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    成都麻羊種群微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳多樣性評(píng)估

    2021-03-05 10:26:34余姣姣劉家斌徐永濤吳永勝楊雪齊桂蘭
    四川林業(yè)科技 2021年1期

    余姣姣, 劉家斌, 徐永濤, 吳永勝, 楊雪, 齊桂蘭*

    1. 成都市農(nóng)林科學(xué)院 畜牧研究所,四川 成都 611130;

    2. 成都大熊貓繁育研究基地,四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,四川 成都 610081

    成都麻羊,又名四川銅羊,原產(chǎn)于成都平原及附近丘陵地區(qū),是我國(guó)優(yōu)良肉用地方山羊品種[1,2]。成都麻羊具有生長(zhǎng)發(fā)育快、體格較大、性早熟、繁殖能力強(qiáng)、屠宰率高、膻味輕、肉質(zhì)嫩、板皮優(yōu)良、肉皮兼用等顯著特點(diǎn),現(xiàn)有丘陵型和山地型兩個(gè)生態(tài)類型[1-3]。在我國(guó),早有引進(jìn)成都麻羊改良當(dāng)?shù)厣窖蚺嘤缕贩N的案例,如四川省有名的南江黃羊、金堂黑山羊品種[1-3]。但是,圈養(yǎng)規(guī)模較小、缺乏科學(xué)的管理、近親繁殖現(xiàn)象等問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致成都麻羊的遺傳變異丟失[4],引起圈養(yǎng)種群退化,長(zhǎng)期會(huì)導(dǎo)致遺傳多樣性逐漸喪失,一些特有的重要基因資源會(huì)在培育中消失殆盡,同時(shí)會(huì)造成個(gè)體適應(yīng)能力變?nèi)?,抗病力差,死亡率增加等[5],長(zhǎng)期下來(lái)會(huì)影響圈養(yǎng)成都麻羊種群的健康發(fā)展。畜禽遺傳資源本質(zhì)上是基因資源,保護(hù)畜禽遺傳資源就是保護(hù)基因的多樣性[6]。因此,成都麻羊作為我國(guó)山羊品種的一個(gè)寶貴基因庫(kù),維持其種群遺傳多樣性,最大限度地降低遺傳損失,保證其種群遺傳健康,對(duì)其種群種質(zhì)資源的良性發(fā)展和種群的遺傳管理都具有重要意義。

    微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA),是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸為基本單位進(jìn)行多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列,因而也被稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat,SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)[6-9]。相比其他的分子標(biāo)記技術(shù),微衛(wèi)星DNA標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)突出,如呈現(xiàn)共顯性遺傳、高度多態(tài)性等,是目前最為準(zhǔn)確、先進(jìn)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)之一,是種群遺傳結(jié)構(gòu)研究和多樣性評(píng)估最常用的工具[5,7,10-14]。在山羊、綿羊中,利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記測(cè)定遺傳多樣性已有較多相關(guān)研究[9,11,15-21]。

    鑒于此,為了加強(qiáng)成都麻羊資源的保護(hù)和利用,實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)地方山羊品種種質(zhì)資源的良性開發(fā),滿足市場(chǎng)對(duì)成都麻羊的發(fā)展需求,借助微衛(wèi)星DNA作為遺傳標(biāo)記,對(duì)成都麻羊圈養(yǎng)種群進(jìn)行遺傳多樣性現(xiàn)狀調(diào)查,以期為該資源群體的遺傳背景研究提供分子理論依據(jù),同時(shí)對(duì)合理利用成都麻羊資源和可持續(xù)發(fā)展也具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 研究材料

    本研究以成都西嶺雪農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司(四川省成都市大邑縣)飼養(yǎng)的成都麻羊?yàn)檠芯繉?duì)象,共隨機(jī)挑選268只個(gè)體采集血液樣品,其中雄性個(gè)體18只,雌性個(gè)體250只。對(duì)每只成都麻羊個(gè)體進(jìn)行頸靜脈采血5 mL,隨后用EDTA抗凝混勻,置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室,?20 ℃保存。

