不同工藝對(duì)黃芩總黃酮提取率及其提取物性能的影響

朱溶月， 陳 媛， 李博莉， 解 甜， 王文蘋

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是由一定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體組成的，熔點(diǎn)顯著低于其純組分的二元或多元混合物[1]。DES 被稱為“離子液體類似物”，但比離子液體性能更優(yōu)越，不僅合成方法簡(jiǎn)單，且低毒、價(jià)廉、生物相容性較佳。因此近年來(lái)DES 常作為新型“綠色溶劑”用于分離、合成、功能材料和電化學(xué)領(lǐng)域[2]，而其用于中藥有效成分提取和分離的研究正在興起[3]。

黃芩屬于常用大宗中藥材之一，其有效成分主要是以黃芩苷為代表的黃酮類成分，但這類成分水溶性差，因此，目前多采用乙醇回流提取[4]。黃芩提取物中黃酮類成分通常溶出緩慢、口服生物利用度較低[5]，對(duì)制劑研究提出了較高要求。本文采用最常見(jiàn)的DES 體系——氯化膽堿和乳酸提取黃芩黃酮類成分，并利用反溶劑沉淀法在分離溶劑的同時(shí)獲得提取物微粉，以期達(dá)到提高提取效率、改善提取物制劑特性的雙重目的。

1 試劑與儀器

1.1 試劑與藥品

黃芩飲片（1712151，寧夏明德中藥有限公司，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院教授鑒定）、黃芩苷（98%，141208，南京景竹生物科技有限公司）、氯化膽堿（20140810，上海瑞永生物科技有限公司）。二縮三乙二醇、十二烷基硫酸鈉、甘露醇、羥丙基甲基纖維素、泊洛沙姆188、聚乙烯吡咯酮、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純，所用水為純化水。

1.2 儀器

FW135 中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市矛華儀器有限責(zé)任公司）、756PC 紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、Nano ZS90激光粒度儀（英國(guó)）、LSRH500 高速剪切機(jī)（常州勵(lì)岸寶機(jī)械設(shè)備科技有限公司）、FD-1C 冷凍干燥機(jī)（北京德天佑科技發(fā)展有限公司）、C715RE 臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)（日本日立）、RCZ-8M 自動(dòng)取樣溶出儀（天津市天大天發(fā)科技）、THZ-100 恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科技儀器有限公司）、PL203 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、YS100 顯微鏡（南京凱爾儀器有限公司）、Milli-Q 型超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 黃芩總黃酮的含量測(cè)定

以蘆丁為對(duì)照品，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH為顯色體系，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法于510 nm處測(cè)定吸光度，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.0133C～0.0207（r2=0.9989）計(jì)算濃度及含量[6]。

2.2 黃芩提取液的制備

2.2.1 DES 溫浸提取 將黃芩飲片粉碎過(guò)80 目篩，稱取50 g 黃芩粉末，加入500 mL 含20%水的DES（氯化膽堿與乳酸摩爾質(zhì)量比為1∶2）[7]，70 ℃水浴恒溫?cái)嚢?0 min 后，經(jīng)高速離心（12000 r·min-1，10 min），取上清液備用。

2.2.2 乙醇回流提取 取黃芩粉末10 g，加65%乙醇170 mL，70 ℃加熱回流2 h[8]，提取液高速離心（12000 r·min-1，10 min），取上清液保存?zhèn)溆?。采?.1 方法測(cè)定提取液中總黃酮含量，提取液呈棕黃色且DES 所得提取液色澤較深，DES溫浸和乙醇回流法測(cè)定計(jì)算得黃芩總黃酮提取率分別為（12.64±0.86）mg·g-1和（0.19±0.07）mg·g-1，二者相差約67 倍，表明DES 溫浸法對(duì)黃芩總黃酮提取效率優(yōu)于乙醇回流法。見(jiàn)圖1。

圖1 不同方法所得黃芩提取液的外觀及總黃酮提取率

2.3 黃芩提取物納米混懸液及凍干粉的制備

采用反溶劑沉淀法，取10 mL 上述提取液，在高速剪切條件下（12000 r·min-1）加至100 mL 的HPMC 水溶液（5.3 mg·mL-1）中并持續(xù)剪切2 min，得到納米混懸液；高速離心（8000 r·min-1，5 min）后取沉淀，加少量水洗滌2 次，再加入適量水混懸，添加乳糖（5%，w/v）作為凍干保護(hù)劑混勻；先置于-80 ℃冰箱中預(yù)凍6 h，再經(jīng)冷凍干燥48 h得凍干粉，密封保存?zhèn)溆?。所得混懸液及凍干粉外觀均勻，其中DES 溫浸法所得樣品色黃，而乙醇回流法所得樣品色較淺。見(jiàn)圖2。

2.4 黃芩提取物凍干粉的初步評(píng)價(jià)

2.4.1 平均粒徑與粒徑分布 凍干粉（10 mg·mL-1）加適量水分散后，直接采用激光粒度儀分別測(cè)定樣品混懸液平均粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）。經(jīng)t 檢驗(yàn)，乙醇回流提取物制得混懸液的平均粒徑遠(yuǎn)低于DES 溫浸法（P 均＜0.05）。凍干粉復(fù)溶后平均粒徑和PDI 值較混懸液均增大（P 均＜0.05），但粉體平均粒徑仍小于1 μm。見(jiàn)表1。

