duì)熱帶念珠菌耐藥機(jī)制的研究中表明，唑類藥物耐藥組菌株CYTb基因的表達(dá)水平明顯低于唑類藥物敏感組菌株，提示CYTb基因表達(dá)水平的降低可能與熱帶念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥具有一定的相關(guān)性。但先前JIANG 等[12]研究結(jié)果指出，唑類藥物敏感組與耐藥組CYTb基因的表達(dá)水平無(wú)明顯差別，這表明線粒體活性的改變與唑類藥物耐藥相關(guān)性不大。因此，需要更多的研究證實(shí)兩者間的關(guān)系。

3 對(duì)棘白菌素類的耐藥機(jī)制

棘白菌素類藥物以β-1,3-D-葡聚糖合酶為靶點(diǎn)，通過(guò)阻斷葡聚糖的合成、破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性，最終使細(xì)胞裂解死亡發(fā)揮抗真菌作用。其耐藥性產(chǎn)生的主要機(jī)制是編碼葡聚糖合酶催化亞基的基因(FKS1和FKS2)發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致氨基酸的替換及由此產(chǎn)生的葡聚糖合酶結(jié)構(gòu)的改變，從而降低了棘白菌素對(duì)葡聚糖合酶的敏感性[9,21]。其中FKS1點(diǎn)突變主要包括S629P、F625Δ和F625C，F(xiàn)KS2點(diǎn)突變主要包括F659Δ、S663F、R1378S、R1378G、S663P、P667H、P667T、E655G和E655K[25-26]，這一點(diǎn)在白色念珠菌及部分非白色念珠菌中均得以證實(shí)。適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)的啟動(dòng)也是棘白菌素耐藥的潛在機(jī)制。體外研究表明，當(dāng)棘白菌素類藥物抑制葡聚糖合成時(shí)，念珠菌屬會(huì)增加細(xì)胞壁其他成分如幾丁質(zhì)的合成，這種增加是由高滲透壓甘油(HOG)途徑、PKC-MAPK途徑和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路引起的[27]。Hsp90能夠調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和許多應(yīng)激激活蛋白激酶的功能，抑制Hsp90可降低發(fā)生FKS1突變的臨床分離株對(duì)棘白菌素的耐藥性[28]。另外基因組可塑性也與棘白菌素耐藥有關(guān)，這種可塑性可能會(huì)導(dǎo)致雜合子丟失、染色體拷貝數(shù)增加、非整倍體的形成等，但其背后的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 對(duì)多烯類的耐藥機(jī)制

多烯類藥物以細(xì)胞膜中的麥角甾醇為靶點(diǎn)，與甾醇相互作用導(dǎo)致細(xì)胞膜產(chǎn)生孔隙，從而使細(xì)胞內(nèi)單價(jià)離子(如K+、Na+、H+和Cl-)快速外漏引起細(xì)胞崩解死亡。近幾年，有研究強(qiáng)調(diào)多烯類藥物可以直接結(jié)合并從細(xì)胞膜中提取麥角甾醇，阻止麥角固醇發(fā)揮其重要功能[29]。另外，多烯類藥物還可以引起真菌細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。多烯類藥物的耐藥性相對(duì)罕見(jiàn)，其耐藥性產(chǎn)生的主要原因是細(xì)胞膜麥角固醇含量的降低或結(jié)構(gòu)的改變，這可能與先前使用三唑類藥物降低了膜麥角固醇的濃度或編碼麥角固醇生物合成途徑的相關(guān)基因(如ERG3、ERG6、ERG24和ERG2等)發(fā)生突變有關(guān)[31]。ERG3基因的錯(cuò)義突變還可以引起唑類藥物與兩性霉素B交叉耐藥，這一點(diǎn)在熱帶念珠菌中已經(jīng)得到證實(shí)。

