酶聯(lián)適配體傳感器比色檢測牛奶中恩諾沙星殘留

趙秋伶， 史雅靜， 張振宇

(1.遼寧科技學(xué)院生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧本溪 117004；2.遼寧科技學(xué)院電氣與信息工程學(xué)院，遼寧本溪 117004；3.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島 125105)

恩諾沙星(Enrofloxacin，ENRX)不僅可用于動(dòng)物感染性疾病的治療，而且可作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物生長[1,2]。ENRX的大量使用及濫用造成其在動(dòng)物源性食品中殘留，危害人體健康。ENRX的毒性反應(yīng)主要體現(xiàn)在對(duì)胃、腸、肝、腎的損害，以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的破壞，并有潛在的致癌作用，長期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性[3,4]。歐盟2377/90號(hào)條例規(guī)定ENRX最大殘留限量為30 μg/L，我國農(nóng)業(yè)部頒布235號(hào)公告規(guī)定ENRX在肌肉和脂肪組織的最大殘留限量為100 μg/L[5]。

免疫分析操作簡單、快速、靈敏，適合批量樣本快速篩查，在食品安全分析領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[6]。但抗體易受外界條件影響，檢測結(jié)果重現(xiàn)性差，制約了免疫分析的實(shí)際應(yīng)用。核酸適配體是高親和性和特異性結(jié)合靶標(biāo)的寡核苷酸片段[7]，具有容易標(biāo)記和修飾、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)[8]，能代替抗體發(fā)展免疫分析，為食品安全分析提供了新思路。已發(fā)展的適配體為依據(jù)的方法包括化學(xué)發(fā)光免疫分析[9,10]、熒光免疫分析[11,12]及酶聯(lián)吸附免疫分析[13,14]等，檢測機(jī)制可分為直接競爭型[9]、間接競爭型[13]、夾心型免疫分析[14]及新型檢測機(jī)理的非競爭型免疫分析[10,12]。相比較而而言，非競爭型免疫分析更有優(yōu)勢(shì)，在靈敏度、精密度、動(dòng)力學(xué)及工作曲線范圍方面都優(yōu)于競爭機(jī)制的免疫分析，操作步驟也更簡單。

基于核酸適配體的免疫分析應(yīng)用于小分子農(nóng)獸藥殘留檢測具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，但是核酸適配體在農(nóng)獸藥殘留分析中的應(yīng)用尚處于起步階段，大部分農(nóng)獸藥分子尚無核酸適配體。在前期的研究中，本課題組成功篩選了ENRX的核酸適配體[15]，本研究基于適配體結(jié)合域位于莖-環(huán)的特點(diǎn)，建立了基于外切核酸酶Ⅰ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶聯(lián)適配體免疫分析方法，檢測牛奶中ENRX殘留。該方法簡單、快速、高效可靠，成本低廉，值得在食品安全的生產(chǎn)與監(jiān)測中推廣應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Heal Force冷凍離心機(jī)(德國，Eppendorf公司)；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器(江蘇太倉華美生化儀器廠)；YRE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上?，斈醿x器設(shè)備有限公司)；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Fluo View FV1000-IX81激光共聚焦顯微鏡(日本，Olympus公司)；SpectraMax?Paradigm?多功能酶標(biāo)儀(美國，Molecular Devices公司)。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺(分析純，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。核酸外切酶Ⅰ(E.coliExonuclease I，Exo Ⅰ)購自大連寶生物工程有限公司；Anti-FITC-HRP購自美國Millipore公司；碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)購于美國Sigma公司；氨基活化的瓊脂糖凝膠(EAH sepharose 4B)、鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液均購自美國Thermo Scientific公司；未經(jīng)特殊說明，其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)時(shí)所用的緩沖溶液：固定緩沖液PBS(0.1 mol/L,pH=7.4)；洗滌緩沖液PBST(0.1 mol/L,pH=7.4,含2 mmol/L MgCl2和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12% Tween 20)；結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2,5 mmol/L的KCl,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的Tween 20，1 mg/mL酵母tRNA，pH=7.6)；偶聯(lián)緩沖溶液(0.1 mol/L MES，pH=6.0)。實(shí)驗(yàn)中均使用超純水(Milli-Q，18.2 MΩ·cm)制備樣品。

實(shí)驗(yàn)所用到的寡核苷酸序列均由英濰捷基(上海)有限公司合成，其序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的寡核苷酸序列

圖1 恩諾沙星反應(yīng)前后的紫外光譜Fig.1 The UV spectra before and after reaction of enrofloxacin

