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    基于水溶性硅量子點的氯化血紅素熒光檢測新方法

    2021-03-05 09:40:56李文靜許惠鳳胡燕霞楊桂娣
    分析科學學報 2021年1期
    關鍵詞:血紅素水溶性光譜

    李文靜, 許惠鳳, 詹 妍, 胡燕霞, 朱 希*, 楊桂娣

    (1.福建農(nóng)林大學生命科學學院,福建福州 350002;2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室,福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建福州 350002)

    血紅素(Hemin)是一種由卟啉和Fe(Ⅱ)結(jié)合形成的鐵卟啉類化合物,存在于高等動物的血液和肌肉中,在氧氣轉(zhuǎn)運過程中起到關鍵作用[1]。在藥學領域,血紅素除了能夠作為制備抗癌和半合成膽紅素藥物的原料,還在抗瘧疾中起著重要作用[2]。然而,過量的血紅素能嵌入脂膜,催化生成 ·OH,破壞細胞膜,從而造成細胞溶解和死亡[3,4]。因此,血紅素的定量檢測對于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)、環(huán)境科學、生物科學等領域具有非常重要的意義。

    血紅素的常用檢測方法有電泳法[5]、高效液相色譜法[6]和火焰原子吸收法[7]等方法。這些方法需要昂貴的儀器,專業(yè)培訓的實驗人員,以及復雜的日常維護過程,很大程度上限制了在血紅素檢測中的應用。血紅素在波長400 nm附近具有較強的吸收峰,可采用簡便且低成本的分光光度法對其進行直接檢測[8],然而該方法因抗干擾能力相對較差,且靈敏度較低,在復雜樣品的檢測應用受到一定限制。熒光分析法具有操作簡單、靈敏度高和選擇性好等特點,這些優(yōu)點極大拓展了它在分析領域的應用。Guan等人[9]利用肝素和巰基丙酸修飾的硫化鎘量子點作為熒光探針,實現(xiàn)對血紅素的免標記熒光檢測。Kang等人[10]提出了一種基于原卟啉Ⅸ與G -四聯(lián)體體系的熒光方法對血紅素進行檢測。但這些方法或用到了具有一定毒性的硫化鎘量子點,或需要繁雜的實驗過程。因此,設計一種安全無毒,簡便、穩(wěn)定、靈敏度高、可靠的新方法用于檢測血紅素勢在必行。

    硅量子點(SiQDs)是一種零維納米材料。與Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族的半導體量子點相比,SiQDs不僅有著優(yōu)異的光學性能,還具備環(huán)境友好、低合成成本、無細胞毒性和高生物相容性等優(yōu)點[11,12]。為了得到水溶性較好的SiQDs,研究者通常需要采用兩步法進行制備:首先,通過“top-down”的過程得到疏水性SiQDs,然后再通過表面功能化的過程得到水溶性SiQDs。盡管這種方法能得到水溶性較好的SiQDs,但它需要繁瑣的操作過程。近年來,研究人員以3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)等作為硅源[13],在還原劑存在下,采用水熱合成方法合成了具有高親水性的水溶性SiQDs。這些水溶性SiQDs在金屬離子和生物小分子檢測領域有著巨大應用前景[14-18]。本研究以APTMS為硅源,檸檬酸三鈉為還原劑,采用水熱法合成了水溶性良好和高熒光活性的水溶性SiQDs。利用血紅素與SiQDs間的內(nèi)濾作用,構(gòu)建一種簡便快速的熒光方法實現(xiàn)對血紅素的檢測。本方法與現(xiàn)有的檢測手段相比具有簡便快速、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    Cary Eclipse熒光分光光度計(美國,瓦里安公司);UV1750紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);FEI Tecnai G2 F20透射電子顯微鏡(美國,F(xiàn)EI公司);F4500穩(wěn)定/瞬間熒光光譜儀(英國,愛丁堡公司);KQ300DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);pHS-3C pH計(上海越平科學儀器有限公司)。實驗所需光學測量均在室內(nèi)環(huán)境溫度條件下操作。實驗所需熒光測量均在統(tǒng)一的石英比色皿中操作。

