成都麻羊種群微衛(wèi)星標記遺傳多樣性評估

余姣姣, 劉家斌, 徐永濤, 吳永勝, 楊雪, 齊桂蘭*

1. 成都市農(nóng)林科學院 畜牧研究所，四川 成都 611130；

2. 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 610081

成都麻羊，又名四川銅羊，原產(chǎn)于成都平原及附近丘陵地區(qū)，是我國優(yōu)良肉用地方山羊品種[1,2]。成都麻羊具有生長發(fā)育快、體格較大、性早熟、繁殖能力強、屠宰率高、膻味輕、肉質(zhì)嫩、板皮優(yōu)良、肉皮兼用等顯著特點，現(xiàn)有丘陵型和山地型兩個生態(tài)類型[1-3]。在我國，早有引進成都麻羊改良當?shù)厣窖蚺嘤缕贩N的案例，如四川省有名的南江黃羊、金堂黑山羊品種[1-3]。但是，圈養(yǎng)規(guī)模較小、缺乏科學的管理、近親繁殖現(xiàn)象等問題會導致成都麻羊的遺傳變異丟失[4]，引起圈養(yǎng)種群退化，長期會導致遺傳多樣性逐漸喪失，一些特有的重要基因資源會在培育中消失殆盡，同時會造成個體適應能力變?nèi)?，抗病力差，死亡率增加等[5]，長期下來會影響圈養(yǎng)成都麻羊種群的健康發(fā)展。畜禽遺傳資源本質(zhì)上是基因資源，保護畜禽遺傳資源就是保護基因的多樣性[6]。因此，成都麻羊作為我國山羊品種的一個寶貴基因庫，維持其種群遺傳多樣性，最大限度地降低遺傳損失，保證其種群遺傳健康，對其種群種質(zhì)資源的良性發(fā)展和種群的遺傳管理都具有重要意義。

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），是以少數(shù)幾個核苷酸為基本單位進行多次串聯(lián)重復的DNA序列，因而也被稱為簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR）或短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）[6-9]。相比其他的分子標記技術，微衛(wèi)星DNA標記優(yōu)點突出，如呈現(xiàn)共顯性遺傳、高度多態(tài)性等，是目前最為準確、先進的遺傳標記系統(tǒng)之一，是種群遺傳結構研究和多樣性評估最常用的工具[5,7,10-14]。在山羊、綿羊中，利用微衛(wèi)星DNA標記測定遺傳多樣性已有較多相關研究[9,11,15-21]。

鑒于此，為了加強成都麻羊資源的保護和利用，實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)地方山羊品種種質(zhì)資源的良性開發(fā)，滿足市場對成都麻羊的發(fā)展需求，借助微衛(wèi)星DNA作為遺傳標記，對成都麻羊圈養(yǎng)種群進行遺傳多樣性現(xiàn)狀調(diào)查，以期為該資源群體的遺傳背景研究提供分子理論依據(jù)，同時對合理利用成都麻羊資源和可持續(xù)發(fā)展也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究以成都西嶺雪農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司（四川省成都市大邑縣）飼養(yǎng)的成都麻羊為研究對象，共隨機挑選268只個體采集血液樣品，其中雄性個體18只，雌性個體250只。對每只成都麻羊個體進行頸靜脈采血5 mL，隨后用EDTA抗凝混勻，置于冰盒中帶回實驗室，?20 ℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測

本研究采用Tianamp基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取步驟參照使用說明書執(zhí)行。將提取得到的DNA用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并將其保存于?20 ℃冰箱。

參考已發(fā)表文獻[7,9,10,16,17,20,21]，共選46對多態(tài)性微衛(wèi)星引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通過預實驗篩選，有9對引物（見表1）能較穩(wěn)定地擴增得到多態(tài)性較高的微衛(wèi)星位點。PCR擴增體系（20 uL）：DNA模板（濃度25 ng/uL）2 uL，正向引物（濃度10 umol/ul）0.5 uL，反向引物（濃度10 umol/ul）0.5 uL，Mix溶液10 uL，滅菌雙蒸水7 uL。PCR擴增條件：首先95 ℃預變性持續(xù)15 min；之后94 ℃變性持續(xù)30 s，相應退火溫度退火持續(xù)30 s，72 ℃延伸持續(xù)30 s，并設置30個循環(huán)；最后72 ℃終止延伸持續(xù)10 min。每次擴增過程中均設定陰性對照，每個樣品擴增3次。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后拍照。

表 1 本研究所用微衛(wèi)星 DNA 標記Tab. 1 Microsatellite DNA markers were used in this study

