自體富血小板血漿聯(lián)合少陽生骨方治療大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨 缺損的實(shí)驗(yàn)研究

王波，高海明，曹家全，瞿剛波，鄧?yán)颍瑓羌哑?

(1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

0 引言

各種創(chuàng)傷和骨病造成的關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床中常見，因此治療關(guān)節(jié)軟骨缺損是現(xiàn)代骨科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。目前對(duì)于軟骨損傷修復(fù)辦法主要有：組織工程修復(fù)、微骨折術(shù)[1,2]、軟骨細(xì)胞移植術(shù)(autologous chondrocytes implantation，ACI)[3]等。但上述方法對(duì)于修復(fù)較大、較深的軟骨缺損療效尚不理想。隨著血小板濃縮生物的發(fā)展，富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)為治療關(guān)節(jié)軟骨缺損提供新的途徑。富血小板血漿是全血通過離心獲得的含高濃度血小板的血漿成分[4]。PRP 因富含生物活性因子被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和組織修復(fù)領(lǐng)域的臨床和實(shí)驗(yàn)研究[5,7]。目前眾多研究顯示PRP 在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損、促進(jìn)軟骨再生方面具有獨(dú)特作用。近年來，中醫(yī)藥的發(fā)展受到重視，我院使用少陽生骨方治療關(guān)節(jié)軟骨缺損取得較好療效。PRP 與少陽生骨方均能有效治療關(guān)節(jié)軟骨缺損，然而PRP 與少陽生骨方聯(lián)合運(yùn)用是否能進(jìn)一步促進(jìn)缺損關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)目前未見報(bào)道。本研究擬分析PRP 與少陽生骨方聯(lián)合運(yùn)用修復(fù)缺損關(guān)節(jié)軟骨的療效，以期為臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器

4 周齡SD 實(shí)驗(yàn)大鼠20 只，體重(300g±10g)，雌雄各半，均由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

4%多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PBS 磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；無水乙醇(成都科龍化工試劑廠)；二甲苯(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；伊紅染液、蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；檸檬酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；甲苯胺藍(lán)(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)；collagen Ⅰ、collagen Ⅱ (proteintech 公司，美國)。

轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)( 徠卡-2016，德國)；PHY- Ⅲ型病理組織漂烘儀器、TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器有限公司)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics 公司，美國)。

1.2 PRP 制備

采用改良的PCCS kit 法[8]無菌提取PRP，具體過程為：取SD 實(shí)驗(yàn)大鼠眶后靜脈血3.0 mL 加入預(yù)先放置10%構(gòu)椽酸鈉抗凝劑的離心管中，離心3 000 r·min-1，3 min 45 s，吸取上層血漿及血小板，再次離心，3 000 r·min-1，13 min，棄上層清液，將剩余液體與激活劑(凝血酶與10% CaCl 2 的混合物)適當(dāng)比例震蕩，混勻，血凝塊充分收縮后再離心，1 500 r·min-1×15 min，吸取全部上清液即為PRP 液。

1.3 模型建立

各大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天，觀察各大鼠均生存良好，術(shù)前10小時(shí)禁食、禁飲。具體手術(shù)過程：10%聚維酮碘常規(guī)腹部消毒后，以3%戊巴比妥(1mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后大鼠取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，選取右側(cè)膝關(guān)節(jié)以4%硫化鈉脫毛，以10%聚維酮碘消毒右下肢皮膚，鋪巾后進(jìn)行手術(shù)。膝關(guān)節(jié)取伸直位，于髕骨內(nèi)側(cè)依次切開皮膚、皮下組織直達(dá)關(guān)節(jié)囊，分離關(guān)節(jié)囊進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，向外側(cè)翻開髕骨并屈膝，充分暴露股骨滑車，于股骨滑車正中以一2.0mm 克氏針垂直關(guān)節(jié)平面轉(zhuǎn)孔至有落空感為止，邊轉(zhuǎn)邊用生理鹽水沖洗，避免局部熱損傷，反復(fù)沖洗關(guān)節(jié)腔后依次縫合關(guān)節(jié)囊、皮下組織、皮膚，常規(guī)消毒后無菌敷料包扎傷口，術(shù)畢。手術(shù)均由本人及固定助手完成。術(shù)后觀察各大鼠飲水、攝食、活動(dòng)情況，每日常規(guī)傷口換藥，術(shù)后兩周傷口拆線。見圖1。

