接種根瘤菌對高效固氮植物合歡實生苗耐鎘性的影響

曾電源，張 芳，上官凌飛 ，周玉明，王永江，王彥杰，徐迎春*

（1.浙江偉達(dá)園林工程有限公司，浙江 杭州310051；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀農(nóng)業(yè)重點實驗室,江蘇 南京210095；3.安徽蕪湖東源新農(nóng)村開發(fā)股份有限公司博士后工作站，安徽 南陵241300）

目前土壤重金屬污染在世界范圍內(nèi)十分普遍。鎘（Cd）因移動性大、毒性強(qiáng)、污染面積大被稱為“五毒（Cd、Hg、Pb、Cr、As）”之首[1]。因此，亟待對鎘污染的土壤進(jìn)行修復(fù)。人工修復(fù)方法有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。其中生物修復(fù)（包括植物和微生物）具有成本低、對環(huán)境影響小、最大限度降低污染物濃度、便于操作等優(yōu)點。但實踐證明，單純植物或者微生物修復(fù)均存在一些不足之處。而近年來興起的微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)則是利用微生物-植物的共生關(guān)系，提高重金屬污染土壤的修復(fù)效率，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，尤其是根瘤菌-豆科植物共生體系在重金屬污染土壤修復(fù)中占據(jù)了重要地位[2]。

在重金屬污染地，重金屬毒性和氮素不足是植物生長主要限制因子。根瘤菌-豆科植物共生體系是已知固氮能力最強(qiáng)的生物固氮體系之一，把豆科植物作為重金屬污染地的先鋒植物，利用根瘤菌－豆科植物共生體的固氮作用來加速污染地氮素積累，進(jìn)而促進(jìn)污染地的營養(yǎng)元素循環(huán)、積累和重金屬污染地植被恢復(fù)[3]；根瘤菌在促進(jìn)植物生長的同時，還可通過長期的進(jìn)化，有效適應(yīng)環(huán)境的改變和有害物質(zhì)的存在，表現(xiàn)出抗重金屬的能力。目前，已篩選出多種重金屬抗性根瘤菌[4]。同時根瘤菌還可刺激其他降解菌的生存和行動能力，從而降低污染物的濃度[5]。因此，利用根瘤菌-高效固氮植物進(jìn)行重金屬污染土壤的改良是一個全新的思路，具有重要的現(xiàn)實意義。

園林植物不進(jìn)入人的食物鏈，不存在食用安全的問題。因此，選擇具有經(jīng)濟(jì)價值的豆科園林植物，利用其根瘤菌-植物共生體系，用于土壤重金屬污染治理，還可獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的發(fā)展前景。但目前關(guān)于高效固氮園林植物與根瘤菌共生對Cd 耐性的研究較少，限制了其在生態(tài)修復(fù)上的應(yīng)用。

豆科喬木植物合歡（Albizia julibrissin Durazz）與根瘤菌共生，具有較強(qiáng)的固氮作用。合歡具有較大的經(jīng)濟(jì)價值、觀賞價值和生態(tài)價值。在園林上適宜用作庭蔭樹、行道樹；其樹皮有安神解郁、活血止痛、驅(qū)蟲等功效；花可解郁寧心、開胃利氣；其嫩葉富含維生素C，為佐餐之佳品；其木材可作家具、建筑等[6]。

Sm1021 根瘤菌（Sinorhizobium meliloti 中華根瘤菌1021）是目前普遍使用的一類內(nèi)生根瘤菌，可用于豆科植物和非豆科植物的接種，已被證明具有提高植物抗逆性的作用。但其能否提高合歡對Cd的耐性尚缺乏研究。