1.2.2 基因分型

使用GeneMarker V2.2.0（Demo）軟件，根據(jù)DNA片段大小范圍和峰形質(zhì)量確認等位基因。3個重復試驗分型一致的結果直接錄入數(shù)據(jù)庫，若結果有差異，則需要重新跑PCR甚至重新提取DNA。利用 Excel 2007軟件整理所有樣品對應微衛(wèi)星位點的等位基因型數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用Micro-Checker[22]檢驗每個位點是否存在無效等位基因或等位基因缺失等情況。利用Genepop on the Web[23]和GenAlEx[24]軟件，對每個微衛(wèi)星位點是否偏離哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）和是否存在連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）進行分析。哈迪-溫伯格平衡檢測中，若P>0.05，則符合哈代-溫伯格平衡，說明這個群體是隨機交配群體；若P<0.05，則呈顯著偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài)；若P<0.01，則呈極顯著偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。利用Cervus、GenAlEx、Excel Microsatellite Toolkit統(tǒng)計各個微衛(wèi)星標記位點的等位基因數(shù)（k）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）和多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）[24,25]。當PIC<0.25、0.250.5時，分別表示該座位為低度、中度和高度多態(tài)位點，其中高度多態(tài)位點能夠提供大量的遺傳信息，中度多態(tài)位點可以提供較為合理的信息[10,11,13,20,21,26]。

2 結果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點檢測

本研究篩選得到的9對多態(tài)性微衛(wèi)星位點中，高度多態(tài)標記位點有5對（PIC>0.5），可提供大量的遺傳信息，中度多態(tài)標記位點有3對（0.25

依據(jù)哈代-溫伯格平衡檢測中的P值，9個微衛(wèi)星標記位點中有7個標記位點符合哈代-溫伯格平衡，占77.8%；另外2個標記位點（INRA063和SRCRSP-5）顯著偏離哈代-溫伯格平衡，占22.2%。

依據(jù)連鎖不平衡檢測結果，9個微衛(wèi)星標記位點之間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象（P>0.001），表明所選用的微衛(wèi)星標記位點是相互獨立的遺傳標記系統(tǒng)。

2.2 種群遺傳多樣性分析

排除SR-CRSP-1外之后，使用剩余的8個微衛(wèi)星標記位點對圈養(yǎng)成都麻羊種群進行遺傳多樣性分析，共有60個等位基因被成功檢測，各標記位點的等位基因數(shù)介于5～11之間，平均值為7.5；各標記位點的平均有效等位基因數(shù)為2.36個；各個位點私有等位基因檢測并未發(fā)現(xiàn)其存在；觀察雜合度的變異范圍是0.413～0.770，平均值是0.577；期望雜合度的變異范圍是0.493～0.777，平均值是0.634；多態(tài)信息含量的變異范圍是0.432～0.743，平均值是0.580（見表3）。

表 2 9 個微衛(wèi)星標記位點多態(tài)性檢測結果Tab. 2 Polymorphism detection results of 9 microsatellite markers

表 3 圈養(yǎng)成都麻羊種群遺傳多樣性情況Tab. 3 Genetic diversity of captive Chengdu gray goat population

2.3 微衛(wèi)星標記位點等位基因分布

在8個微衛(wèi)星標記位點中，等位基因較多的前4個是：ILSTS004，共檢測到11個等位基因，大小分 布 在 111～131 bp， 頻 率 范 圍 為 0.0038～0.6000；OarFCB48，共檢測到9個等位基因，大小分布在148～168 bp，頻率范圍為 0.0039～0.3262；SR-CRSP-5，共檢測到8個等位基因，大小分布在168～186 bp，頻率范圍為0.0077～0.5613；OarFCB011，共檢測到8個等位基因，大小分布在133～157 bp，頻率范圍為0.0019～0.4615（見圖 1）。

圖 1 微衛(wèi)星標記位點的等位基因分布Fig. 1 Allele frequency of microsatellite markers

在8個微衛(wèi)星標記位點中，等位基因較少的4個位點是：ILSTS033，共檢測到7個等位基因，大小分布在 148～166 bp，頻率范圍為 0.0057～0.6985；ILSTS030，共檢測到7個等位基因，大小分布在161～175 bp，頻率范圍為 0.0019～0.4775；McM038，共檢測到5個等位基因，大小分布在123～139 bp，頻率范圍為 0.0038～0.6629；INRA063，共檢測到5個等位基因，大小分布在160～168 bp，頻率范圍為 0.0138～0.4685（見圖 1）。

3 討論與結論

遺傳多樣性是一個物種適應環(huán)境變化所必需的條件[7]。種群內(nèi)的遺傳多樣性反映了一個物種的進化潛力，是其遺傳特征進化的基礎[26]。一個物種的遺傳變異越豐富，其對自然選擇和環(huán)境變化的適應能力就越強[6,9,12,27]。遺傳多樣性通常用等位基因多樣性、多態(tài)性、平均雜合度等指標來描述[6,12,16,19]。

