Loop長(zhǎng)度對(duì)G -四鏈體DNA識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力的影響

梅秋毫， 盧珊珊， 甄笑笑， 張 楠*

(1.中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所，北京 100190；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌 443000)

G -四鏈體是由富含串聯(lián)重復(fù)鳥(niǎo)嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)。人的基因組中，特別是啟動(dòng)子區(qū)存在許多可形成G -四鏈體的序列，這些序列涉及基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等多種生理[1,2]和癌癥、糖尿病和心血管病等疾病的發(fā)生病理[3]過(guò)程，可作為藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。人工合成的G -四鏈體DNA也被發(fā)現(xiàn)具有如抗腫瘤活性等多種生物學(xué)活性[4,5]，如AS1411是一種抗增殖的富G核苷酸序列，能夠特異性識(shí)別核仁素，從而實(shí)現(xiàn)癌癥的靶向治療[6]。

核酸適配體(Aptamer)是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolution of Ligands Exponential Enrichment,SELEX)技術(shù)，篩選出來(lái)的一類功能寡聚核苷酸，具有特異性識(shí)別能力。近年來(lái)，特異性靶向腫瘤細(xì)胞核酸適配體的篩選和應(yīng)用是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，將這類核酸適配體作為分子探針可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的早期發(fā)現(xiàn)和成像定位，同時(shí)核酸適配體藥物綴合物在靶向藥物治療方面具有極大的應(yīng)用前景[7,8]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的很多核酸適配體都具有G -四鏈體結(jié)構(gòu)，如靶向肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體核酸適配體CLN0003[9]、靶向stat3核酸適配體T40214[10]、靶向核仁素核酸適配體AS1411[6,10]等。這些靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面受體的核酸適配體的DNA序列傾向于形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)，提示核酸適配體對(duì)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力可能與其G -四鏈體結(jié)構(gòu)有關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，G -四鏈體對(duì)腫瘤細(xì)胞具有普遍的識(shí)別和結(jié)合能力，并初步驗(yàn)證了G -四鏈體細(xì)胞結(jié)合能力與細(xì)胞表面的核仁素等蛋白具有相關(guān)性[11]。

G -四分體是G -四鏈體的結(jié)構(gòu)單元，由Hoogsteen氫鍵連接4個(gè)G形成環(huán)狀平面，兩層或以上的G -四分體通過(guò)π-π堆積形成G -四鏈體，而G四分體之間由1～7個(gè)核苷酸連接，這些連接G -四分體的核苷酸被稱為loop環(huán)。一般G -四鏈體核酸一級(jí)序列為5′-GnXmGnXmGnXmGn-3′(X為A、T、C或G，m=1～7，n=2或3)，X即為串聯(lián)G四分體的loop環(huán)。前期研究發(fā)現(xiàn)loop環(huán)不同的G -四鏈體DNA對(duì)腫瘤的抑制增殖作用不同[12]。對(duì)于G -四鏈體DNA，G -四分體相同，而loop環(huán)可以不同，因此loop環(huán)的堿基種類和個(gè)數(shù)決定了G -四鏈體的構(gòu)型和功能。目前，G -四鏈體DNA的loop環(huán)對(duì)其腫瘤細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合作用的影響未見(jiàn)報(bào)道；探索G -四鏈體結(jié)構(gòu)如loop環(huán)長(zhǎng)度等對(duì)其識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞能力的影響，將對(duì)設(shè)計(jì)合成特異性靶向腫瘤細(xì)胞的核酸適配體，以及具有抗腫瘤增殖活性的寡核苷酸具有指導(dǎo)意義。本文通過(guò)圓二色光譜和抗動(dòng)物血清核酸酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，考察loop長(zhǎng)度對(duì)G -四鏈體DNA構(gòu)型的影響；利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦成像，考察G -四鏈體DNA與腫瘤細(xì)胞的表面結(jié)合和被攝取情況，從而確定loop長(zhǎng)度對(duì)G -四鏈體DNA識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