為此，本研究以合歡實生苗為試材,設(shè)置接種Sm1021 根瘤菌與不接種組，并進(jìn)行不同濃度CdCl2處理，通過研究其對合歡幼苗生長發(fā)育和生理生化特性的影響，以驗證根瘤菌能否提高合歡對Cd 的耐性，以及根瘤菌緩解Cd 毒害的作用范圍，為外源接種根瘤菌提高合歡對鎘污染土壤的修復(fù)能力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將合歡種子首先用0.1%高錳酸鉀液浸泡2 h進(jìn)行消毒，然后用100℃的開水進(jìn)行燙種，不斷攪拌5 min，再加入適量冷水,使水溫達(dá)到40℃，浸泡一晝夜撈出，放入培養(yǎng)箱中黑暗條件下催芽，溫度白天30℃（8 h），夜晚20℃（16 h）。每天翻動1～2 次，適量加水，保持原有濕度。合歡種子催芽后播入50 孔的穴盤內(nèi)（穴孔直徑6 cm，深12 cm）,基質(zhì)采用泥炭：珍珠巖=3：1。

GFP 熒光蛋白標(biāo)記的Sm1021 根瘤菌菌液由中國科學(xué)院植物研究所沈世華研究員贈送，為內(nèi)生菌類型。

1.2 試驗處理

1.2.1 Sm1021 根瘤菌的培養(yǎng)與接種

①Sm1021 根瘤菌的培養(yǎng)方法（參照中國科學(xué)院植物所沈世華實驗室的方法）

培養(yǎng)液的成分：磷酸緩沖液（PBS）（NaCl 8 g、KCl 0.2 g、NaH2PO41.44 g、KH2PO40.24 g,調(diào)pH 至7.4，高壓滅菌）；四環(huán)素（Tc）（取100 mg，溶于10 mL無菌水中，過濾滅菌，用1.5 mL 離心管裝1 mL，4℃保存）；鏈霉素（Str）（取500 mg，溶于10 mL 無菌水中，過濾滅菌，用1.5 mL 離心管裝1 mL，4℃保存）；TY 培養(yǎng)基（1L）（蛋白胨5.0 g，酵母提取物3.0 g，CaCl2·2H2O 0.88 g，pH=7.4，高壓滅菌）。

培養(yǎng)方法：取100 mL 液體TY 培養(yǎng)基裝入300 mL三角瓶中，再分別加入下列貯備物：Sm1021-20℃保存的菌液100 μL；Tc（10 mg·mL-1）100 μL；Str（50 mg·mL-1）100 μL.置于28℃搖床、轉(zhuǎn)速為180×g，黑暗條件培養(yǎng)48 h，至OD600=0.8 時止。

菌體收集與洗滌：將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)入100 mL 離心管，在室溫條件、4000×g 離心5 min,去上清；用PBS 重懸菌體，同樣條件離心，去上清；重復(fù)洗滌2次，再用無菌水將菌體稀釋至108 cell·mL-1備用。

②接種根瘤菌

每株幼苗接種1 mL Sm1021 根瘤菌活菌菌液，用移液器小心注入到幼苗根際約1 cm 深土壤表面。

③Sm1021 根瘤菌的檢測

接種后2 周，取4 株接種的合歡幼苗，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院中心實驗室，使用體式熒光顯微鏡（M165FC，Leica，德國）觀察合歡幼苗根部及葉片等部位的Sm1021 根瘤菌所標(biāo)記的GFP 蛋白的定位情況，分析根瘤菌是否接種成功。將合歡幼苗的根尖切成5 mm 左右的小段；將葉片的下表皮撕下來，分別放于熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.2.2 Cd 處理

待確定接種組接種成功后，將合歡幼苗分為7組（如表1所示）：不接種根瘤菌，不進(jìn)行Cd 處理，作為對照，編號為CK；接種根瘤菌，不進(jìn)行Cd 處理，編號為CK*；接種根瘤菌，同時分別設(shè)置5、10、15、25 mg·L-14 個不同濃度的CdCl2處理，編號分別為5 Cd*、10 Cd*、15 Cd*、25 Cd*；不接種根瘤菌，只進(jìn)行25 mg·L-1CdCl2處理，編號為25 Cd。

表1 合歡實生苗試驗處理及其編號

每個處理15 株,分為3 組,每組5 株，視為重復(fù)3 次。Cd 處理組每3 天澆1 次設(shè)定濃度的CdCl2溶液，共重復(fù)澆灌5 次。待植株出現(xiàn)Cd 中毒癥狀后，采集葉片或根系鮮樣用于測定生理生化指標(biāo)。