    3-氨丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)購自Sigma公司;檸檬酸三鈉、氯化血紅素、甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸、酪氨酸、葡萄糖、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4,均購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗所需用水均為Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化的超純水。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 水溶性SiQDs的合成參照文獻方法[12]并進行適當修改,具體步驟如下:準確稱取1.1038 g檸檬酸三鈉,吸取5 mL APTMS,將上述兩種試劑加入10 mL 水中攪拌混勻,并將所得溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應釜中,于160 ℃下反應2 h。再將反應得到的均勻透明的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(1 kDa)中透析48 h,除去雜質(zhì)。最后把溶液收集存儲于4 ℃冰箱中作為儲備溶液。另取1 mL溶液凍干后稱重,計算出SiQDs母液的濃度為3 mg/mL。使用硫酸奎寧(QY=54%)作為參比標準品,在0.5 mol/L的H2SO4中測得該SiQDs 的量子產(chǎn)率為28.7%。

    1.2.2 光譜測試實驗過程中,紫外吸收曲線通過紫外-可見分光光度計檢測。熒光光譜圖通過熒光光度計掃描得到,熒光的激發(fā)波長為350 nm,發(fā)射波長范圍為380~600 nm。

    1.2.3 血紅素對SiQDs的熒光響應取4 μL上述SiQDs母液,加入290 μL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.0),得到最終濃度為0.04 mg/mL的SiQDs溶液。移取6 μL不同濃度的血紅素溶液,分別加入到上述SiQDs溶液中,靜置5 min后進行熒光測定。

    1.2.4 干擾實驗6 μL 1 mmol/L的血紅素和6 μL 10 mmol/L的干擾物質(zhì)(組氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、葡萄糖),分別加入到“1.2.3”所制備的SiQDs溶液中,靜置5 min后進行熒光測定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 SiQDs的合成及表征

    實驗首先對所合成的SiQDs進行透射電鏡(TEM)及熒光光譜表征。從圖1(A)中看出,SiQDs表現(xiàn)為規(guī)整的類球形,且分布均勻,平均粒徑2.0 nm。從熒光光譜圖(圖1(B))可以看出,合成的水溶性SiQDs的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別在350 nm和441 nm附近。制備的SiQDs在日光下是無色透明的均相溶液,在365 nm的紫外燈下則呈現(xiàn)明亮的藍色熒光(圖1(B)插圖)。這些結(jié)果與之前文獻報道[12]一致,表明本實驗成功制備出了水溶性熒光SiQDs。

    圖1 (A) SiQDs的透射電鏡(TEM)圖;(B) SiQDs熒光光譜圖(紅色曲線為激發(fā)光譜,黑色曲線為發(fā)射光譜,插圖為SiQDs在日光下(a)和紫外燈下(b)照片)Fig.1 (A) TEM image of SiQDs;(B) Fluorescence spectra of SiQDs(excitation(red) and emission(black) spectrum of SiQDs,inset:the photograph of SiQDs under daylight(a) and UV lamp(b))

    圖2 SiQDs加入血紅素前(a)后(b)的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of SiQDs in the absence (a) and presence (b) of hemin

    2.2 血紅素對SiQDs的熒光信號影響

    圖2是加入血紅素前后SiQDs的熒光光譜圖。從圖可以看出,加入血紅素后SiQDs的熒光信號明顯下降,以空白SiQDs的熒光值作為F0,加入血紅素的熒光值作為F,計算血紅素對SiQDs的熒光猝滅率為81.7%。另外,加入血紅素前后SiQDs的熒光峰的峰形沒有變化,最大激發(fā)波長出現(xiàn)了稍微的紅移,這可能是由于血紅素加入后引起SiQDs晶型結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起的。

    本實驗進一步考察了血紅素猝滅SiQDs熒光的可能機理。首先,通過熒光壽命實驗(圖3(A))發(fā)現(xiàn),加入血紅素后的SiQDs的熒光壽命與未加入血紅素時SiQDs的熒光壽命相比,基本沒有變化。另外,通過紫外-可見吸收光譜(圖3(B)),可以看出血紅素的強吸收范圍在波長300~450 nm(曲線a),這與SiQDs的紫外吸收范圍(曲線b)重疊,同時也覆蓋了SiQDs的最大發(fā)射波長。這些結(jié)論表明,血紅素對SiQDs的熒光抑制主要由于內(nèi)濾作用所引起。