在同一微衛(wèi)星位點中，隨著核心重復序列重復次數(shù)的變化，該位點的片段長度也會發(fā)生變化，繼而形成等位基因[11,17]；等位基因是形成群體遺傳多態(tài)性的基礎，等位基因數(shù)越多，遺傳多態(tài)性越豐富[17]。評價位點多態(tài)性高低的指標是多態(tài)信息含量[17]。本研究從9個微衛(wèi)星位點中篩選到5個高度多態(tài)的位點、3個中度多態(tài)性的位點、1個低度多態(tài)性的位點，因此僅有前8個可作為有效的分子標記進行群體遺傳多樣性分析。在后續(xù)的分析中我們使用了這8個中高度多態(tài)的微衛(wèi)星位點分析了268份成都麻羊樣品，最終在這8個位點中一共檢測到的等位基因數(shù)為60個，平均等位基因數(shù)為7.5，與其他綿羊種群相比，要高于甘肅高山細尾羊、灘羊、藏羊等[7]，低于山東省的小尾寒羊、大尾寒羊、山地綿羊、洼地綿羊等[28]，與四川省布拖黑綿羊種群基本持平[10]，但與其他山羊種群相比，要高于山西黎城大青羊、山西呂梁黑山羊、寧夏中衛(wèi)山羊、貴州白山羊、云南威信白山羊等[11,16,19]，低于湖南湘東黑山羊、重慶川東白山羊、云南云嶺山羊、河南黃淮山羊等[11]。不過，這并不能排除種群大小和所用微衛(wèi)星位點數(shù)不同而造成的差異。有研究表明，如果樣本量太少，會導致一些頻率較低的等位基因無法被檢測到，進而對試驗結果的準確性造成影響[9]。本研究使用了8個微衛(wèi)星位點分析了268份成都麻羊樣品，微衛(wèi)星位點數(shù)量屬于平均水平，種群樣本量較大，而個別其他研究的樣本量最少僅有20余份[11,17]，微衛(wèi)星位點數(shù)量最少僅有5個[7,17]。以同一微衛(wèi)星位點而言，種群樣本量越大，其觀察到的等位基因數(shù)往往越多，以微衛(wèi)星位點ILSTS004、OarFCB011和ILSTS030為例，本研究中觀察到的等位基因數(shù)目分別為11、8和7，而在劉成建的研究中（涉及20個樣本量）僅為5和4[17]。此外，在本項研究中，成都麻羊群體中8個微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量的變異范圍是0.432～0.743，平均多態(tài)信息含量0.580，與劉成建的研究結果（0.604）基本一致[17]，表明了成都麻羊群體具有較豐富的遺傳多樣性。

基因雜合度，它反映了群體在幾個位點的遺傳變異情況，是被檢測的遺傳標記的多態(tài)性的度量參數(shù)[10,17]。若某個群體的基因雜合度大于0.5，則意味著該群體還未受到高強度的選擇壓力，其遺傳多樣性比較豐富[10,17]。在本項研究中，成都麻羊群體的平均觀察雜合度和平均期望雜合度分別為0.577和0.634，表明該群體有較豐富的遺傳多樣性，該結果與前述多態(tài)性的分析結果相一致。另外，劉若余等人基于線粒體D-loop序列調(diào)查了中國9個山羊品種的遺傳多樣性，其中成都麻羊的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為 1.0000±0.0243和 0.017956±0.004410，同樣表明其有著豐富的遺傳多樣性[29]。

有效等位基因數(shù)也可以反應群體的遺傳變異大小，在數(shù)值上等于基因純合度的倒數(shù)[9,16,17]。若有效等位基因數(shù)越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，則說明等位基因在群體中分布越均勻[9,16,17,21]。本研究中，成都麻羊群體平均有效等位基因數(shù)（2.36）低于實際觀測到的等位基因數(shù)（7.5），說明有些等位基因頻率相對較高，而另一些相對較低，等位基因在群體中分布得并不均勻，圖1也具體地展示了這一現(xiàn)象，究其原因應該是圈養(yǎng)種群頻繁人工選擇和一定的近親繁殖造成的。研究同時發(fā)現(xiàn)，成都麻羊群體的觀察雜合度和期望雜合度之間差異很小，僅為0.057，這說明就目前而言，成都麻羊群體受外來選擇壓力和近交繁殖等因素的影響還比較小，群體依舊處于遺傳平衡的狀態(tài)

種群遺傳學管理的目的是保持種群的遺傳多樣性，避免近親繁殖[30]。如果對一個封閉的小種群不采取任何人工干預措施，最終必將造成近親交配，進而引發(fā)近交衰退。鑒于成都麻羊種群的遺傳多樣性還比較高，受近親繁殖等因素影響還較小，具有較高的保種潛力，建議開展全面采樣，借助微衛(wèi)星DNA標記技術，完善個體信息檔案，構建起具有完整代表性的成都麻羊種群遺傳譜系關系。