    1.2 研究方法

    1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

    本研究采用Tianamp基因組DNA提取試劑盒提取DNA,提取步驟參照使用說(shuō)明書執(zhí)行。將提取得到的DNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),并將其保存于?20 ℃冰箱。

    參考已發(fā)表文獻(xiàn)[7,9,10,16,17,20,21],共選46對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選,有9對(duì)引物(見(jiàn)表1)能較穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增得到多態(tài)性較高的微衛(wèi)星位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增體系(20 uL):DNA模板(濃度25 ng/uL)2 uL,正向引物(濃度10 umol/ul)0.5 uL,反向引物(濃度10 umol/ul)0.5 uL,Mix溶液10 uL,滅菌雙蒸水7 uL。PCR擴(kuò)增條件:首先95 ℃預(yù)變性持續(xù)15 min;之后94 ℃變性持續(xù)30 s,相應(yīng)退火溫度退火持續(xù)30 s,72 ℃延伸持續(xù)30 s,并設(shè)置30個(gè)循環(huán);最后72 ℃終止延伸持續(xù)10 min。每次擴(kuò)增過(guò)程中均設(shè)定陰性對(duì)照,每個(gè)樣品擴(kuò)增3次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后拍照。

    表 1 本研究所用微衛(wèi)星 DNA 標(biāo)記Tab. 1 Microsatellite DNA markers were used in this study

    1.2.2 基因分型

    使用GeneMarker V2.2.0(Demo)軟件,根據(jù)DNA片段大小范圍和峰形質(zhì)量確認(rèn)等位基因。3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)分型一致的結(jié)果直接錄入數(shù)據(jù)庫(kù),若結(jié)果有差異,則需要重新跑PCR甚至重新提取DNA。利用 Excel 2007軟件整理所有樣品對(duì)應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因型數(shù)據(jù)。

    1.2.3 數(shù)據(jù)分析

    利用Micro-Checker[22]檢驗(yàn)每個(gè)位點(diǎn)是否存在無(wú)效等位基因或等位基因缺失等情況。利用Genepop on the Web[23]和GenAlEx[24]軟件,對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)是否偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)和是否存在連鎖不平衡(Linkage disequilibrium,LD)進(jìn)行分析。哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)中,若P>0.05,則符合哈代-溫伯格平衡,說(shuō)明這個(gè)群體是隨機(jī)交配群體;若P<0.05,則呈顯著偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài);若P<0.01,則呈極顯著偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。利用Cervus、GenAlEx、Excel Microsatellite Toolkit統(tǒng)計(jì)各個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因數(shù)(k)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)和多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)[24,25]。當(dāng)PIC<0.25、0.250.5時(shí),分別表示該座位為低度、中度和高度多態(tài)位點(diǎn),其中高度多態(tài)位點(diǎn)能夠提供大量的遺傳信息,中度多態(tài)位點(diǎn)可以提供較為合理的信息[10,11,13,20,21,26]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)

    本研究篩選得到的9對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中,高度多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)有5對(duì)(PIC>0.5),可提供大量的遺傳信息,中度多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)有3對(duì)(0.25

    依據(jù)哈代-溫伯格平衡檢測(cè)中的P值,9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中有7個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)符合哈代-溫伯格平衡,占77.8%;另外2個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)(INRA063和SRCRSP-5)顯著偏離哈代-溫伯格平衡,占22.2%。

    依據(jù)連鎖不平衡檢測(cè)結(jié)果,9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)之間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P>0.001),表明所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)是相互獨(dú)立的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。