    圖3 (A) 加入血紅素前后SiQDs的熒光壽命對比圖;(B) 血紅素(a)和SiQDs(b)的紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 (A) Fluorescence lifetime of SiQDs;(B) UV-Vis absorption spectra of hemin(a) and SiQDs(b)

    2.3 實驗條件優(yōu)化

    2.3.1 緩沖溶液pH本實驗分別選定pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.4、8.0和9.0來考察SiQDs的熒光信號變化情況。在圖4中,SiQDs的熒光信號隨著pH的增大先上升而后下降,在pH為7.4的時候達到最大值,并且pH為7.4是人體生理pH值,故選定pH=7.4作為該實驗體系的pH值。

    2.3.2 血紅素與SiQDs反應時間實驗考察了不同反應時間下熒光強度的變化情況,結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出,在5 min內(nèi)反應體系的熒光強度逐漸降低。當反應時間超過5 min,熒光強度幾乎不再降低,因此該體系最佳反應時間應為5 min。

    圖4 不同pH的PBS中SiQDs的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of SiQDs in PBS with different pH

    圖5 不同時間下血紅素對SiQDs的熒光猝滅情況Fig.5 Fluorescence quenching of SiQDs by hemin at different reaction times

    2.4 線性范圍及檢出限

    在上述最佳實驗條件下,考察了不同濃度血紅素對體系熒光強度的影響。如圖6(A)所示,體系的熒光強度隨血紅素濃度的升高逐漸降低,血紅素的濃度在2.67~200 μmol/L之間時,熒光強度變化值ΔF(ΔF=F0-F)與血紅素濃度的對數(shù)呈良好線性關系(圖6(B)),線性方程為:ΔF=120.12logc-38.39,相關系數(shù)R為0.997,該方法的檢出限(S/N=3)達到0.83 μmol/L。

    圖6 (A)不同血紅素濃度下的熒光光譜圖;(B)血紅素濃度對數(shù)與熒光強度變化值ΔF間關系Fig.6 (A) Fluorescence spectra of SiQDs at different hemin concentrations(a-k:The concentrations of hemin are 0.00,2.67,3.33,6.66,13.33,20.00,26.66,33.33,66.66,133.33,200.00 μmol/L,respectively);(B) Linear plot of fluorescence intensity change ΔFvs.logarithm of hemin concentrations

    圖7 不同物質(zhì)和SiQDs共存時熒光強度變化圖Fig.7 Fluorescence intensity change of SiQDs in the presence of different substances a-g stand for SiQDs,SiQDs+histidine,SiQDs+tyrosine,SiQDs+cysteine,SiQDs+methionine,SiQDs+glucose,and SiQDs+hemin.

    2.5 干擾實驗

    實驗以幾種可能共存的氨基酸和小分子為干擾物質(zhì),考察了它們對體系熒光強度的影響。這些干擾物質(zhì)的濃度是200 μmol/L,而血紅素濃度為20 μmol/L。從圖7可以看出,只有血紅素存在時,才能引起熒光顯著變化,而這些干擾物的存在則不會引起SiQDs熒光信號顯著改變,表明這種方法對血紅素的檢測具有良好的選擇性。

    2.6 實際血清樣品中血紅素的檢測

    為了進一步評估該方法的實用性,實驗進一步將稀釋的人血清樣品用作血紅素檢測的樣品基質(zhì),在樣品中未檢測到血紅素。在樣品中加入了不同濃度的血紅素進行加入回收率實驗。表1中的結(jié)果表明,檢測出的血紅素含量與添加值基本一致,回收率在97.8%~103.2%范圍內(nèi)。表明本研究所提出的方法有望用于實際樣品中血紅素的檢測。

    表1 血清樣本中血紅素的檢測(n=3)

    3 結(jié)論

    本文通過水熱法制備了具有較高熒光強度且環(huán)境友好的水溶性SiQDs?;谠撍苄許iQDs與氯化血紅素間存在著內(nèi)濾作用,建立了快速檢測氯化血紅素的熒光新方法。該方法操作簡便,所用試劑安全無毒,檢測結(jié)果具有高的靈敏度和良好的選擇性,在氯化血紅素的快速檢測方面具有應用潛力。

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