1.2 恩諾沙星與瓊脂糖珠的偶聯(lián)

10 mg ENRX溶于2 mL DMF，完全溶解后加入 2 mL 偶聯(lián)緩沖液，混勻。分別加入30 mg sulfo-NHS和26 mg EDC·HCl，完全溶解后放置4 ℃搖床中反應(yīng)15 min，得到羧基活化的ENRX溶液。2 mL氨基瓊脂糖珠用偶聯(lián)緩沖液洗滌3次后和上述活化溶液混合，置于搖床室溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢，瓊脂糖珠用0.1 mol/L PBS(pH=7.4)洗滌5次，最后重懸于5 mL PBS中保存，待用。將反應(yīng)前后的ENRX溶液稀釋相同倍數(shù)，測量紫外吸收(圖1)，反應(yīng)前后271 nm波長處吸收值明顯下降，證明偶聯(lián)成功。

1.3 激光共聚焦熒光成像

5′-FAM標(biāo)記的適配體探針1、2、3用結(jié)合緩沖液配制成500 nmol/L，分別取200 μL加入到10 μL的ENRX修飾的瓊脂糖珠中，室溫下?lián)u床反應(yīng)50 min。反應(yīng)完畢離心，棄去上清液，保留瓊脂糖珠并洗滌3次(洗掉吸附的及弱結(jié)合的適配體探針)。將瓊脂糖珠懸浮液滴于載玻片，做共聚焦熒光成像，檢測儀器為Fluoview 500/IX71倒置共聚焦系統(tǒng)，用5 mW、543 nm的He-Ne激光作為激發(fā)FAM熒光染料的光源。拍照所用的是10×鏡(PLAP060×03PH)，數(shù)值孔徑為1.4。

1.4 檢測適配體D1的固定

實(shí)驗(yàn)在固定緩沖溶液PBS中進(jìn)行，首先向PBS中加入D1，使得D1的濃度為200 nmol/L。鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板用200 μL洗滌緩沖溶液洗滌3次，每次5 min。取100 μL 200 nmol/L的D1加入到酶標(biāo)板各孔中，置于37 ℃ 搖床反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢，用200 μL洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5 min，以去除未反應(yīng)的D1。D1的5′端有生物素標(biāo)簽，通過生物素和鏈霉親和素的特異相互作用D1偶聯(lián)到鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板上。D1修飾的酶標(biāo)板立即用于下步反應(yīng)。

1.5 熒光對(duì)照實(shí)驗(yàn)

在上述D1修飾的酶標(biāo)板孔中加入100 μL的ENRX溶液(對(duì)照組0、實(shí)驗(yàn)組5 μmol/L)，室溫下?lián)u床反應(yīng)30 min，接著在反應(yīng)液中加入1.2 μL Exo Ⅰ(5 U/μL)和11 μL 10×Exo Ⅰ緩沖液，37 ℃搖床孵育30 min，反應(yīng)完畢移出反應(yīng)液至黑色酶標(biāo)板孔中，測量熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm)。

1.6 酶聯(lián)適配體傳感器檢測ENRX步驟

取100 μL不同濃度的ENRX溶液加入到上述D1修飾的酶標(biāo)板各孔中，室溫?fù)u床放置30 min，核酸適配體和ENRX充分反應(yīng)。接著在反應(yīng)液中加入1.2 μL Exo Ⅰ(5 U/μL)和11 μL 10×Exo Ⅰ緩沖液，于37 ℃孵育30 min，反應(yīng)完畢棄去反應(yīng)液，用200 μL洗滌緩沖液洗滌3次，每次5 min。未和ENRX結(jié)合的核酸適配體被Exo Ⅰ剪切變成單核苷酸，在洗滌時(shí)被除掉。接著在酶標(biāo)板每孔中加100 μL按1∶5 000 稀釋的帶辣根過氧化物酶標(biāo)簽的FITC抗體(anti-FITC-HRP)，37 ℃反應(yīng)30 min，移去反應(yīng)液，洗滌3次，未反應(yīng)的anti-FITC-HRP在洗滌時(shí)被完全去除。最后每孔加入100 μL TMB-H2O2底物顯色液，室溫反應(yīng)20 min，再加25 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，反應(yīng)液由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀測量450 nm處吸光度，同時(shí)用相機(jī)拍照。