    2.2 種群遺傳多樣性分析

    排除SR-CRSP-1外之后,使用剩余的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)圈養(yǎng)成都麻羊種群進(jìn)行遺傳多樣性分析,共有60個(gè)等位基因被成功檢測(cè),各標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因數(shù)介于5~11之間,平均值為7.5;各標(biāo)記位點(diǎn)的平均有效等位基因數(shù)為2.36個(gè);各個(gè)位點(diǎn)私有等位基因檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)其存在;觀察雜合度的變異范圍是0.413~0.770,平均值是0.577;期望雜合度的變異范圍是0.493~0.777,平均值是0.634;多態(tài)信息含量的變異范圍是0.432~0.743,平均值是0.580(見(jiàn)表3)。

    表 2 9 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Tab. 2 Polymorphism detection results of 9 microsatellite markers

    表 3 圈養(yǎng)成都麻羊種群遺傳多樣性情況Tab. 3 Genetic diversity of captive Chengdu gray goat population

    2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)等位基因分布

    在8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中,等位基因較多的前4個(gè)是:ILSTS004,共檢測(cè)到11個(gè)等位基因,大小分 布 在 111~131 bp, 頻 率 范 圍 為 0.0038~0.6000;OarFCB48,共檢測(cè)到9個(gè)等位基因,大小分布在148~168 bp,頻率范圍為 0.0039~0.3262;SR-CRSP-5,共檢測(cè)到8個(gè)等位基因,大小分布在168~186 bp,頻率范圍為0.0077~0.5613;OarFCB011,共檢測(cè)到8個(gè)等位基因,大小分布在133~157 bp,頻率范圍為0.0019~0.4615(見(jiàn)圖 1)。

    圖 1 微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因分布Fig. 1 Allele frequency of microsatellite markers

    在8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中,等位基因較少的4個(gè)位點(diǎn)是:ILSTS033,共檢測(cè)到7個(gè)等位基因,大小分布在 148~166 bp,頻率范圍為 0.0057~0.6985;ILSTS030,共檢測(cè)到7個(gè)等位基因,大小分布在161~175 bp,頻率范圍為 0.0019~0.4775;McM038,共檢測(cè)到5個(gè)等位基因,大小分布在123~139 bp,頻率范圍為 0.0038~0.6629;INRA063,共檢測(cè)到5個(gè)等位基因,大小分布在160~168 bp,頻率范圍為 0.0138~0.4685(見(jiàn)圖 1)。

    3 討論與結(jié)論

    遺傳多樣性是一個(gè)物種適應(yīng)環(huán)境變化所必需的條件[7]。種群內(nèi)的遺傳多樣性反映了一個(gè)物種的進(jìn)化潛力,是其遺傳特征進(jìn)化的基礎(chǔ)[26]。一個(gè)物種的遺傳變異越豐富,其對(duì)自然選擇和環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[6,9,12,27]。遺傳多樣性通常用等位基因多樣性、多態(tài)性、平均雜合度等指標(biāo)來(lái)描述[6,12,16,19]。

