間充質(zhì)干細(xì)胞在宮腔粘連治療中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

張明樂，黃向華

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，石家莊 050000)

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)是嚴(yán)重危害女性生育功能的婦科常見疾病，并且隨著宮腔手術(shù)的增加呈增長趨勢，已成為女性子宮因素不孕的首要病因。IUA的主要原因是子宮內(nèi)膜基底層受損引起內(nèi)膜纖維化、子宮壁或?qū)m頸管粘連，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)量減少、流產(chǎn)及不孕。IUA的治療主要是IUA分離術(shù)(transcervical resection of adhesion，TCRA)，術(shù)后放置物理屏障預(yù)防再次粘連，口服雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)[1]。輕、中度IUA療效尚可，但是重度IUA治療效果欠佳，術(shù)后再粘連率高，活產(chǎn)率僅為29.1%[2]。IUA的本質(zhì)是一種纖維化疾病，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)是一類多能干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化能力，其作為新的再生醫(yī)學(xué)方法已成治療組織損傷以及損傷導(dǎo)致纖維化疾病的熱點(diǎn)。

1 MSCs在IUA治療中的作用

MSCs具有多向分化潛能，已有大量基礎(chǔ)研究及臨床試驗證實其治療IUA的有效性，主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSC)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、月經(jīng)血干細(xì)胞(menstrual blood-derived stem cells，MenSC)和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞等。隨著對MSCs研究的逐步深入，其旁分泌作用逐漸被重視，外泌體(exosome，EXO)被認(rèn)為是發(fā)揮主要作用的因子[3]。EXO是活細(xì)胞分泌的膜性囊泡，直徑約30～100nm，內(nèi)含蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA、IncRNA等，可在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)傳遞。MSCs來源的外泌體能促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)[4-5]。MSCs條件培養(yǎng)液含有其分泌的多種活性物質(zhì)，具有易于獲取、使用方便、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用MSCs分泌的多效因子或條件培養(yǎng)液能促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生[6-7]。

1.1 BMSCs BMSCs是一類具有保留體外自我復(fù)制能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增，遷移到損傷部位參與組織再生。雖然BMSCs自我更新能力的年齡依賴性和提取過程的有創(chuàng)性限制了其使用，但是BMSCs仍是臨床移植最常見的細(xì)胞來源，許多研究已經(jīng)闡明了其在子宮內(nèi)膜再生中的作用。

Wang等[8]將BMSCs通過鼠尾靜脈與宮腔內(nèi)注射的方式治療IUA大鼠，結(jié)果顯示,與對照組相比，兩種給藥途徑都顯著增加子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量，降低纖維化面積率，上調(diào)子宮內(nèi)膜雌孕激素受體表達(dá)。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，在將干細(xì)胞歸巢到子宮方面，全身注射優(yōu)于局部注射；同時觀察到BMSCs在受損傷和未受損傷的宮角之間的募集無差異，表明干細(xì)胞的歸巢廣泛發(fā)生在子宮內(nèi)，而不是特定的損傷部位[9]。Yang等[10]將BMSCs與維生素C注射到IUA大鼠宮角，結(jié)果證實BMSCs和調(diào)節(jié)因子維生素C的治療促進(jìn)了受損IUA子宮內(nèi)膜的修復(fù)。Xin等[11]研究證實，BMSCs外泌體聯(lián)合膠原蛋白通過miRNAs的免疫調(diào)節(jié)功能促進(jìn)IUA小鼠子宮內(nèi)膜再生和生育力恢復(fù)。

2011年，1例重度IUA患者接受自身骨髓的成體干細(xì)胞移植，移植后子宮內(nèi)膜厚度增加并獲得成功妊娠[12]。2014年，6例重度IUA患者接受單核干細(xì)胞子宮內(nèi)膜下移植，移植后5例患者月經(jīng)恢復(fù)[13]。2016年Santamaria等[14]首次將BMSCs用于11例復(fù)發(fā)性IUA患者和5例子宮內(nèi)膜萎縮患者的治療。每例患者平均采集1.24×109個自體BMSCs，通過介入治療注射到子宮動脈，在移植前后都接受了激素替代療法。移植后除1例子宮內(nèi)膜萎縮患者外，所有患者的月經(jīng)周期均在1個月內(nèi)恢復(fù)，宮腔鏡評估期別降低，3例患者自然妊娠，7例患者通過14次胚胎移植而妊娠。