5 對(duì)氟胞嘧啶的耐藥機(jī)制

5-氟胞嘧啶可抑制真菌細(xì)胞核酸合成作用。其在胞嘧啶通透酶(由FCY2基因編碼)的協(xié)助下主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到真菌細(xì)胞中，隨后經(jīng)胞嘧啶脫氨酶(由FCY1基因編碼)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶。后者經(jīng)尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(由FUR1基因編碼)生成5-氟尿嘧啶單磷酸鹽，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成發(fā)揮抗真菌作用。雖然氟胞嘧啶對(duì)大多數(shù)念珠菌具有很好的活性，但是此類藥物在單藥治療期間容易產(chǎn)生耐藥，限制了其在臨床中的使用，因此主要與多烯類化合物聯(lián)合應(yīng)用治療隱球菌性腦膜炎[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，念珠菌對(duì)氟胞嘧啶的耐藥性與FCY1、FUR1、FCY2 基因突變有關(guān)[32-33],其中以FUR1基因突變最為常見(jiàn)。FUR1基因突變降低了5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物的能力，導(dǎo)致了耐藥性的發(fā)生。

6 解決真菌耐藥的策略

由于抗真菌藥物種類有限，臨床醫(yī)生必須合理使用現(xiàn)有抗真菌藥物，避免過(guò)早出現(xiàn)耐藥。這需要臨床醫(yī)生掌握常用抗真菌藥物特定的抗菌譜及藥物在體內(nèi)不同組織部位的濃度，由此選擇合適的藥物種類及劑量。了解所在地區(qū)及醫(yī)院真菌的流行病學(xué)及耐藥現(xiàn)狀也具有重要指導(dǎo)意義。而積極尋找新的藥物靶點(diǎn)、研發(fā)新型抗真菌藥物也勢(shì)在必行。一方面可以對(duì)原有的抗真菌藥物進(jìn)行化學(xué)修飾以提高其抗菌活性，另一方面可以開(kāi)發(fā)新型結(jié)構(gòu)的藥物或?qū)ふ倚碌淖饔冒悬c(diǎn)。目前，已經(jīng)研發(fā)的麥角甾醇生物合成抑制劑包括VT1129、VT1598和VT1161，它們高選擇性地作用于真菌酶CYP51，而對(duì)人體細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶沒(méi)有抑制作用，顯著降低了藥物的毒性作用[34]。針對(duì)葡聚糖合酶這一靶點(diǎn)，已報(bào)道的包括具有代表性的長(zhǎng)效棘白菌素類藥物 CD101與三萜糖苷化合物SCY-078，后者是一種新型的口服抗真菌藥物，填補(bǔ)了棘白菌素類藥物只能靜脈給藥的空白[35-36]。作用于其他新靶點(diǎn)的藥物也不斷被挖掘，比如作用于真菌線粒體膜破壞氧化呼吸鏈的芳香酰胺類抗真菌藥物T-2307[37]、抑制肌醇?；D(zhuǎn)移酶破壞糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白合成的E1210[38]，以及選擇性抑制嘧啶生物合成途徑關(guān)鍵酶二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)活性的F901318[39]，但這些藥物大部分尚處于臨床試驗(yàn)階段，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性及臨床可行性。另有研究表明，乙醛酸循環(huán)中的異檸檬酸裂合酶是真菌產(chǎn)生毒力所必需的，通過(guò)抑制該酶的活性可對(duì)不同真菌具有抑制作用，這為開(kāi)辟新型抗真菌藥物提供了思路[40]。此外，從中藥成分中尋找有效抗真菌藥物或增效劑也是一重要手段。堅(jiān)信不久將涌現(xiàn)出更多值得深入研究的新型抗真菌藥物，為臨床治療真菌感染提供更多可供選擇的治療方案。

7 小 結(jié)

綜上所述，真菌耐藥情況日趨嚴(yán)重，盡管抗真菌藥物不斷發(fā)展，但新型藥物難以較快應(yīng)用于臨床。加上侵襲性念珠菌病抗感染療程長(zhǎng)，治療過(guò)程中有可能使藥物敏感性降低甚至產(chǎn)生耐藥性，使得臨床治療失敗。因此，在臨床工作中應(yīng)及早進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并根據(jù)結(jié)果調(diào)整藥物，最大限度地減少耐藥菌株的產(chǎn)生。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)患者的管理及藥物的監(jiān)測(cè)以優(yōu)化治療效果和減少不良反應(yīng)的產(chǎn)生。另外，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)念珠菌耐藥機(jī)制深入了解，以提高現(xiàn)有抗真菌藥物的療效，積極尋找新的藥物靶點(diǎn)以抑制耐藥率的上升。