周期素依賴性激酶10 在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義

冶正財， 游顏杰， 呼圣娟，

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬自治區(qū)人民醫(yī)院暨第三臨床學(xué)院，銀川 750002； 2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，銀川 750002）

我國是食管鱗狀上皮細(xì)胞癌（簡稱食管鱗癌）的高發(fā)國家之一，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致食管鱗癌臨床治療失敗和患者死亡的最主要原因。深入研究食管鱗癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制，將為開發(fā)臨床診斷的分子標(biāo)志物、確定臨床治療的藥物靶點以及制訂有效的臨床治療方案提供理論和實驗依據(jù)[1]。細(xì)胞周期素依賴性激酶10（cyclin-dependent kinase 10，CDK10）是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族成員[2-4]。研究[2-7]表明，CDK10 受到諸多信號通路的精細(xì)調(diào)控，可能在不同來源惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮不同的功能與作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測CDK10 蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)狀態(tài)，旨在探討其與臨床病理因素和患者生存期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

食管鱗癌組織石蠟包埋標(biāo)本組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，包含2007 年7 月—2010 年12 月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的208 例原發(fā)食管鱗癌組織，樣本來源于上海市腫瘤疾病研究所。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer）TNM 分期：Ⅰ期20 例，Ⅱ期83 例，Ⅲ期70 例，Ⅵ期25 例（10 例缺失）；病理分級：Ⅰ期34 例，Ⅱ期135 例，Ⅲ期39 例?；颊咝g(shù)前未接受任何放化療和生物治療。對于所有患者資料進(jìn)行電話生存隨訪截止到2017 年7 月，其中死亡患者149 例。

1.2 主要試劑

兔抗人CDK10 多克隆抗體購自Abcam 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記通用性EnVision試劑盒購自上海長島生物技術(shù)有限公司，DAB 試劑購自中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

石蠟包埋標(biāo)本經(jīng)4 μm 厚度切片，0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)。按EnVision 二步法說明書進(jìn)行染色，CDK10 抗體工作濃度為1∶200，DAB 顯色，蘇木素對比染色，透明封固，PBS 代替一抗作為空白對照。

1.4 結(jié)果判定

CDK10 表達(dá)狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)[5]：以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的黃色至棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞信號。采用2 個參數(shù)（即染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)）記分乘積的半定量計分方法。著色強度記分標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。隨機選取10 個高倍視野（×400）計數(shù)腫瘤細(xì)胞的陽性百分率，記分標(biāo)準(zhǔn)：無染色為0 分，1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。染色強度記分與陽性細(xì)胞數(shù)記分之積為最后得分，＜3 分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-rank 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床病理參數(shù)的食管鱗癌組織中CDK10表達(dá)比較

食管鱗癌組織中CDK10 蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核（圖1）。208 例臨床樣本中，54例呈低表達(dá)（26.0 %），154 例呈高表達(dá)（74.0 %）。食管鱗癌組織中CDK10 表達(dá)在臨床TNM 分期III/IV 期高于I/II 期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N1～N3）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N0），T3/T4 組高于T1/T2 組，男性患者組高于女性患者組（P 均＜0.05）。不同年齡、組織學(xué)分級、P53 和Ki67 表達(dá)狀態(tài)下，CDK10 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）。見表1。

圖1 食管鱗癌組織中CDK10 的表達(dá)（EnVision ×200）

2.2 CDK10 表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后參數(shù)的關(guān)系

Kaplan-Meier 法分析食管鱗癌組織中CDK10表達(dá)與患者總生存期之間的關(guān)系。食管鱗癌組織中CDK10 高表達(dá)的患者［中位生存時間為（31.3±2.7）個月］總生存期低于CDK10 低表達(dá)的患者［中位生存時間為（69.5±63.1）個月）］（P＜0.001）。見圖2。

3 討論

選擇特異性的腫瘤分子標(biāo)志物，并以此建立靈敏高效的檢測方法成為乳腺癌轉(zhuǎn)移臨床診斷、預(yù)后評估與指導(dǎo)合理用藥的迫切要求。已有研究[6-7]表明在雌激素受體（estrogen receptor，ER）存在的情況下，CDK10 表達(dá)缺失增強乳腺癌細(xì)胞對選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫西芬的藥物抵抗性。在肝癌和膽管癌中的研究[2，8]發(fā)現(xiàn)，CDK10在多種惡性腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)或缺失。此外，相關(guān)研究[9]證實乳腺癌中CDK10同C1orf63 二者呈正相關(guān)關(guān)系，而C1orf63 是一種參與細(xì)胞周期退出的細(xì)胞靜態(tài)控制基因（cellular quiescence-controlling gene），二者表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)。功能試驗證實miR-3127-5p 可通過抑制CDK10 表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移與侵襲[10]。近期在乳腺癌和卵巢癌中的研究[11-12]證實，啟動子高頻甲基化可能是造成CDK10 基因失活的重要原因之一。上述既往研究表明CDK10 在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)或缺失，可能是新的候選抑癌基因，然而對于CDK10 基因表達(dá)在食管鱗癌中的研究目前未有相關(guān)報道。

表1 不同臨床病理參數(shù)的食管鱗癌組織中CDK10 表達(dá)比較

圖2 食管鱗癌組織中不同CDK10 表達(dá)患者生存曲線的比較

本研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中CDK10 表達(dá)在臨床TNM 分期III/IV 期高于I/II 期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N1～N3）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N0），T3/T4 組高于T1/T2 組，男性患者組高于女性患者組。據(jù)此推測CDK10 高表達(dá)可能是促進(jìn)食管鱗癌發(fā)展的重要分子事件。結(jié)合患者預(yù)后資料進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CDK10 高表達(dá)患者總生存期低于低表達(dá)者。上述結(jié)果提示在食管鱗癌進(jìn)展中CDK10可能發(fā)揮類似于癌基因的作用，這有別于以往在其他類型腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)CDK10 所呈現(xiàn)的抑癌基因功能[2，4-5，7-10，13-14]。本課題組前期研究[5，13-14]中應(yīng)用免疫組化對CDK10 蛋白在乳腺癌和胃癌組織中的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)CDK10表達(dá)缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和患者總生存期密切相關(guān)，CDK10 表達(dá)可作為患者預(yù)后評判的獨立指標(biāo)。目前，對于CDK10 在不同種類惡性腫瘤中發(fā)揮差異性作用的具體機制鮮有相關(guān)報道。這種差異性可能同CDK10 作為主導(dǎo)基因在細(xì)胞周期進(jìn)程中受到諸多信號通路的精細(xì)控制，調(diào)節(jié)眾多從屬基因協(xié)調(diào)表達(dá)從而在不同組織來源的腫瘤中產(chǎn)生不同的功能有關(guān)。此外，不同的腫瘤微環(huán)境也可能是造成CDK10 表現(xiàn)差異性的原因之一。今后，擴大臨床檢測樣本量、進(jìn)行細(xì)胞與動物實驗和分子機制檢測是深入研究CDK10 在食管鱗癌中具體作用的方向。明確CDK10 與食管鱗癌臨床病理和預(yù)后因素的關(guān)系，不僅有助于改善食管鱗癌臨床診斷的準(zhǔn)確性，而且可提供更為敏感高效的食管鱗癌預(yù)后評價指標(biāo)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生為患者制訂更加完善的個體化治療方案，提高食管鱗癌的整體治療水平。