1.3 測定內(nèi)容與方法

測定各處理合歡葉片的相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、丙二醛（MDA）含量、SOD 活性。

相對電導(dǎo)率的測定參考 《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》[7]的實驗方法來測定；葉綠素含量參考《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》[7]的方法，采用95%y 乙醇提取，分光光度法測定；可溶性蛋白質(zhì)含量的測定參考《植物生理學(xué)實驗教程》[8]的方法，采用紫外吸收法測定；丙二醛（MDA）含量的測定參考《植物生理學(xué)實驗》[9]的方法，采用TBA 法測定；SOD 活性測定參考《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》[10]的方法，采用NBT 法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Microsoft Excel 2017 進(jìn)行圖表繪制；采用SPSS 26.0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(oneway ANOVA)，采用Duncan's 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，其中顯著性水平為p＜0.05，柱形圖標(biāo)注的不同小寫字母表示其在0.05 水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡幼苗生長發(fā)育的影響

從圖1可以看出，成功接種根瘤菌的對照組（CK）的合歡植株（圖1B）明顯比未接種根瘤菌的對照組植株（CK*）（圖1A）生長狀態(tài)好，表現(xiàn)為葉片數(shù)增加、株高增加，根系發(fā)達(dá)，尤其是側(cè)根數(shù)增加、根莖加粗。Cd 脅迫處理合歡（圖1C）的根系生長受到抑制，側(cè)根數(shù)明顯減少，葉片變小，葉片數(shù)減少；而Cd 脅迫處理接種根瘤菌后合歡（圖1D）的根系明顯較未接種組發(fā)達(dá)，雖然仍較對照組根系差，但仍有部分側(cè)根存活，且株高生長仍能維持較好的水平，葉片數(shù)也較未接種組高。說明接種Sm1021 根瘤菌后可使合歡在鎘脅迫下維持較正常的生長，緩解鎘的傷害。

圖1 接種Sm1021 根瘤菌對鎘脅迫下合歡幼苗生長發(fā)育的影響

2.2 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉片和根系相對電導(dǎo)率的影響

如圖2所示，接種根瘤菌的對照CK* 合歡幼苗葉片的相對電導(dǎo)率比未接種的對照組顯著降低，說明根瘤菌與合歡共生有利于保護(hù)合歡的細(xì)胞電解質(zhì)外滲。接種根瘤菌后，低濃度（5 mg·L-1）Cd 脅迫下合歡葉片相對電導(dǎo)率與CK 并未顯著升高，說明根瘤菌可顯著改善合歡對低濃度Cd 的耐性；隨著Cd 濃度升高，葉片相對電導(dǎo)率也隨之升高，至15 mg·L-1Cd 處理時達(dá)到最高點，即使Cd 濃度繼續(xù)升高至25 mg·L-1，葉片的相對電導(dǎo)率也不再升高。高濃度（25 mg·L-1）Cd 處理下，接種根瘤菌后葉片的相對電導(dǎo)率較同濃度Cd 處理未接種根瘤菌組并未顯著降低，說明根瘤菌對高濃度Cd 脅迫下合歡葉片的細(xì)胞膜保護(hù)作用有限。

圖2 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片相對電導(dǎo)率的影響

從圖3可以看出，CK*根系的相對電導(dǎo)率與CK無顯著差異，說明接種根瘤菌對于根系相對電導(dǎo)率無顯著影響。接種根瘤菌后，各處理濃度Cd 脅迫均導(dǎo)致根系的相對電導(dǎo)率顯著升高；且隨著Cd 濃度升高而隨之升高，至15 mg·L-1Cd 處理時達(dá)到最高點，即使Cd 濃度繼續(xù)升高（25 mg·L-1），根系的相對電導(dǎo)率不再升高。高濃度Cd 處理下，接種根瘤菌后根系的相對電導(dǎo)率較同濃度Cd 處理未接種根瘤菌組并未顯著降低，說明根瘤菌對高濃度Cd 脅迫下合歡根系細(xì)胞膜的保護(hù)作用有限。