J-815型圓二色光譜儀(日本，JASCO公司)；NANODROP 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher scientific公司)；DYY-10C垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；DNR Bio Imaging Systems凝膠成像系統(tǒng)(以色列，DNR成像系統(tǒng)有限公司)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)，Beckman Dickson公司)；OLYMPUS IX83 激光掃描共聚焦顯微鏡(日本，奧林巴斯)。

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺(TEMED)、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；EDTA及其他化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco品牌，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。胎牛血清(FBS)系南美血源，購(gòu)自德國(guó)PAN公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)，洗滌緩沖液(Washing Buffer,WB)為含5 mmol/L MgCl2和0.9 g/L葡萄糖的PBS，結(jié)合緩沖液為含0.5 mg/mL鯡魚(yú)精DNA和1 mg/mL BSA的WB。人正常胚腎成纖維細(xì)胞(HEK293)、人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；耐阿霉素的荷爾蒙依賴性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/ADM)購(gòu)自上海艾研生物技術(shù)公司；急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞(Jurkat E6-1)購(gòu)自醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所(北京)；人前列腺癌細(xì)胞(PC3)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(LoVo)、人前列腺癌細(xì)胞(DU145)、人膀胱癌細(xì)胞(T24)、耐紫杉醇人卵巢癌細(xì)胞(A2780T)等均購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一組不同loop長(zhǎng)度的G -四鏈體DNA(G4L1、G4L2和G4L3，loop長(zhǎng)度分別為1 nt、2 nt 和3 nt)，以及一個(gè)不含G的對(duì)照DNA序列(Ctr sq)，具體序列信息詳見(jiàn)表1。為了便于檢測(cè)，同時(shí)合成了一組在5′端標(biāo)記有熒光素(FAM)的G4L1、G4L2、G4L3和Ctr sq，分別命名為F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3 和F-Ctr(下文統(tǒng)稱為F-DNA)。所有DNA均由生工生物工程(上海)有限公司合成和純化。

表1 G -四鏈體DNA名稱與一級(jí)序列

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA樣品的制備DNA凍干粉用PBS溶解，OD260標(biāo)定濃度，標(biāo)定至濃度為40 μmol/L；F-DNA凍干粉用同樣的方法標(biāo)定至濃度為20 μmol/L。兩種DNA母液通過(guò)95 ℃加熱變性5 min，再置于冰上復(fù)性10 min，而后放于4 ℃冰箱過(guò)夜，使其緩慢形成熱力學(xué)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，用于與細(xì)胞結(jié)合的系列實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 圓二色光譜實(shí)驗(yàn)將40 μmol/L的DNA母液用PBS稀釋10倍，制成400 μL 4 μmol/L DNA溶液，室溫放置2 h，而后進(jìn)行圓二色光譜測(cè)定。圓二色光譜儀參數(shù)：靈敏度為100，掃描速度為500 nm/s，掃描次數(shù)為3次，掃描范圍200～400 nm。數(shù)據(jù)用origin8.1軟件進(jìn)行處理。

1.2.3 抗核酸酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將5′端標(biāo)記有FAM的不同的G -四鏈體DNA(F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3)和胎牛血清(FBS)在PBS中混合，配制成500 μL混合溶液,其中G -四鏈體DNA的終濃度均為4 μmol/L，F(xiàn)BS的含量均為2%，混勻后置于37 ℃的生化培養(yǎng)箱中孵育。分別在孵育0 min、15 min、30 min、1 h、8 h和24 h后，取3種不同的G -四鏈體DNA的混合孵育液50 μL，各加1 μL EDTA，渦旋振蕩5 s，95 ℃變性5 min以降解血清中核酸酶活性，然后置于-20 ℃下保存。待所有樣品取樣結(jié)束后，樣品中加入上樣緩沖液，95 ℃變性5 min后，進(jìn)行凝膠電泳分析。20%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，含7 mol/L的脲作為變性劑，電解緩沖液使用1×TBE(89 mmol/L Tris+2 mmol/L EDTA+2 mmol/L硼酸，pH為8.4)，電壓為120 V，電泳2 h。

