KRAS基因突變類型預測結腸直腸癌根治術后異時性遠處轉移

林松斌，馮青陽，許劍民

（1.復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院普外科，福建 廈門 361000；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200032）

結腸直腸癌是世界常見的惡性腫瘤[1]。在我國，結腸直腸癌發(fā)病率與死亡率逐年上升，均位居惡性腫瘤第5位，正逐步接近發(fā)達國家[2-3]。遠處轉移是結腸直腸癌病人死亡的主要原因。對于初診無轉移的結腸直腸癌病人，行原發(fā)灶根治術后，10%～25%的病人出現(xiàn)異時性遠處轉移[4-5]。手術是治療異時性遠處轉移的最佳手段，早期發(fā)現(xiàn)是達成手術切除的關鍵[6]。然而，異時性遠處轉移潛伏期較長，缺乏臨床癥狀，難以發(fā)現(xiàn)。因此，研究預測異時性轉移的有效手段成為改善結腸直腸癌預后的重點。

多項研究已證實，RAS-RAF-MAPK信號通路在結腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[7-9]。同時，KRAS基因也是抗EGFR治療能否起效的重要預測標志[10-12]。既往KRAS突變與異時性遠處轉移的報道較少。本研究比較原發(fā)灶根治術后無轉移病人與發(fā)生異時性遠處轉移病人的臨床病理特征及KRAS基因型的差異，尋找預測異時性遠處轉移的標志物，并建立多因素模型，提高預測準確性。

材料與方法

一、研究人群

回顧性選取2002年1月至2008年12月復旦大學附屬中山醫(yī)院普外科手術切除的結腸直腸癌病人。包括如下條件：18～75歲；初診影像學檢查明確無同時性遠處轉移；原發(fā)灶根治性切除；術后病理檢查確診結腸直腸癌；術前未接受化療、放療或介入治療；病程中未接受靶向治療。依據(jù)病人原發(fā)灶切除術后是否出現(xiàn)異時性遠處轉移，分為無轉移組和轉移組。遠處轉移定義為肝、肺、骨、腦等遠處臟器的轉移，包括鎖骨下淋巴結轉移，但不包括盆腔淋巴結、腹膜后淋巴結轉移及腹膜播散。同時性遠處轉移定義為初診即發(fā)現(xiàn)轉移及原發(fā)灶根治術后6個月內(nèi)出現(xiàn)轉移。異時性遠處轉移定義為原發(fā)灶根治術6個月后出現(xiàn)遠處轉移。所有病人原發(fā)灶根治性切除術后均依據(jù)《衛(wèi)生部結直腸癌診療規(guī)范（2017年版）》接受輔助治療。僅出現(xiàn)遠處轉移后，可應用經(jīng)導管動脈化療栓塞和經(jīng)導管動脈灌注化療。

二、KRAS基因檢測

選取原發(fā)灶根治性切除術后標本，經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋，連續(xù)切片。采用基因科技（上海）有限公司“GTpure FFPE DNA kit”抽提，制備DNA模板。采用PCR擴增KRAS第2外顯子12密碼子和13密碼子片段。應用焦磷酸法測序（PyroMark ID system,PSQ 96 MA,Biotage AB,Sweden），檢測相應突變。

三、隨訪

病人依據(jù)《衛(wèi)生部結直腸癌診療規(guī)范（2017年版）》進行隨訪。術后2年內(nèi)，每3～6個月1次病史詢問、體格檢查、腫瘤標志物檢查、肝臟超聲檢查。術后2～5年，上述檢查每6個月1次。術后5年內(nèi)，每年1次胸、腹和盆腔增強CT掃描。復查結腸鏡為術后1年內(nèi)、第3年，以后每5年1次。懷疑肝轉移的病人加行MRI檢查，必要時行PET-CT檢查。若發(fā)現(xiàn)遠處轉移，則追溯前一次檢查結果，以明確轉移灶出現(xiàn)的確切時間。

四、統(tǒng)計學方法

對于分類變量，采用χ2檢驗。如理論頻數(shù)＜5或樣本量＜40，則采用Fisher精確檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-Rank比較差異。單因素/多因素分析采用Logistic回歸計算比數(shù)比(odds ratio，OR)和相應的95%CI。中位隨訪時間依據(jù)Schemper等[13]的報道進行計算。預測模型采用Logistic回歸Backward Stepwise法建立，采用R軟件繪制列線圖 (Nomogram)，應用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線進行內(nèi)部效能檢驗，曲線下面積（area under the curve,AUC）＞0.7認為模型預測效能較好。其他統(tǒng)計學分析應用 SPSS 16.0軟件。P值為雙側檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。將P＜0.1的因素納入多因素分析。