1.7 牛奶樣品中恩諾沙星的檢測

樣品處理：吸取1 mL牛奶樣品，置于30 mL離心管中，加入6 mL乙腈，用超純水定容到10 mL。振蕩20 min，以10 000 r/min離心10 min，取上層清液5 mL于燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干，加入1 mL結(jié)合緩沖液復(fù)溶，待測。標(biāo)準(zhǔn)加入回收率測定：吸取牛奶樣品3份，每份1 mL。置于3個(gè)30 mL離心管中，每管牛奶樣品中分別添加25、50和100 ng的ENRX樣品，充分振蕩均勻，靜置10 min。按照上述樣品處理方法制備待測樣品并檢測,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)加入回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 核酸適配體結(jié)合域的鑒定

圖2 核酸適配體SS2-40的二級(jí)結(jié)構(gòu)及裁剪示意圖(球表示氫鍵，堿基通過形成氫鍵互補(bǔ)配對(duì))Fig.2 The secondary structure of aptamer SS2-40 and sketch map of tailoring(The balls represent hydrogen bonds by which bases pairing)

前期研究中，本課題組成功篩選出多條ENRX的核酸適配體，其中SS2-40親和力較強(qiáng)(Kd=0.94 μmol/L)，達(dá)到微摩爾級(jí)別[15]。后面實(shí)驗(yàn)欲用SS2-40作為分子探針實(shí)現(xiàn)ENRX的檢測，首先需確定SS2-40的結(jié)合域，以便設(shè)計(jì)出最合理的檢測策略。用核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件(Mfold軟件)分析了SS2-40的二級(jí)結(jié)構(gòu)，見圖2。3′端形成莖-環(huán)：莖部4對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)，環(huán)上20個(gè)堿基。適配體識(shí)別靶標(biāo)時(shí)，很多采用莖-環(huán)的基元結(jié)構(gòu)和靶標(biāo)相互作用[16,17]，受此啟發(fā)對(duì)SS2-40適配體序列進(jìn)行了裁剪處理，得到只含莖-環(huán)部位的SS2-28適配體序列。激光共聚焦熒光成像結(jié)果顯示(圖3)：SS2-40裁成SS2-28后，瓊脂糖珠的熒光亮度沒有明顯變化，說明裁掉的序列對(duì)結(jié)合影響不大。接著進(jìn)一步裁剪，將SS2-28的莖裁掉變成SS2-20，結(jié)果顯示瓊脂糖珠的熒光強(qiáng)度變暗明顯，說明只剩環(huán)序列時(shí)適配體結(jié)合能力很弱。綜上結(jié)論：適配體的結(jié)合域主要分布在28堿基的莖-環(huán)部位。

圖3 SS2-40及裁短序列和恩諾沙星修飾的瓊脂糖珠作用后的共聚焦成像(圖片放大尺寸比例相同)Fig.3 Confocal imaging of SS2-40 and its cut sequences after binding with enrofloxacin-functionalized agarose beads(The pictures have the same size enlargement ratio)

2.2 檢測原理

實(shí)驗(yàn)用39堿基的適配體D1(SS2-40去掉3′端一個(gè)堿基，此末端堿基對(duì)結(jié)合無影響)作為識(shí)別探針，建立了外切核酸酶Ⅰ酶切信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的適配體比色分析傳感器，檢測原理如圖4。D1上3′端異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記，5′端生物素(biotin)標(biāo)記。通過生物素和鏈霉親和素的特異相互作用，D1固定到鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板。加入ENRX，D1在ENRX的誘導(dǎo)下構(gòu)象發(fā)生變化，兩者特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。再加入外切核酸酶Ⅰ時(shí)D1不被剪切，即靶分子的加入保護(hù)適配體免遭酶切。D1上3′端的異硫氰酸熒光素能進(jìn)一步捕獲帶辣根過氧化物酶標(biāo)簽的異硫氰酸熒光素抗體(anti-FITC-HRP)，最終辣根過氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)，底物由藍(lán)色變黃色；無ENRX時(shí)，外切核酸酶Ⅰ從3′端開始順次水解D1上的各個(gè)堿基生成單核苷酸。異硫氰酸熒光素連在3′-端第一個(gè)堿基上，最先掉下來，鏈接辣根過氧化物酶的標(biāo)簽被切掉，傳感器無現(xiàn)象。FITC為熒光素，但本檢測中做鏈接標(biāo)簽，目的是鏈接辣根過氧化物酶，建立比色分析法，如有商業(yè)化的辣根過氧化物酶標(biāo)記的DNA，鏈接標(biāo)簽可省去，操作步驟更簡單、成本更低。外切核酸酶Ⅰ是單鏈特異性3′→5′核酸外切酶，對(duì)單鏈DNA的特異性非常高，但是不分解雙鏈DNA[18]。D1結(jié)合ENRX后不被外切核酸酶Ⅰ水解，說明結(jié)合后的D1上3′端堿基配對(duì)存在，即以莖-環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶標(biāo)結(jié)合。

圖4 核酸外切酶Ⅰ信號(hào)放大的核酸適體比色分析檢測原理示意圖Fig.4 Detection principle diagram of aptamer-based colorimetry with Exonuclease Ⅰ digestion signal amplification

Fig.5 熒光對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The results of fluorescence control experiment(a) no ENRX;(b) 5 μmol/L ENRX.

