非小細胞肺癌細胞學樣本分子病理學檢測現狀

徐海苗，童衛(wèi)青

作者單位：310022杭州，中國科學院大學附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院）

肺癌樣本的分子檢測目前主要應用組織樣本進行檢測，是目前驅動基因檢測的金標準。常用檢測方法包括直接測序法、PCR、熒光原位雜交（FISH）及高通量二代測序（NGS）等。然而，細胞學樣本作為非小細胞肺癌（NSCLC）病理學樣本的重要組成部分，常是診斷肺癌類型和開展靶向基因檢測的唯一標本來源，尤其對于中晚期肺癌和復發(fā)轉移性肺癌等，細胞學樣本來源豐富，對此類樣本進行分子檢測意義尤為重大。同時，細胞學標本多采用快速乙醇固定，組織新鮮，使其提取的DNA質量較高，分子檢測成功率也較高。有研究表明，與組織學標本相比，細胞學標本分子檢測有相似或甚至較高的敏感性和準確率。本文旨在回顧近年來肺癌細胞學樣本分子檢測的相關文獻，闡述其檢測現狀及今后發(fā)展。

1 痰液

痰液脫落細胞檢查一直作為肺癌，尤其是中心型肺癌診斷的重要方法，且在痰標本中可以進行HnRNP、KRAS等多個基因檢查，對于是否能在痰液樣本上進行EGFR突變檢測也是臨床診斷關注的焦點。Hubers等研究結果發(fā)現，在已確診EGFR突變NSCLC患者的痰液標本中，EGFR在不同實驗方法下的陽性表達率為30%～50%，而在慢性阻塞性肺疾病患者中無一例檢出表達。這說明痰液具有作為基因突變檢測標本的潛能，但其與組織表達位點的一致性尚未可知。王飛等收集了40例疑似肺癌患者的痰液，分別做痰細胞學檢測和FISH檢測，結果顯示FISH和細胞學檢查的敏感度分別為80.6%和22.6%，特異性分別為77.8%和100.0%，診斷符合率為80.0%和40.0%。這說明痰液樣本在肺癌診斷中FISH較常規(guī)細胞學具有更高的敏感度和診斷符合率，FISH能明顯改進肺癌的診斷，可以作為肺癌細胞學診斷的補充。

痰液中脫落細胞是肺組織損傷的直接表現，因痰液取材方便，無創(chuàng)，操作簡單，相對經濟，其正逐漸用于肺癌的輔助診斷，可作為對高危人群進行篩查和及早發(fā)現早期肺癌的一種常規(guī)檢測方法，具有良好的應用前景。

2 漿膜腔積液

晚期NSCLC首診患者10%～15%存在惡性胸腔積液，復治患者中惡性胸腔積液的比例更高，可達到50%以上。目前已有多項臨床研究顯示采用胸腔積液作為組織替代品進行檢測有較高的可行性。Hung等結果結果表明，檢測惡性胸腔積液細胞中EGFR突變是一種可行的輔助方法。王斯等選取了NSCLC患者的胸腔積液與配對腫瘤組織樣本，將胸水制成細胞蠟塊，脫蠟后提取DNA，采用ARMS方法檢測樣本中EGFR基因第18～21外顯子突變情況，研究表明，在胸水組EGFR基因突變率為48.61%；活檢組織組EGFR基因突變率為51.39%，兩者差異無統(tǒng)計學意義，兩者的一致率較高。Soh等收集了61例NSCLC患者的胸腔積液，采用直接測序、非富集PCR、突變富集PCR和肽核酸鎖存核酸（PNA-LNA）PCR檢測EGFR的突變狀態(tài)。結果顯示突變富集的PCR檢測到16例突變病例，其中未富集PCR方法未能檢測到3例突變；在富集突變PCR與PNA-LNA PCR鉗夾檢測的差異中，僅富集突變PCR檢測到3例外顯子19缺失，L858R突變無差異。直接測序法和非富集PCR法的結果無差異。而且研究顯示EGFR突變組的總生存期和無進展生存期顯著長于野生型，因此胸腔積液中EGFR突變狀態(tài)可作為吉非替尼治療的NSCLC患者良好預后的生物標志物。