    在同一微衛(wèi)星位點(diǎn)中,隨著核心重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)的變化,該位點(diǎn)的片段長(zhǎng)度也會(huì)發(fā)生變化,繼而形成等位基因[11,17];等位基因是形成群體遺傳多態(tài)性的基礎(chǔ),等位基因數(shù)越多,遺傳多態(tài)性越豐富[17]。評(píng)價(jià)位點(diǎn)多態(tài)性高低的指標(biāo)是多態(tài)信息含量[17]。本研究從9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選到5個(gè)高度多態(tài)的位點(diǎn)、3個(gè)中度多態(tài)性的位點(diǎn)、1個(gè)低度多態(tài)性的位點(diǎn),因此僅有前8個(gè)可作為有效的分子標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳多樣性分析。在后續(xù)的分析中我們使用了這8個(gè)中高度多態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了268份成都麻羊樣品,最終在這8個(gè)位點(diǎn)中一共檢測(cè)到的等位基因數(shù)為60個(gè),平均等位基因數(shù)為7.5,與其他綿羊種群相比,要高于甘肅高山細(xì)尾羊、灘羊、藏羊等[7],低于山東省的小尾寒羊、大尾寒羊、山地綿羊、洼地綿羊等[28],與四川省布拖黑綿羊種群基本持平[10],但與其他山羊種群相比,要高于山西黎城大青羊、山西呂梁黑山羊、寧夏中衛(wèi)山羊、貴州白山羊、云南威信白山羊等[11,16,19],低于湖南湘東黑山羊、重慶川東白山羊、云南云嶺山羊、河南黃淮山羊等[11]。不過(guò),這并不能排除種群大小和所用微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)不同而造成的差異。有研究表明,如果樣本量太少,會(huì)導(dǎo)致一些頻率較低的等位基因無(wú)法被檢測(cè)到,進(jìn)而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響[9]。本研究使用了8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了268份成都麻羊樣品,微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量屬于平均水平,種群樣本量較大,而個(gè)別其他研究的樣本量最少僅有20余份[11,17],微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量最少僅有5個(gè)[7,17]。以同一微衛(wèi)星位點(diǎn)而言,種群樣本量越大,其觀察到的等位基因數(shù)往往越多,以微衛(wèi)星位點(diǎn)ILSTS004、OarFCB011和ILSTS030為例,本研究中觀察到的等位基因數(shù)目分別為11、8和7,而在劉成建的研究中(涉及20個(gè)樣本量)僅為5和4[17]。此外,在本項(xiàng)研究中,成都麻羊群體中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量的變異范圍是0.432~0.743,平均多態(tài)信息含量0.580,與劉成建的研究結(jié)果(0.604)基本一致[17],表明了成都麻羊群體具有較豐富的遺傳多樣性。

    基因雜合度,它反映了群體在幾個(gè)位點(diǎn)的遺傳變異情況,是被檢測(cè)的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性的度量參數(shù)[10,17]。若某個(gè)群體的基因雜合度大于0.5,則意味著該群體還未受到高強(qiáng)度的選擇壓力,其遺傳多樣性比較豐富[10,17]。在本項(xiàng)研究中,成都麻羊群體的平均觀察雜合度和平均期望雜合度分別為0.577和0.634,表明該群體有較豐富的遺傳多樣性,該結(jié)果與前述多態(tài)性的分析結(jié)果相一致。另外,劉若余等人基于線粒體D-loop序列調(diào)查了中國(guó)9個(gè)山羊品種的遺傳多樣性,其中成都麻羊的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為 1.0000±0.0243和 0.017956±0.004410,同樣表明其有著豐富的遺傳多樣性[29]。

    有效等位基因數(shù)也可以反應(yīng)群體的遺傳變異大小,在數(shù)值上等于基因純合度的倒數(shù)[9,16,17]。若有效等位基因數(shù)越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù),則說(shuō)明等位基因在群體中分布越均勻[9,16,17,21]。本研究中,成都麻羊群體平均有效等位基因數(shù)(2.36)低于實(shí)際觀測(cè)到的等位基因數(shù)(7.5),說(shuō)明有些等位基因頻率相對(duì)較高,而另一些相對(duì)較低,等位基因在群體中分布得并不均勻,圖1也具體地展示了這一現(xiàn)象,究其原因應(yīng)該是圈養(yǎng)種群頻繁人工選擇和一定的近親繁殖造成的。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),成都麻羊群體的觀察雜合度和期望雜合度之間差異很小,僅為0.057,這說(shuō)明就目前而言,成都麻羊群體受外來(lái)選擇壓力和近交繁殖等因素的影響還比較小,群體依舊處于遺傳平衡的狀態(tài)

    種群遺傳學(xué)管理的目的是保持種群的遺傳多樣性,避免近親繁殖[30]。如果對(duì)一個(gè)封閉的小種群不采取任何人工干預(yù)措施,最終必將造成近親交配,進(jìn)而引發(fā)近交衰退。鑒于成都麻羊種群的遺傳多樣性還比較高,受近親繁殖等因素影響還較小,具有較高的保種潛力,建議開展全面采樣,借助微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù),完善個(gè)體信息檔案,構(gòu)建起具有完整代表性的成都麻羊種群遺傳譜系關(guān)系。

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