圖2 不同方法制備黃芩提取物納米混懸液及凍干粉外觀

2.4.2 總黃酮含量 采用2.1 方法，分別取兩種提取物凍干粉10 mg 加30 mL 水復(fù)溶并測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果DES 溫浸法和乙醇回流法所得樣品中總黃酮含量分別為（8.97±0.55）mg·g-1和（0.69±0.07）mg·g-1。

2.4.3 總黃酮飽和溶解度 分別稱取過(guò)量黃芩苷原料藥、黃芩提取物凍干粉置5 mL 離心管中，加水3 mL，在37 ℃、100 r·min-1條件下連續(xù)振蕩72 h，立即取出并高速離心（12000 r·min-1，5 min），取上清液加水適當(dāng)稀釋，采用2.1 方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算飽和溶解度。兩種提取物凍干粉中總黃酮溶解度均優(yōu)于黃芩苷原料藥（P 均＜0.05），乙醇回流提取物高于DES 提取物（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

表1 黃芩提取物納米混懸液及其凍干粉的粒徑測(cè)定（±s）

表1 黃芩提取物納米混懸液及其凍干粉的粒徑測(cè)定（±s）

與同液體乙醇回流法比較*P＜0.05，**P＜0.01；與同方法混懸液比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

提取物制法 n 混懸液 凍干粉（復(fù)溶后）平均粒徑/nm PDI 平均粒徑/nm PDI DES 溫浸 3 421.77±22.11** 0.32±0.04* 950.17±46.75*▲▲ 0.54±0.01▲乙醇回流 3 53.91±0.34 0.16±0.01 486.27±55.80▲▲ 0.59±0.04▲▲?

圖3 黃芩苷及黃芩提取物凍干粉的飽和溶解度（n=3）

2.4.4 總黃酮體外溶出度 采用槳法進(jìn)行體外溶出度實(shí)驗(yàn)，分別稱取0.05 g 凍干粉及黃芩苷原料藥，加500 mL 水作為溶出介質(zhì)，固定攪拌漿轉(zhuǎn)速為100 r·min-1、溫度為37 ℃。分別在1、3、5、10、20、30、45、60、90、120 min 取樣2.5 mL，迅速補(bǔ)充等量溫水，樣液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，采用2.1 方法測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算累積溶出度。如圖4 所示，黃芩苷原料藥2 h 時(shí)的累積溶出度不足30%；而兩種凍干粉中總黃酮?jiǎng)t立即溶出超過(guò)50%，且在45 min 時(shí)累積溶出達(dá)90%以上。

圖4 黃芩苷原料及黃芩提取物凍干粉中總黃酮的體外溶出曲線

3 討論與結(jié)論

本文分別采用DES 溫浸和乙醇回流兩種方法提取黃芩中的總黃酮類成分，可觀察到所得提取液的外觀色澤差異顯著，并與總黃酮含量測(cè)定結(jié)果直接相關(guān)。由于提取物粒徑較小，屬亞微米級(jí)，因此兩種黃芩提取物中總黃酮的溶解度均顯著提高[9]。本文研究發(fā)現(xiàn)，乙醇提取物的溶解度稍高于DES 提取物，原因可能與其粒徑顯著較小有關(guān)。此外，兩種凍干粉的體外溶出行為差異很小，但兩種凍干粉中有效成分的溶出均優(yōu)于黃芩苷原料藥，這與凍干粉粒徑小、有效成分溶解度高的特性直接相關(guān)[10]。

DES 可分為親水性和疏水性兩類[11]，目前常見(jiàn)的是以季銨鹽（如氯化膽堿）和羧酸（如乳酸）為代表的親水性DES，這類DES 能與水混溶、合成工藝簡(jiǎn)便、生物相容性好，有利于對(duì)所得提取液進(jìn)行后繼處理?，F(xiàn)有研究[12-13]顯示，將親水性DES 用于提取植物中的黃酮、皂苷、多糖、蛋白質(zhì)等多種成分，與傳統(tǒng)水、乙醇等溶劑相比，其有效成分提取率顯著提高。

黃芩中黃酮類成分的提取以水煎煮和乙醇（60%～70%）回流提取為主，間或輔以超聲、微波、紅外、酶解等技術(shù)改善提取效率[14-15]；其分離則以大孔吸附樹(shù)脂為主。李婷婷[7]以含水20%的氯化膽堿-乳酸（摩爾比1∶2）為溶劑，采用微波輔助提取黃芩中的4 種主要黃酮成分，并進(jìn)一步通過(guò)ME-2 大孔樹(shù)脂進(jìn)行富集。本文借鑒其優(yōu)化后的提取工藝條件，并進(jìn)一步將所得提取液直接與水混合，使得DES 與水混溶的同時(shí)難溶性黃酮類有效成分析出沉淀。DES 不僅提取效率優(yōu)于傳統(tǒng)乙醇回流工藝，且所得提取物粉末溶解、溶出性能均較佳，有利于進(jìn)一步制劑加工。

綜上所述，本研究采用DES 提取黃芩總黃酮并進(jìn)一步經(jīng)反溶劑沉淀法和冷凍干燥法制得黃芩提取物混懸液及其凍干粉，其粒徑小且較均勻。不僅提高了總黃酮提取率，也提高了在水中的飽和溶解度和溶出性能，優(yōu)于傳統(tǒng)乙醇回流工藝。所得提取物可作為制劑中間體，便于進(jìn)一步成型。本文為新型綠色溶劑用于中藥提取物的創(chuàng)新研究提供參考。