圖3 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下根系相對電導(dǎo)率的影響

2.3 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉片MDA 含量的影響

由圖4可以看出，CK* 組葉片的MDA 含量比CK 組顯著降低，說明接種根瘤菌可保護(hù)膜系統(tǒng)的過氧化。接種根瘤菌后，低濃度（5 mg·L-1）Cd 脅迫不會導(dǎo)致MDA 含量升高；但隨著Cd 處理濃度升高，葉片MDA 含量仍然逐漸升高。與未接種根瘤菌的高濃度（25mg·L-1）Cd2+處理相比，接種根瘤菌的合歡MDA 含量并無顯著降低，說明根瘤菌在高濃度下難以發(fā)揮對細(xì)胞膜的保護(hù)作用。

圖4 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片MDA 含量的影響

2.4 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉綠素含量的影響

如圖5所示，接種根瘤菌的對照組（CK*）合歡幼苗的葉綠素含量比未接種的對照組（CK）顯著升高，說明根瘤菌可促進(jìn)葉綠素的合成。

圖5 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉綠素含量的影響

5-15 mg·L-1Cd 處理下，合歡的葉綠素含量與CK 相比，并未顯著降低，說明根瘤菌可保護(hù)葉綠素不受Cd 毒害，直到高濃度（25 mg·L-1）Cd 處理下，葉綠素含量才顯著下降。接種根瘤菌的植株在高濃度Cd 處理下葉綠素含量與未接種組并無顯著差異，說明在高濃度Cd 脅迫下，根瘤菌無法發(fā)揮緩解葉綠素受Cd 毒害的作用。

2.5 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

從圖6可看出，接種根瘤菌的對照組（CK*）合歡葉片可溶性蛋白質(zhì)含量比未接種的對照組（CK）高，說明根瘤菌共生對提高可溶性蛋白質(zhì)含量有一定的積極作用。

圖6 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

各濃度Cd 處理均導(dǎo)致接種根瘤菌的合歡葉片可溶性蛋白質(zhì)含量顯著下降，且隨著Cd 濃度的升高而逐次降低。但在高濃度（25mg·L-1）Cd 脅迫下，接種根瘤菌的植株蛋白質(zhì)含量較未接種組顯著升高，說明根瘤菌共生可顯著緩解合歡受Cd 毒害導(dǎo)致的可溶性蛋白質(zhì)含量下降。

2.6 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉片SOD 活性的影響

如圖7所示，接種根瘤菌的對照組（CK*）葉片的SOD 活性比未接種對照組的顯著降低，說明根瘤菌可增強(qiáng)合歡幼苗清除氧離子自由基的能力。接種根瘤菌后，較低濃度（5-15 mg·L-1）的Cd2+處理導(dǎo)致合歡葉片SOD 活性顯著上升，且呈現(xiàn)出隨Cd 濃度升高而升高的趨勢。說明根瘤菌可以激發(fā)合歡的抗氧化酶系統(tǒng)緩解Cd 脅迫導(dǎo)致的氧化傷害。

圖7 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片SOD 活性的影響

高濃度（25 mg·L-1）Cd2+處理導(dǎo)致葉片SOD 活性較對照顯著降低，但接種根瘤菌可使SOD 活性有一定程度的恢復(fù)，但仍然無法恢復(fù)到對照水平。說明根瘤菌只能在一定程度上抵御Cd 脅迫；其清除氧離子自由基的能力有限,超過此濃度（15 mg·L-1）后，Cd 脅迫對膜的傷害程度超過了保護(hù)酶的防御能力,合歡體內(nèi)的SOD 活性下降。

3 討論

已知根瘤菌與豆科植物共生，可顯著促進(jìn)植物生長。本研究也證實了這一點。接種根瘤菌后，豆科植物合歡的實生苗根系較未接種組發(fā)達(dá)，葉片數(shù)、株高均增加。而且接種根瘤菌的對照組（CK*）合歡葉片的相對電導(dǎo)率、MDA 含量、SOD 酶活性較未接種組對照（CK）顯著降低，葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)含量顯著升高，進(jìn)一步證明，接種根瘤菌增強(qiáng)了合歡幼苗的生理代謝活動，提高了抗性。本研究還考察了接種根瘤菌后，合歡幼苗在不同濃度Cd 脅迫下的生理反應(yīng)。