3 針吸穿刺細胞學

3.1 支氣管內超聲引導針吸活檢技術（EBUS-TBNA）EBUS-TBNA是近年來出現的一項新的微創(chuàng)診斷技術，在傳統(tǒng)氣管鏡檢查的基礎上增加了多普勒超聲的方法。Santis等應用超聲內鏡細針穿刺技術，檢查收集13l例液基細胞標本，使用共擴增-PCR（COLD-PCR）和直接測序篩選EBUS-TBNA獲得的細胞學樣本中EGFR和KRAS突變的可行性，與標準PCR不同，在較低變性溫度下的COLD-PCR優(yōu)先擴增突變序列，從而提高了檢測基因突變的敏感性，自首次報道以來，COLD-PCR已被證明在許多用于檢測混合樣本突變的應用中優(yōu)于常規(guī)PCR，結果顯示其中126例符合基因檢測分析標本要求，結論是NSCLC通過EBUS-TBNA可以為大多數患者的EGFR和KRAS突變分析提供足夠的腫瘤材料。

3.2 經皮肺結節(jié)穿刺細胞學檢查 王海彥等收集228例不可手術切除的Ⅱ～Ⅳ期肺癌患者，進行CT引導下經皮肺穿刺活檢，218例穿刺取材標本成功，提取DNA，采用實時熒光定量RCR技術直接測序法進行EGFR18～21外顯子突變雙向直接測序，共檢測到93例基因突變，其中EGFR18、19、20、21外顯子突變分別為2、52、3、36例。因此，CT引導下經皮細針穿刺活檢可作為中晚期肺癌EGFR基因檢測的取材手段。Scarpa等連續(xù)收集經皮細針穿刺肺腺癌細胞學標本38例，腫瘤細胞從細胞涂片中刮除，在顯微鏡下手工顯微切割，以獲得至少100個腫瘤細胞，提取DNA，采用二代測序（NGS）的方法對22個肺癌相關基因的504個突變熱點同時進行評估，36例（95%）成功測序，分別在16%（6/36）和28%（10/36）的病例中發(fā)現EGFR和KRAS突變，而且兩者是相互排斥的。

3.3 淋巴結穿刺細胞學檢查 張智慧等收集了85例肺癌轉移淋巴結針吸液基保存液標本，同時，19例有手術后的組織標本作為匹配，結果顯示EGFR突變率為37.3%，KRAS突變率為7.2%，與組織學的一致性為100%。13例有EGFR突變的患者臨床分期IV期，使用酪氨酸抑制劑治療后，2例完全緩解（16.7%），8例部分緩解（66.7%），3例達到穩(wěn)定（25.0%）。由此可知，細胞學針吸穿刺標本可作為基因檢測標本來源之一，對后續(xù)靶向治療有指導性意義。Qiu等收集89例肺腺癌患者的淋巴結轉移灶細針針吸穿刺標本，應用NGS對其進行基因檢測，研究發(fā)現EGFR基因突變率為34.0%，KRAS基因突變率為8.0%，BRAF基因突變率為3.0%，同時也檢測到PIK3CA、TP53、APC、MET、GNAS和HRAS等基因的異常改變。因此，NGS適用于FNAC獲得的肺腺癌轉移淋巴結標本的基因突變篩選，并可能促進肺腺癌患者靶向新療法的開發(fā)。

4 纖維支氣管鏡下刷檢/肺泡灌洗液

纖維支氣管鏡刷片細胞病理學檢查是當前診斷肺癌及肺部其他惡性腫瘤較好的方法，具有簡便、快速及準確率高等特點，對于臨床診斷和治療，尤其對于早期發(fā)現肺癌的作用越來越大。

一項研究收集了50例疑似中央型肺癌患者，獲取刷檢細胞標本及鉗活檢組織，細胞標本制成細胞塊，分別采用NGS方法檢測，發(fā)現在62%的腫瘤陽性刷片樣本中是可行的，在這些病例中，78%的NGS與組織學標本顯示相同的結果，有22%來自刷檢涂片的NGS檢測到特定的突變，而來自鉗活檢的DNA質量不足以進行NGS分析。刷檢涂片分析的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為66%、100%、100%和21%。