1.2 UC-MSC UC-MSC具有較高的分化潛能，并且具有取材方便、無倫理學(xué)爭議和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，因此越來越受到研究者們關(guān)注。Shi等[15]通過體外培養(yǎng)試驗證實，UC-MSC能向子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化，cAMP/PKA信號通路可能是其分化的關(guān)鍵通路。Zhang等[16]給IUA大鼠鼠尾靜脈注射UC-MSC，治療后大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)與妊娠率均顯著改善，纖維化標(biāo)記物與炎性因子水平顯著降低。有研究證實，移植的膠原/UC-MSCs能促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生和膠原重塑，誘導(dǎo)原位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)雌孕激素受體的表達(dá)[17]。還有研究證實,UC-MSC來源外泌體能促進(jìn)IUA大鼠子宮內(nèi)膜修復(fù)[6]。

一項應(yīng)用UC-MSC治療IUA的I期臨床試驗，納入了26例接受IUA分離術(shù)后復(fù)粘的女性。受試者在接受IUA分離術(shù)后，均在宮腔內(nèi)放置膠原支架與UC-MSC復(fù)合物，治療后3個月受試者內(nèi)膜厚度增加，共有10例患者成功妊娠，8例活產(chǎn)，無嚴(yán)重不良反應(yīng)[18]。

1.3 ADSCs ADSCs與BMSCs具有相似的基因表達(dá)譜和分化潛能，但是獲取方法較簡單,創(chuàng)傷小，增殖能力強(qiáng)。有學(xué)者將ADSCs通過子宮注射聯(lián)合腹腔注射的方式治療IUA大鼠，結(jié)果顯示，與單純IUA組相比，ADSCs治療組子宮內(nèi)膜修復(fù)明顯，但與雌孕激素治療組效果無明顯差異，ADSCs聯(lián)合雌孕激素治療組子宮內(nèi)膜修復(fù)效果最佳[19]。Zhao等[5]通過腹腔注射ADSCs來源外泌體治療IUA大鼠，結(jié)果顯示其能促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)與生育能力。

臨床研究方面，6例AFS評分為重度IUA，IUA分離術(shù)后接受激素替代治療子宮內(nèi)膜仍然菲薄的患者接受了自體ADSCs治療。所有受試者都接受了吸脂術(shù)，ADSCs通過宮腔灌注方式應(yīng)用，治療后受試者進(jìn)行雌孕激素序貫治療。治療后，受試者內(nèi)膜平均厚度從3.0mm增加到6.9mm，5例患者的月經(jīng)情況得以改善，1例患者通過IVF成功妊娠，但是在孕9周時流產(chǎn)[20]。

1.4 MenSC MenSC是子宮內(nèi)膜MSCs的來源，具有易于獲得、無倫理爭議、遺傳性穩(wěn)定、增殖能力強(qiáng)、無致瘤性及無免疫原性的優(yōu)勢，是治療IUA的潛在來源，已在動物模型及臨床試驗中進(jìn)行研究。當(dāng)與TGF-β、17β-雌二醇、PDGF和表皮生長因子共培養(yǎng)時，MenSC能在體外分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞；將其移植到非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠腋窩下能產(chǎn)生子宮內(nèi)膜組織[21]。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，MenSC能修復(fù)子宮內(nèi)膜，其條件培養(yǎng)液通過Akt和(或)ERK信號通路在子宮內(nèi)膜修復(fù)的過程中促進(jìn)血管生成。

我國學(xué)者納入7例(20～40歲)有月經(jīng)合并有不孕的重度IUA患者(III～I(xiàn)V級)進(jìn)行臨床研究。收集2周的月經(jīng)血，將自體MenSC進(jìn)行分離培養(yǎng)后移植回子宮，移植后給予激素替代治療。結(jié)果顯示5例受試者內(nèi)膜厚度增加到7mm，4例患者接受了IVF-ET，其中2例成功妊娠，1例自然流產(chǎn)[23]。

此外還有關(guān)于羊膜MSCs治療IUA的基礎(chǔ)研究[7，24]，以及胎盤干細(xì)胞進(jìn)行組織修復(fù)的相關(guān)研究[25-26]，這些干細(xì)胞也許也是未來治療IUA的選擇。

2 MSCs治療IUA的作用機(jī)制

MSCs促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)是其分化功能還是分泌功能發(fā)揮主要作用,目前尚無定論，但是越來越多的研究支持分泌作用在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮主要功能。MSCs治療IUA，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生的可能機(jī)制有：(1)干細(xì)胞歸巢后分化為新組織細(xì)胞；(2)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制纖維化進(jìn)程；(3)調(diào)控局部的MSCs增殖、遷移，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生；(4)通過釋放免疫調(diào)節(jié)因子，影響血管生成；(5)通過上調(diào)抗炎細(xì)胞因子和下調(diào)促炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[27-28]。