Cd 對植物細(xì)胞的影響往往最先作用于細(xì)胞膜，使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲[11]。因此，植株的膜透性（相對電導(dǎo)率）在一定程度上能夠反映出Cd 對植株的傷害情況。本文結(jié)果表明，低濃度（5 mg·L-1）Cd 脅迫下，接種根瘤菌組葉片的相對電導(dǎo)率與對照（CK）無顯著差異，說明合歡葉片可抵御低濃度Cd 脅迫對細(xì)胞膜的傷害；但該濃度Cd 脅迫下，根系的相對電導(dǎo)率卻顯著降低。說明合歡的根系比葉片對Cd 脅迫的響應(yīng)更敏感。

植株體內(nèi)MDA 含量作為膜系統(tǒng)受傷害程度的重要指標(biāo)之一，其含量的多少也能反映出Cd 對植株的傷害情況。本研究表明，低濃度（5 mg·L-1）Cd脅迫下，接種根瘤菌組葉片的MDA 含量與CK 比，并未上升，說明根瘤菌共生有助于合歡抵御低濃度的Cd 脅迫，不使其膜系統(tǒng)受到過氧化傷害。

葉綠素含量的變化既可反映植物葉片光合能力的強(qiáng)弱,也可表征逆境脅迫下植物組織、器官的衰老狀況[12]。本研究表明，5-10 mg·L-1Cd 脅迫下，接種根瘤菌組葉綠素含量與CK 比，并未降低，說明接種根瘤菌后，合歡可以忍受5-10 mg·L-1Cd 脅迫，保護(hù)葉綠素不受Cd 毒害而發(fā)生降解。

接種根瘤菌后，合歡葉片的SOD 活性在5-15 mg·L-1Cd 脅迫下均比CK 顯著升高，說明合歡的保護(hù)酶系統(tǒng)發(fā)揮了重要的清除氧離子自由基的作用。

逆境脅迫下,植物體能夠通過代謝調(diào)控積累一些小分子有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié),緩解滲透脅迫[13]，可溶性蛋白質(zhì)含量的高低在一程度上能夠反映植物對逆境脅迫的耐性。Hong 等[14]的研究表明，Cd脅迫誘導(dǎo)可溶性蛋白質(zhì)含量增加,可能是植物抵抗Cd 毒害的一種解毒機(jī)制。Du 等[15]的研究表明,Cd脅迫使小麥幼苗中可溶性蛋白質(zhì)含量下降。尹國麗[1]的研究也表明,隨Cd 脅迫濃度的增大,可溶性蛋白質(zhì)含量減少。本試驗的結(jié)果與Du 及尹國麗等人的研究結(jié)果相同，可溶性蛋白質(zhì)含量隨Cd 脅迫濃度的增大而下降，可能是因為Cd 脅迫處理時間較長,使得Cd 在合歡幼苗體內(nèi)過量積累,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,造成可溶性蛋白質(zhì)含量下降,蛋白水解酶的活性也因此受到抑制。但接種根瘤菌的合歡幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量較未接種根瘤菌的合歡幼苗高，說明根瘤菌能誘導(dǎo)可溶性蛋白質(zhì)含量增加，是一種根瘤菌協(xié)助合歡幼苗抵抗Cd 毒害的解毒機(jī)制。

總體來看，接種根瘤菌的合歡幼苗的生理反應(yīng)均呈現(xiàn)出對較低濃度的Cd 脅迫有較好的耐性，能忍耐的最大Cd 脅迫濃度為15 mg·L-1，但在高濃度（25 mg·L-1）Cd 脅迫下并未表現(xiàn)出顯著的緩解Cd毒害的效果。

因此，可以說明，合歡作為高效固氮植物，與根瘤菌建立共生體系，可以忍受一定濃度的Cd 脅迫，可將其應(yīng)用于Cd 污染土壤的生物修復(fù)，具有良好的應(yīng)用前景。