1.2.4 流式細(xì)胞分析所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中用1640培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)。細(xì)胞根據(jù)生長(zhǎng)周期，待生長(zhǎng)密度約為70%～80%時(shí)傳代。分別將培養(yǎng)48 h的細(xì)胞(HEK293、HeLa、MCF-7/ADM、Jurkat E6-1、PC3、LoVo、DU145、T24和A2780T)與熒光標(biāo)記的G -四鏈體DNA在結(jié)合緩沖液中進(jìn)行孵育，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。每種細(xì)胞的孵育實(shí)驗(yàn)均設(shè)計(jì)成5組，分別為空白對(duì)照組(cells only)、對(duì)照序列組(F-Ctr)、F-G4L1組、F-G4L2組和F-G4L3組。每組均為將相應(yīng)的F-DNA加入細(xì)胞溶液中(空白組不加)混合，孵育液的體積為200 μL，F(xiàn)-DNA的終濃度均為200 nmol/L。在冰上孵育30 min后，用洗滌緩沖液洗滌，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，檢測(cè)的數(shù)據(jù)用Flow Jo軟件處理。加入F-DNA后皆要避光以防熒光猝滅。除Jurkat細(xì)胞(不貼壁)外，所有的細(xì)胞孵育前，均用5 mmol/L的EDTA消化5～7 min，然后用洗滌緩沖液洗滌。

1.2.5 結(jié)合解離常數(shù)(Kd值)的測(cè)定分別將0、20、40、60、80、100、200 nmol/L的F-G4L1與T24細(xì)胞在結(jié)合緩沖液中混合，冰上孵育30 min，用洗滌緩沖液洗滌，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。所得數(shù)據(jù)用Flow jo和Graphpad軟件處理。

1.2.6 胰酶消化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成兩個(gè)大組，即EDTA消化組和胰酶消化組：兩皿T24細(xì)胞，生長(zhǎng)48 h后，分別用EDTA溶液和胰酶將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化解離，制成單細(xì)胞分散液。胰酶消化組是向皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，消化2 min，再用1 mL 1640培養(yǎng)基(含10%FBS)終止消化；EDTA消化組是向皿中加入1 mL 5 mmol/L EDTA，消化5～7 min，加入洗滌緩沖液終止消化。兩組細(xì)胞離心后，都用洗滌緩沖液洗滌兩次，然后在結(jié)合緩沖液中分別與F-G4L1、F-Ctr混合孵育，另外都設(shè)一個(gè)cells only組(不加F-DNA)。孵育總體積為200 μL，F(xiàn)-DNA終濃度為200 nmol/L，冰上孵育30 min，用洗滌緩沖液洗滌后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。用Flow jo軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.7 激光掃描共聚焦成像分析3×105個(gè)T24細(xì)胞鋪于玻璃底的激光共聚焦培養(yǎng)皿中，生長(zhǎng)約36 h后，取8皿細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，用洗滌緩沖液將皿中的細(xì)胞洗兩次，再將含有不同F(xiàn)-DNA(F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3和F-Ctr)的結(jié)合緩沖液分別加入細(xì)胞中，取4皿在4 ℃條件下孵育30 min，另外4皿細(xì)胞在37 ℃下孵育30 min，孵育結(jié)束后，吸去上清，用洗滌緩沖液洗一次，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察拍照(用488 nm激光光源進(jìn)行激發(fā)，接收范圍為500～600 nm)。制出T24細(xì)胞與F-G4L1于37 ℃孵育結(jié)合的三位重構(gòu)圖像。激光共聚焦二維圖像和三維重構(gòu)圖像用FV31S-SW軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 loop環(huán)長(zhǎng)度對(duì)G -四鏈體DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響