2.1 干細(xì)胞歸巢后分化為新組織細(xì)胞 Taylor[29]在接受骨髓移植女性的子宮內(nèi)膜內(nèi)發(fā)現(xiàn),供者的BMDSCs可分化成為子宮內(nèi)膜細(xì)胞。有研究證實,循環(huán)血中低水平BMDSCs可整合至損傷部位分化成為包括子宮內(nèi)膜在內(nèi)的相應(yīng)組織細(xì)胞[30]。有學(xué)者通過外源性因素或內(nèi)源性間質(zhì)細(xì)胞分泌因子等在體外培養(yǎng)條件下成功將BMDSCs、UC-MSC誘導(dǎo)分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometrial epithelial cells，EECs)[31-32]。Cong等[33]將BMDSCs與EECs聯(lián)合共培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析BMDSCs向EECs轉(zhuǎn)化過程中的差異蛋白及其相關(guān)途徑，發(fā)現(xiàn)ERK/MAPK以及α-catenin通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、組織發(fā)育和細(xì)胞運(yùn)動網(wǎng)絡(luò)中的核心差異蛋白發(fā)揮重要作用。上述研究均表明干細(xì)胞歸巢后可分化為新的組織細(xì)胞。2007年Mints等[34]在1例接受男性親屬骨髓移植的血液病女性患者剖宮產(chǎn)術(shù)后取得的子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)，平均14%的子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞為供者來源；1年后對其再次行子宮內(nèi)膜活檢術(shù)，發(fā)現(xiàn)僅有10%的子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞為供者來源。表明BMDSCs是一個誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞再生的有限來源，而不是子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的循環(huán)來源，這與Cervello等[35]的觀點(diǎn)一致。

2.2 干細(xì)胞抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制纖維化進(jìn)程 IUA本質(zhì)是一種纖維化疾病，即子宮內(nèi)膜嚴(yán)重?fù)p傷修復(fù)造成膠原纖維沉積在宮腔內(nèi)而造成內(nèi)膜纖維化。目前有多項研究表明，IUA發(fā)生與TGF-β/Smad3通路相關(guān)[36-38]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮性細(xì)胞經(jīng)過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的生物過程，在創(chuàng)傷導(dǎo)致的纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中II型EMT具有重要作用[39]。已有研究提示,Smad信號與EMT和子宮內(nèi)膜纖維化過程相關(guān)[28]。因此MSCs可能通過抑制TGF-β/Smad3信號通路，抑制EMT與子宮內(nèi)膜纖維化，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)。

2.3 調(diào)控局部的MSCs增殖、遷移及促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生 女性一生大約要經(jīng)歷400多個周期子宮內(nèi)膜脫落與再生，其強(qiáng)大再生能力被認(rèn)為與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞相關(guān)[40]。2004年，Chan等[41]首次從子宮內(nèi)膜中分離出子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cells，EnSCs)。EnSCs是包括子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(endometrial mesenchymal stem cells，EMSCs)、子宮內(nèi)膜上皮干細(xì)胞(endometrial epithelial stem cells，EESCs)、子宮內(nèi)膜側(cè)群細(xì)胞(endometrial side population，ESP)以及子宮內(nèi)膜再生細(xì)胞(endometrial regenerative cell，ERC)等多種細(xì)胞分化的來源。當(dāng)內(nèi)膜損傷后原位的干細(xì)胞可被激活并進(jìn)行子宮內(nèi)膜的修復(fù)[42]。MSCs可能通過調(diào)節(jié)和激活局部的EMSCs，促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生。

2.4 通過釋放免疫調(diào)節(jié)因子影響血管生成 新生血管形成對內(nèi)膜的再生與修復(fù)起重要作用，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂和維持血管通透性等重要作用。VEGF在月經(jīng)后內(nèi)膜的修復(fù)再生早期起重要作用，可快速促進(jìn)血管生成。子宮血流量低和血管生成受損被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜變薄的原因[43]，然而子宮內(nèi)膜損傷會導(dǎo)致VEGF高表達(dá)[44]，促使新生血管發(fā)生，血管通透性增加，血管中纖維蛋白原滲出并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞積聚，子宮內(nèi)膜被纖維結(jié)締組織替代，導(dǎo)致IUA。MSCs可能在IUA產(chǎn)生的不同階段通過調(diào)控VEGF影響血管生成，促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)。