熒光對(duì)照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了方法的可行性，沒和ENRX反應(yīng)的核酸適配體被外切核酸酶Ⅰ水解，異硫氰酸熒光素進(jìn)入液相，導(dǎo)致液相的熒光強(qiáng)度較高(圖5曲線a)，而和ENRX反應(yīng)的核酸適配體不再被外切核酸酶Ⅰ水解，進(jìn)入液相的異硫氰酸熒光素很少，液相熒光信號(hào)較弱(圖5曲線b)。

2.3 檢測結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線

用建立的酶聯(lián)適配體比色分析傳感器檢測不同濃度ENRX的結(jié)果見圖6。由圖6a可以看出，隨著ENRX濃度的增加，溶液的顏色逐漸加深。從圖6b可以看出，隨著ENRX濃度的增加，450 mm處吸光度(A450)不斷增大,開始時(shí)增加很快，后來趨于緩慢。在100～700 nmol/L(相當(dāng)于36～254 μg/L)范圍內(nèi)，A450-A450(blank)與ENRX濃度呈良好的線性關(guān)系(圖6c)。以信噪比大于3為可測信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到的ENRX的檢測限為52 nmol/L(相當(dāng)于15 μg/L)。歐盟規(guī)定動(dòng)物源性食品中ENRX最大殘留限量為30 μg/kg，我國規(guī)定在動(dòng)物源性食品中ENRX最高殘留限量為100 μg/kg[5]，所以設(shè)計(jì)方法的靈敏度能夠滿足我國的檢測要求，也能滿足歐盟的高標(biāo)準(zhǔn)檢測要求。

圖6 (a)檢測不同濃度ENRX的照片；(b)450 nm的吸光度對(duì)ENRX濃度的關(guān)系曲線；(c)為(b)曲線中的線性部分Fig.6 (a) The photographs of detecting different concentrations of ENRX;(b) The relationship between the absorption of 450 nm and the concentration of ENRX;(c) The linear part of(b) curve

2.4 牛奶試樣的測定

從超市采集了15個(gè)牛奶樣本，用建立的適配體比色分析法檢測牛奶樣品中ENRX殘留量，結(jié)果顯示：15個(gè)牛奶樣本里有6個(gè)檢出有ENRX殘留，殘留量分別為129、43、78、96、104、152 μg/L。為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，選擇三個(gè)本底測定值為0的牛奶樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣本選擇3個(gè)添加濃度，取同一批次的D1包被板進(jìn)行檢測，計(jì)算批內(nèi)變異；再取不同批次的D1包被板進(jìn)行檢測，計(jì)算批間變異。測得的回收率在93.5%～99.6%之間，批內(nèi)變異系數(shù)為6.03%～8.12%，批間變異系數(shù)為7.31%～13.42%，見表2。方法準(zhǔn)確度和精密度良好，能用于實(shí)際牛奶樣品中ENRX殘留的檢測。

表2 牛奶樣品添加回收實(shí)驗(yàn)(n=5)

2.5 特異性分析

考察了該方法對(duì)ENRX的特異性，一些結(jié)構(gòu)相似或不相似的物質(zhì)(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺)被選作參照物。固定ENRX的濃度為1 μmol/L，參照物的濃度為10 μmol/L，用建立的方法檢測。參照物測得的A450為P，ENRX測得的A450為N，比較P/N值。結(jié)果見表3。P/N值都小于3%，表明該方法對(duì)ENRX的檢測具有較高的特異性。

表3 對(duì)照物的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(n=3)

3 結(jié)論

利用本課題組前期篩選的核酸適配體作為識(shí)別探針，建立了酶切信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶聯(lián)適配體傳感器，檢測牛奶中恩諾沙星殘留。該方法簡便快捷、靈敏度高，適用于動(dòng)物源性食品中恩諾沙星殘留的快速篩查及現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測。