G -四鏈體DNA一級(jí)序列5′-G3HnG3HnG3HnG -3′(H為loop堿基，代表A、C、T堿基中的任意一種，n為loop長(zhǎng)度)，其中l(wèi)oop比為1∶1∶1、2∶2∶2和3∶3∶3 這三類loop長(zhǎng)度比的G -四鏈體序列在人類基因組內(nèi)分布廣泛，占所有G -四鏈體序列約12%，具有重要的研究?jī)r(jià)值[13]。因此，為了考察loop環(huán)長(zhǎng)度對(duì)G -四鏈體DNA的構(gòu)型和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，設(shè)計(jì)了上述三種loop環(huán)長(zhǎng)度的G -四鏈體，loop環(huán)長(zhǎng)度分別為1 nt、2 nt和3 nt，并分別命名為G4L1、G4L2和G4L3，序列如表1所示。圓二色(CD)光譜可以反映出G -四鏈體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，反平行結(jié)構(gòu)G -四鏈體DNA其CD光譜在波長(zhǎng)290 nm處為正峰，260 nm處為負(fù)峰；平行結(jié)構(gòu)G -四鏈體DNA在波長(zhǎng)264 nm處為正峰，240 nm處為負(fù)峰；混合平行結(jié)構(gòu)則在波長(zhǎng)295 nm處為正峰，265 nm處出現(xiàn)正的肩峰，235 nm到240 nm間為負(fù)峰[14-16]。如圖1所示，G4L1的CD光譜在波長(zhǎng)264 nm處有正峰，240 nm處為負(fù)峰，表明G4L1為平行結(jié)構(gòu)；G4L2、G4L3在295 nm處為正峰，235 nm處為負(fù)峰，并在264 nm處為正的肩峰，表明都兩者為混合平行結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明，一個(gè)堿基長(zhǎng)度loop的G -四鏈體DNA傾向于形成平行結(jié)構(gòu)/兩個(gè)和三個(gè)堿基長(zhǎng)度loop的G -四鏈體DNA傾向于形成混合平行結(jié)構(gòu)。這與Hazel等[17]發(fā)現(xiàn)loop短的G -四鏈體傾向于形成緊湊的平行結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象相符。

2.2 loop環(huán)長(zhǎng)度對(duì)G -四鏈體DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

圖2 F-DNA與10%FBS在PBS中孵育不同時(shí)間的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis of F-DNA in PBS containing 10%FBS at different times

寡核苷酸易被核酸酶分解，而Cao等發(fā)現(xiàn)形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)的單鏈DNA較穩(wěn)定，不易被核酸酶分解[18]。為了考察G4L1、G4L2和G4L3是否也在核酸酶下穩(wěn)定，我們將熒光標(biāo)記的這三種G四鏈體DNA分別與含有核酸酶的FBS于37 ℃混合孵育不同時(shí)間，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)三種G -四鏈體DNA在血清中的降解情況進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示，在2%FBS孵育中24 h后，F(xiàn)-G4L1的電泳條帶最清晰，而F-G4L2 和F-G4L3的電泳條帶都有輕微地拖尾，說(shuō)明F-G4L1幾乎沒(méi)有降解，而G4L2和G4L3都略有降解。這表明G4L1、G4L2和G4L3耐核酸酶的能力都較強(qiáng)，而G4L1最強(qiáng)，在細(xì)胞孵育液中能夠穩(wěn)定存在。