圖1 制備大鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損模型 a.暴露髕股關(guān)節(jié)；b.造模；c.造模完成后

1.4 少陽生骨方劑量計(jì)算

少陽生骨方由柴胡10g、半夏10g、黨參10g、黃芩6g、骨碎補(bǔ)10g、懷牛膝6g、大棗6g、甘草6g 組成(由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供)，依照參考文獻(xiàn)并以臨床成人有效用藥量，按照Meeh-Ruber 公式，大鼠所需藥物劑量g=人所需藥物劑量g.m-1X 大鼠體表面積(大鼠體表面積=K*W(體重)2/3×10-4)，K 為常數(shù)：小白鼠和大鼠為9.1，豚鼠為9.8，家兔為10，人為10.6，計(jì)算出大鼠給藥劑量作為大鼠與成人的等效劑量，10 倍等效劑量為實(shí)際灌胃量[9]。100g 大鼠少陽生骨方組給藥量為8.5g/d(濃縮至含生藥4g/mL 的藥液，100g 大鼠每天需要量為2.2mL/d)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

將造模成功的20 只大鼠隨機(jī)分為A 組(空白對(duì)照組)、B組(PRP 組)、C 組(少陽生骨方組)、D 組(PRP+少陽生骨方組)，采取不同干預(yù)措施，A 組：不采取干預(yù)措施；B 組：關(guān)節(jié)腔注射PRP；C 組：灌胃少陽生骨方；D 組：關(guān)節(jié)腔注射PRP+灌胃少陽生骨方。

1.6 觀測指標(biāo)

1.6.1 大體標(biāo)本觀察

術(shù)后3 月脫頸處死各組大鼠，取各組實(shí)驗(yàn)大鼠患肢修復(fù)組織，大體觀察缺損處修復(fù)情況，包括修復(fù)組織的色澤、形態(tài)、組織彈性、表面光滑度，觀察修復(fù)處組織的大體形態(tài)及與周圍組織的愈合情況。

1.6.2 HE 染色觀察

術(shù)后3 月脫頸處死各組大鼠，獲取術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨缺損處組織，以10%多聚甲醛固定標(biāo)本24h，EDTA 脫鈣液脫鈣1 周，固定組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，染色后經(jīng)下觀察，采用數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于40 倍下觀察全部組織，觀察大體病變，選擇要觀察區(qū)域采集100 倍和400 倍圖片，觀察具體病變。

1.6.3 甲苯胺藍(lán)染色觀察

標(biāo)本經(jīng)上述固定、脫鈣、包埋切片處理后，將切片置于甲苯胺藍(lán)染色液中染色30 min，然后以蒸餾水反復(fù)漂洗并在冰醋酸中分化數(shù)秒，再用蒸餾水沖洗2 次，冷風(fēng)吹干，乙醇梯度脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察軟骨組織病理變化。

1.6.4 免疫組化檢測Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達(dá)

標(biāo)本經(jīng)上述固定、脫鈣、包埋切片處理后，加入抗體顯色后，采用數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，鏡下觀察Ⅰ膠原、Ⅱ型膠原表達(dá)。

1.6.5 通過平均光密度分析Ⅱ型膠原表達(dá)量

上述所收集圖像采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的光密度(integrated optical density，IOD)和面積，并計(jì)算出3 張圖像的平均光密度，通過平均光密度分析Ⅱ型膠原表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以Levene 法行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-α 法；檢驗(yàn)水α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察

術(shù)后第3 月脫頸處死各組大鼠，大體觀察缺損軟骨修復(fù)情況。A 組缺損面清晰可見，缺損處見少量淡黃色組織填充，缺損表面不整齊，與周圍軟骨組織界限明顯；B 組軟骨缺損處可見半透明樣組織軟組填充，缺損未完全填滿，缺損處表面較光滑，與周圍軟骨組織界限較明顯；C 組軟骨缺損處可見半透明樣組織填充，缺損未完全填滿，缺損處表面較粗糙，與周圍軟骨組織界限較清晰；D 組軟骨缺損處可見近透明樣組織填充，缺損近填滿，缺損處表面光滑，與周圍軟骨組織界限較模糊。見圖2。