Kanaji等收集了161例纖維支氣管鏡刷檢細胞學標本，從細胞中提取RNA，合成cDNA，采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）進行基因異常的分析，發(fā)現EML4-ALK融合基因在NSCLC中的陽性率為3.1%（5/161），在肺腺癌中的陽性率為4.5%（4/88），EGFR在NSCLC中的突變率為24.2%（39/161），在肺腺癌中的突變率為40.9%（36/88）。

支氣管肺泡灌洗液標本是在CT引導下通過支氣管鏡對特定的肺段、亞肺段灌洗后取得，可獲得支氣管鏡所不能探及的細胞學標本，提高了肺癌診斷的陽性率，已廣泛用于診斷肺部疾病，尤其是對一些不能行肺穿刺活檢或開胸活檢的肺疾病，其能直接取得肺病變的局部信息。但由于其臨床應用較為局限，且標本中癌細胞含量較低，所以很少用于基因檢測。

Asaka等從219例患者中收集新鮮的肺泡灌洗液標本，進行細胞學診斷，確診為原發(fā)性肺腺癌77例，制成細胞蠟塊并進行DNA提取，采用ARMS的方法進行分析，檢測EGFR突變，并與49例手術切除或活檢組織標本進行比較，成功分析了77例肺泡灌洗液標本的突變狀態(tài)，結果與49例手術切除或活檢組織標本的突變狀態(tài)一致。另外研究表明甚至在10個含有足夠腫瘤細胞的細胞學標本中檢測到EGFR突變，因此，用肺泡灌洗液標本進行EGFR突變檢測是一種有用和可靠的方法，特別是當沒有獲得足夠的癌細胞時。

5 腦脊液

肺癌腦轉移的發(fā)生率可達40%，而50%的腦轉移瘤的原發(fā)灶在肺部，因此，腦轉移已成為肺癌的主要死亡原因之一。臨床需要一種替代的、更敏感的腦轉移診斷方法。Yang等收集了30例肺腺癌腦轉移患者，比較腦脊液樣本和配對的原發(fā)性肺腫瘤組織樣本之間的EGFR狀態(tài)，抽吸腦脊液5 ml，采用纖維支氣管針吸或經皮經胸活檢獲取相應的組織，分別從肺腫瘤組織和腦脊液標本中提取基因組DNA和無細胞DNA，使用ARMS-PCR檢測。結果顯示共有13例（43%）患者明確為EGFR突變，與組織標本比較，顯示腦脊液作為EGFR基因檢測的敏感性和特異性分別為67%和82%，可以作為顱內腫瘤患者臨床EGFR-TKI治療的指南，ARMS-PCR可能是檢測肺腺癌腦轉移患者腦脊液中EGFR突變的一種突變DNA豐度較低的敏感方法。

另一項研究收集了29例肺腺癌疑似癌性腦膜炎患者，行腰椎穿刺，抽吸10 ml腦脊液，采用經支氣管肺活檢或針吸法從原發(fā)癌中采集組織標本，分別提取DNA，采用PCR法分析腦脊液EGFR狀態(tài)。結果顯示有13例（45%）腦脊液中檢測到EGFR突變。在16例腦脊液細胞學檢查陰性的患者中，有5例（31%）檢測到EGFR突變。在4例患者中，腦脊液中顯示EGFR突變，但在原發(fā)灶或轉移灶中沒有。相反，在2例腦脊液細胞學呈陽性的患者中未檢測到EGFR突變，而在原發(fā)灶或轉移灶中檢測到腫瘤細胞EGFR突變，這說明腦脊液中的EGFR突變并不總是反映原發(fā)灶或轉移灶的相同狀態(tài)。

綜上所述，支氣管刷檢細胞學樣本的基因突變檢測對早期未見明顯腫物及晚期無法獲得組織樣本的NSCLC患者具有很高的臨床應用價值。作為腫瘤基因突變檢測樣本，樣本中腫瘤細胞的純度與檢測準確率密切相關，但在腦脊液平臺上支氣管刷檢細胞學標本作為替代活檢組織標本的最低腫瘤細胞純度，其要求還是未知的，需要進一步探索。

(參考文獻略，讀者需要可向編輯部索取)