2.3 loop環(huán)長(zhǎng)度對(duì)G -四鏈體DNA的細(xì)胞識(shí)別能力的影響

從上述結(jié)果可知，loop環(huán)長(zhǎng)度可影響G -四鏈體DNA的構(gòu)型，繼而考察不同loop長(zhǎng)度的G4L1、G4L2和G4L3與9種細(xì)胞(除HEK293細(xì)胞為正常細(xì)胞外，其余均為腫瘤細(xì)胞)的結(jié)合情況。將熒光標(biāo)記的DNA(F-G4L1、F-G4L2、F-G4L3和F-Ctr)在4 ℃下與細(xì)胞在結(jié)合緩沖液中孵育，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面熒光情況。如圖3所示，與G4L1、G4L2和G4L3這三種G -四鏈體DNA分別孵育后，PC3、LoVo、Jurkat E6-1和A2780T表面熒光與空白對(duì)照相比沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明G4L1、G4L2和G4L3與這四種細(xì)胞幾乎無(wú)結(jié)合；而DU145和HEK293與G4L1、G4L2和G4L3有較弱結(jié)合；G4L1和G4L2在MCF-7/ADM表面有較強(qiáng)熒光，而G4L3與MCF-7/ADM表面熒光較弱。這說(shuō)明loop短的G4L1和G4L2與MCF-7/ADM的結(jié)合能力比loop長(zhǎng)的G4L3強(qiáng)，MCF-7/ADM對(duì)G -四鏈體DNA的較強(qiáng)結(jié)合能力在以往文獻(xiàn)中也有類似報(bào)道[11]；G4L1、G4L2和G4L3在T24表面熒光都比較強(qiáng)，說(shuō)明這3種G -四鏈體DNA均能夠與T24有較強(qiáng)結(jié)合，其中l(wèi)oop最短(1nt)的G4L1熒光強(qiáng)度最大，說(shuō)明其與T24結(jié)合能力最強(qiáng)，T24對(duì)G -四鏈體DNA的強(qiáng)結(jié)合能力還未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其結(jié)合能力的進(jìn)一步研究，有助于深入理解G -四鏈體DNA對(duì)細(xì)胞的結(jié)合作用。

圖3 F-DNA與不同細(xì)胞相互作用的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig.3 Flow cytometric analysis of interaction between F-DNA with different cells

2.4 G -四鏈體DNA與T24結(jié)合能力的考察

圖4 T24與不同濃度F-DNA結(jié)合的親和力曲線Fig.4 Binding affinity curve of F-DNA with T24

G4L1與T24的結(jié)合能力強(qiáng)，為了考察其在對(duì)T24進(jìn)行定位檢測(cè)和靶向藥物運(yùn)送方面的應(yīng)用前景，我們對(duì)G4L1和T24的相互作用進(jìn)行了較深入的研究。首先考察G4L1與T24的結(jié)合解離常數(shù)(Kd)。將不同濃度的F-G4L1分別與T24于冰上混合孵育，用流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)量F-G4L1與T24熒光強(qiáng)度。如圖4所示，兩者的結(jié)合親和力曲線對(duì)應(yīng)的Kd值為105.8 nmol/L，這表明G4L1與T24細(xì)胞有較強(qiáng)的結(jié)合能力，有望能夠用于腫瘤細(xì)胞T24的識(shí)別診斷和治療。

2.5 G -四鏈體DNA識(shí)別T24表面靶物質(zhì)的表征

與腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，G4L1結(jié)合能力強(qiáng)于G4L2和G4L3，其可能原因之一是loop短的G4L1形成的平行結(jié)構(gòu)更容易識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞，而loop長(zhǎng)的G4L2和G4L2形成的混合平行結(jié)構(gòu)識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力較弱。而對(duì)于同一種G -四鏈體DNA與不同細(xì)胞的結(jié)合情況也不同，這一結(jié)果與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[11]。分析其原因可能是G -四鏈體DNA識(shí)別細(xì)胞表面特定的靶蛋白，而不同細(xì)胞的表面特定靶蛋白的表達(dá)量不同，其表達(dá)越多，則與G -四鏈體DNA的結(jié)合越強(qiáng)。

為了確證G4L1識(shí)別和結(jié)合T24的靶標(biāo)物質(zhì)為細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，利用胰蛋白酶水解T24的表面膜蛋白后，與F-G4L1進(jìn)行孵育，在4 ℃下用流式細(xì)胞術(shù)考察蛋白酶消化處理后的T24與F-G4L1的結(jié)合情況。以EDTA解離的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組。如圖5所示，胰酶消化的T24與F-G4L1的結(jié)合(T24-G4L1-trypsin)遠(yuǎn)少于EDTA解離的T24(T24-G4L1-EDTA)，說(shuō)明G4L1可結(jié)合T24的表面膜蛋白。