2.2 HE 染色觀察

HE 染色示，A 組修復(fù)組織內(nèi)軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂；B、C 組軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，排列較紊亂，軟骨表層較粗糙；D 組軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，可見軟骨陷窩，排列緊密，軟骨表面較光滑。見圖3。

2.3 甲苯胺藍(lán)染色觀察

甲苯胺藍(lán)染色示，A 組未見明顯正常關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)分泌；B組見細(xì)胞內(nèi)有少量紫色異染顆粒存在，有正常軟骨基質(zhì)分泌；C組見細(xì)胞內(nèi)有少量紫色異染顆粒存在，細(xì)胞周圍少量正常軟骨基質(zhì)分泌；D 組見細(xì)胞內(nèi)有大量紫色異染顆粒，近正常軟骨基質(zhì)分泌，接近正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。見圖4。

圖2 術(shù)后3 月各組大體標(biāo)本觀察，箭頭所示為缺損處修復(fù)情況a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

圖3 術(shù)后3 月各組HE 染色觀察(×400) a. A 組；b .B 組；c. C 組；d. D 組

圖4 術(shù)后3 月各組甲苯胺藍(lán)染色觀察(×400) a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

圖5 術(shù)后3 月各組免疫組化染色觀察Ⅰ型膠原(×400) a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

圖6 術(shù)后3 月各組免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原(×400) a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組

2.4 免疫組化觀察Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達(dá)

Ⅰ型膠原檢測示，A 組見少量Ⅰ型膠原表達(dá)，B、C、D 組未見明顯Ⅰ型膠原表達(dá)。Ⅱ型膠原檢測示，A 組軟骨修復(fù)組織中Ⅱ型膠原少量表達(dá)；B 組、C 組軟骨修復(fù)組織中可見較多Ⅱ型膠原表達(dá)；D 組軟骨修復(fù)組織中細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外Ⅱ膠原表達(dá)明顯增加，出現(xiàn)黃褐色或棕黃色顆粒，修復(fù)組織中細(xì)胞同周圍軟骨及軟骨結(jié)合良好。見圖5、圖6。

2.5 通過平均光密度分析Ⅱ型膠原表達(dá)量

D 組Ⅱ型膠原表達(dá)量高于A 組、B 組、C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；A 組Ⅱ型膠原表達(dá)量低于B 組、C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B 組、C 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 Ⅱ型膠原表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果( ±sD)

表1 Ⅱ型膠原表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果( ±sD)

注：a：以A 組為對(duì)照組，P＜0.05；b；以B 組為對(duì)照組，P＜0.05；c 以C 組為對(duì)照組，P＜0.05。

組別 N(只) MOD(images/BZ_15_1128_1554_1154_1582.png ±sD)A 組 3 0.2469±0.0048 B 組 3 0.2566±0.0058a C 組 3 0.2597±0.0035a D 組 3 0.2761±0.0055abc F 值 14.004 P 值 0.002

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)活動(dòng)中起重要作用，其表面光滑，能減少相鄰兩骨的摩擦，緩沖運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的震動(dòng)[10]。關(guān)節(jié)軟骨為透明軟骨，是一種無血管、淋巴及神經(jīng)分布的結(jié)締組織，其由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)組成，二者相互依存，相互作用。其中細(xì)胞基質(zhì)由水、膠原和蛋白多糖組成，水占軟骨容量的65%-80%[11]，三者使關(guān)節(jié)面具有抗變形能力和剛性。膠原是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分和張力的決定性因素[12,13]。正常人關(guān)節(jié)軟骨中有Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ型5 種膠原，它們共同組成的軟骨內(nèi)纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)[14]，約占關(guān)節(jié)濕重的30%。其中Ⅱ型膠原是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的主要成分，約占90%-95%。通常以3 條Ⅱ型膠原纖維構(gòu)成螺旋分子，排列規(guī)則[15]。