2.5 通過上調(diào)抗炎細(xì)胞因子和下調(diào)促炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用 有研究認(rèn)為，子宮內(nèi)膜脫落與再生與孕激素撤退觸發(fā)宮腔內(nèi)一系列炎癥細(xì)胞及其介質(zhì)反應(yīng)相關(guān)[45]。通過收集月經(jīng)不同時間點(diǎn)內(nèi)膜檢測炎癥因子表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)不同時間點(diǎn)表達(dá)水平不同，表明炎癥反應(yīng)在內(nèi)膜損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[46]。過度炎性反應(yīng)會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異常修復(fù)，發(fā)生纖維化[47]，但是炎癥細(xì)胞和介質(zhì)對纖維化過程的調(diào)控尚無系統(tǒng)研究。MSCs可能產(chǎn)生上調(diào)抗炎細(xì)胞因子(如IL-2、IL-4、IL-10)和下調(diào)促炎細(xì)胞因子(如IL-17和腫瘤壞死因子α)發(fā)揮子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用[27]。

外泌體被認(rèn)為是在MSCs分泌功能中發(fā)揮重要作用的因子，其包含的多種RNA分子在細(xì)胞之間進(jìn)行信號傳遞，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Xiao等[48]研究表明，miR-340參與調(diào)控BMCSs治療子宮內(nèi)膜修復(fù)的過程，外泌體介導(dǎo)了miR-340從BMCSs向子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的傳遞。一項關(guān)于系統(tǒng)性硬化癥的研究發(fā)現(xiàn)，其成纖維細(xì)胞外泌體中膠原相關(guān)miRNA水平失衡，表明在系統(tǒng)性硬化癥中外泌體數(shù)目和含量都發(fā)生了變化[49]。Li等[50]證實miR-29b通過阻斷Sp1-TGF-b1/Smad-CTGF途徑抑制子宮內(nèi)膜纖維化。這些研究中抗纖維化miRNA可作為未來治療宮腔粘連的靶點(diǎn)。有學(xué)者通過腹腔注射與子宮肌層局部注射途徑利用MSCs-EXO治療宮腔粘連，取得了滿意結(jié)果[4-5]，但是外泌體臨床應(yīng)用的途徑還需更多的研究來探討。

3 總結(jié)與展望

隨著MSCs治療的不斷進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)使用來自骨髓、臍帶血、脂肪和月經(jīng)血的MSCs可幫助子宮內(nèi)膜再生，為中、重度IUA患者帶來了希望。盡管在MSCs治療IUA研究領(lǐng)域已獲得了很多進(jìn)展，但是仍存在許多問題。如在子宮內(nèi)膜修復(fù)領(lǐng)域，胚胎干細(xì)胞可能與子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病等的發(fā)生有關(guān)，MSCs是否會產(chǎn)生相同的問題?另一個問題是干細(xì)胞除了參與增殖外，還通過分泌生長因子刺激血管生成，加速纖維結(jié)締組織形成。

明確MSCs治療IUA的作用機(jī)制具有重要意義，不僅能為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，提高應(yīng)用過程中的安全性，更為臨床轉(zhuǎn)化指明方向。若MSCs的作用以分化功能為主，臨床轉(zhuǎn)化研究將集中于MSCs的安全性、應(yīng)用途徑與劑量；若以分泌功能為主，未來的研究方向?qū)⒓杏贛SCs外泌體與干細(xì)胞多效因子的提取，及其相關(guān)生物產(chǎn)品的制備。

MSCs治療IUA的最佳應(yīng)用途徑尚無定論，文獻(xiàn)報道的應(yīng)用途徑有子宮內(nèi)膜下移植[13]、經(jīng)子宮動脈注射[14]、聯(lián)合膠原支架宮腔內(nèi)放置[18]以及宮腔灌注[20]。從臨床應(yīng)用角度，宮腔內(nèi)放置MSCs緩釋途徑可能最便捷，但是如何保持MSCs活性、其宮腔內(nèi)作用時間和評估治療效果仍需進(jìn)一步研究。已有研究表明，生物材料，如膠原支架、水凝膠和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體等可提高移植細(xì)胞存活率，促進(jìn)干細(xì)胞/多效因子的遞送，因此這些新型生物材料可改善細(xì)胞治療的結(jié)果。將MSCs種植到生物材料表面或內(nèi)部，同時放置到宮腔內(nèi)治療宮腔粘連的研究已有成功的報道[18,51-52]，MSCs聯(lián)合生物材料的模式也是未來IUA的治療研究的一個重要方向。