圖5 G4L1與EDTA與胰蛋白酶消化后的T24結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(A)和平均熒光強(qiáng)度(B)Fig.5 Histograms of flow cytometry of the binding of G4LI to T24 digested by EDTA or trypsin at 4 ℃(A) and their mean values of fluorescence intensity(B)

2.6 T24對(duì)G -四鏈體DNA內(nèi)吞作用的激光共聚焦成像

圖6 F-DNA與T24在4 ℃(A)和37 ℃(B)下孵育的共聚焦成像Fig.6 Confocal images of T24 incubated with F-DNA at 4 ℃(A) and 37 ℃(B) for 30 minAll scale bars represent 20 μm.

為了研究不同loop長(zhǎng)度的G -四鏈體DNA在T24中被受體介導(dǎo)內(nèi)吞的情況，利用激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)考察不同溫度(4 ℃和37 ℃)下標(biāo)記有熒光素的G -四鏈體DNA(F-G4L1、F-G4L2和F-G4L3)和對(duì)照序列(F-Ctr)在T24中的位置。如圖6所示，在4 ℃條件下，F(xiàn)-Ctr在細(xì)胞表面無(wú)熒光，而F-G4L1、F-G4L2和F-G4L3熒光分布在細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步證實(shí)了G -四鏈體DNA可與T24的表面膜蛋白結(jié)合；在37 ℃條件下，G4L1熒光大部分出現(xiàn)在細(xì)胞中，也出現(xiàn)在細(xì)胞膜上，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，而G4L2的熒光部分出現(xiàn)在細(xì)胞中，大部分出現(xiàn)在膜上，熒光強(qiáng)度較弱。這表明在4 ℃條件下，G -四鏈體DNA結(jié)合在腫瘤細(xì)胞膜蛋白上，在37 ℃條件下G -四鏈體DNA會(huì)被內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，且loop長(zhǎng)度短的G4L1更易被攝取。

對(duì)37 ℃下與G4L1結(jié)合的T24進(jìn)行Z軸掃描并三維重構(gòu)以得到細(xì)胞三維圖像。如圖7所示，從三維圖像可以直觀地看出G -四鏈體DNA被攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；并且在X-Y平面上選取熒光點(diǎn)，該點(diǎn)在X-Z和Y-Z兩個(gè)平面都有熒光，進(jìn)一步證實(shí)了G4L1被細(xì)胞攝取并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

圖7 37 ℃下G4L1進(jìn)入細(xì)胞的共聚焦三維重構(gòu)圖Fig.7 The 3D reconstruction images of confocal imaging of G4L1 internalized by T24 at 37 ℃

3 結(jié)論

本文采用圓二色光譜和凝膠電泳對(duì)不同連接環(huán)(loop)長(zhǎng)度G -四鏈體DNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù)考察了它們與不同腫瘤細(xì)胞的結(jié)合情況，研究了G -四鏈體DNA的連接環(huán)(loop)長(zhǎng)度在其與腫瘤細(xì)胞結(jié)合中的作用。結(jié)果表明，loop長(zhǎng)度越短的G -四鏈體DNA越易形成平行結(jié)構(gòu)，識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力越強(qiáng)，也更容易被細(xì)胞攝取；loop長(zhǎng)度長(zhǎng)的G -四鏈體DNA傾向于形成混合平行結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的G -四鏈體DNA識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力較弱。G -四鏈體loop長(zhǎng)度與其形成的空間結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，以及與細(xì)胞結(jié)合的普遍規(guī)律，對(duì)篩選或者高親和力、高特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的含G -四鏈體結(jié)構(gòu)的核酸適體，以及含G -四鏈體結(jié)構(gòu)的靶向藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建提供了參考和依據(jù)。