PRP 中富含高濃度的血小板，多種生長因子與纖維蛋白原[16]，PRP 所含的各種生長因子相互作用，可與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞的信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生傷口愈合所需的各種蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、調(diào)整細(xì)胞排列形態(tài)，促進(jìn)骨樣組織及膠原合成[17]。而纖維蛋白原在凝血酶作用下可緩慢聚合，釋放出內(nèi)部生長因子，有利于發(fā)揮生長因子間的協(xié)同作用，增進(jìn)組織修復(fù)效果。PRP 通過活化后釋放的各種生物活性因子和血漿中的各種蛋白發(fā)揮促進(jìn)損傷關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用，如能夠刺激軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等骨軟骨前體細(xì)胞遷移、增殖、向軟骨分化和分泌軟骨細(xì)胞基質(zhì)，抑制損傷部位炎癥反應(yīng)，刺激滑膜細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸和關(guān)節(jié)滑液，形成凝膠為損傷部位提供早期修復(fù)并為前體細(xì)胞創(chuàng)造增殖、分化的三維環(huán)境等[18]。PRP 治療關(guān)節(jié)軟骨缺損已運(yùn)用于臨床，但對(duì)于較大、較深的關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)效果尚不理想。

隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，我院運(yùn)用少陽生骨方治療關(guān)節(jié)軟骨缺損取得了較好療效。祖國醫(yī)學(xué)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中明確提出“少陽主骨”的觀點(diǎn)，《素問·熱論》云：“少陽主骨”，《靈樞·經(jīng)脈》記載”足少陽之脈主骨所生病”?！吧訇柹欠健币浴靶〔窈鷾奔訙p而成，方組由柴胡、半夏、黨參、黃芩、骨碎補(bǔ)、懷牛膝、大棗、甘草組成，以小柴胡湯為基礎(chǔ)可和解少陽，通利膽經(jīng)，消除痹痛，同時(shí)輔以骨碎補(bǔ)、懷牛膝補(bǔ)益肝而達(dá)到和補(bǔ)共用作用。研究表明少陽生骨方能調(diào)節(jié)大鼠軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶13 的m RNA 和蛋白的表達(dá)水平、可顯著降低關(guān)節(jié)液中導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷的炎性介質(zhì)IL-1β 水平，提高軟骨損傷后修復(fù)組織中Ⅱ型膠原的表達(dá)，從而有助于軟骨損傷的修復(fù)[19,20]。此外少陽生骨方能促進(jìn)去分化軟骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)SD 大鼠在體軟骨損傷后軟骨的修復(fù)，且修復(fù)組織更接近透明軟骨[21,22]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示PRP 與少陽生骨方聯(lián)合運(yùn)用組對(duì)想缺損關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效果明顯優(yōu)于PRP、少陽生骨方單獨(dú)應(yīng)用組，在一定程度上佐證了PRP 與少陽生骨方聯(lián)合運(yùn)用會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)缺損關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)。我們認(rèn)為其機(jī)制可能為PRP 與少陽生骨方對(duì)缺損關(guān)節(jié)軟骨組織的修復(fù)作用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。本研究在實(shí)驗(yàn)指標(biāo)上選擇Ⅰ型膠原Ⅱ型膠原來確定膠原表達(dá)的類型來說明療效，因?yàn)棰蛐湍z原是關(guān)節(jié)軟骨的正常表型。本研究結(jié)果顯示各組修復(fù)組織中未見明顯Ⅰ型膠原表達(dá)，PRP 與少陽生骨方聯(lián)合運(yùn)用組Ⅱ型膠原表達(dá)量明顯高于其他組，證實(shí)了修復(fù)組織為軟骨組織而不是瘢痕組織，且PRP與少陽生骨方聯(lián)合運(yùn)用組修復(fù)效果優(yōu)于其他各組。但值得注意的是，中藥復(fù)方具有多成分，代謝多途徑，作用多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，其藥理作用是每個(gè)有效成分的疊加、協(xié)同或互補(bǔ)。

綜上述，PRP 與少陽生骨方聯(lián)合運(yùn)用能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)缺損關(guān)節(jié)軟骨組織的修復(fù)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。

作者貢獻(xiàn)：王波直接參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計(jì)分析，文章撰寫；高海明直接參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施及數(shù)據(jù)收集；曹家全直接參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施、材料購買；瞿剛波參與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；鄧?yán)騾⑴c數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；吳佳奇設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱。

利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)支持沒有影響文章觀點(diǎn)和對(duì)研究數(shù)據(jù)客觀結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析及報(bào)道。

機(jī)構(gòu)倫理問題：本研究方案獲西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020-071)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2013-065。