結 果

一、KRAS基因突變情況

本研究隨機納入病人186例，按轉移組與無轉移組1∶1分組，其中無轉移組93例，轉移組93例。病人中位隨訪時間86個月，其中無轉移組88個月，轉移組84個月。無轉移組KRAS基因野生型68例（73.1%）；突變型25例（26.9%）。轉移組 KRAS 基因野生型49例（52.7%）；突變型44例（47.3%）。檢測到病人7種KRAS基因突變類型，均為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）。其中，KRAS第2外顯子12密碼子突變類型（6種）為c.35G ＞A,p.G12D；c.35G ＞T,p.G12V；c.34G ＞T,p.G12C；c.35G＞C,p.G12A；c.34G＞A,p.G12S；c.34G＞C,p.G12R。KRAS第2外顯子13密碼子突變類型（1 種）為 c.38G＞A,p.G13D。全體突變互斥，未檢測到多重突變（見表1）。

表1 KRAS基因突變情況[n（%）]

二、KRAS基因突變與臨床病理因素的相關性

對KRAS基因突變類型與臨床病理因素進行相關性分析。結果顯示，KRAS基因突變與原發(fā)灶根治術前 CEA(P=0.015)和異時性遠處轉移(P＜0.001)顯著相關，與術后pN分期潛在相關(P=0.073)（見表2）。

表2 KRAS突變類型與臨床病理因素的相關性[n（%）]

三、KRAS基因突變是發(fā)生異時性遠處轉移的獨立影響因素

進一步對不同的臨床病理因素及KRAS基因突變類型與結腸直腸癌的異時性遠處轉移的相關性進行了單因素及多因素分析。其中單因素分析結果顯示，原發(fā)灶病理類型為黏液腺癌與異時性遠處轉移的發(fā)生時間呈潛在負相關 (OR=0.490，95%CI：0.220～1.090，P=0.080)，術后病理 N2 分期與異時性遠處轉移的發(fā)生時間呈潛在正相關 (OR=2.134，95%CI：0.993～4.585，P=0.052)。KRAS 基因c.35G＞T,p.G12V 突變型(OR=4.163，95%CI：1.267～13.681，P=0.019) 和 c.38G＞A，p.G13D 突變型 (OR=7.286，95%CI：2.352～22.567，P=0.001)與異時性遠處轉移呈正相關。多因素分析顯示，女性(OR=0.426,95%CI：0.207～0.876,P=0.020)、 原發(fā)灶位于直腸(OR=0.408，95%CI：0.173～0.961，P=0.040)、原發(fā)灶組織學類型黏液腺癌 (OR=0.230,95%CI：0.075～0.709，P=0.010) 是異時性遠處轉移的獨立保護因素。術后 pN2 分期(OR=4.191，95%CI：1.643～10.691，P=0.003)、KRAS 基因 c.35G＞T，p.G12V 突變型(OR=10.568，95%CI：2.568～43.499，P=0.001)和 c.38G＞A，p.G13D 突變型 (OR=12.657，95%CI：3.607～44.411，P＜0.001)是異時性遠處轉移的獨立危險因素（見表3）。

表3 異時性遠處轉移單因素/多因素分析

對轉移組病人轉移發(fā)生時間的分析顯示，異時性遠處轉移發(fā)生的中位時間為16個月，四分位數(shù)間距 (interquartile range,IQR)=10～28個月。其中，KRAS野生型病人轉移中位時間為18個月，IQR=12～31 個月；c.35G＞A，p.G12D 突變型中位時間為11 個月，IQR=9～28 個月；c.35G＞T，p.G12V 突變型中位時間為 15 個月，IQR=8～34 個月；c.38G＞A，p.G13D突變型中位時間為13個月，IQR=9～19個月。KRAS基因 c.38G＞A，p.G13D 突變型相比野生型，遠處轉移發(fā)生中位時間潛在較短(P=0.066)，其余基因型之間的差異無統(tǒng)計學意義（見圖1）。本研究KRAS基因p.G13D突變病人發(fā)生轉移時間較野生型病人潛在較短（13 個月比 18 個月,P=0.066）。p.G12D 突變病人與野生型病人相比，發(fā)生轉移的中位時間雖更短（11個月比18個月），但由于樣本量有限，差異未能得出統(tǒng)計學意義（P=0.264），有待擴大樣本量，開展進一步研究。

圖1 不同KRAS基因型病人異時性遠處轉移發(fā)生中位時間

四、多因素模型預測異時性遠處轉移

以多因素分析結果為基礎建立預測模型，最終納入5個因素：性別、原發(fā)灶部位、原發(fā)灶組織學類型、術后pN分期和KRAS基因突變類型。建模因素均為異時性遠處轉移的獨立影響因素。繪制相應列線圖模型（見圖2）。

圖2 異時性遠處轉移多因素預測模型

ROC曲線檢驗TNM分期預測異時性遠處轉移，AUC=0.569，95%CI：0.487～0.652（見圖3）。KRAS基因類型單獨預測異時性遠處轉移，AUC=0.628,95%CI：0.548～0.709。多因素預測模型內(nèi)部效能檢驗，AUC=0.767,95%CI：0.700～0.834。結果顯示，該多因素模型內(nèi)部預測性能良好，顯著優(yōu)于TNM分期(P＜0.001)和 KRAS 基因類型(P＜0.001)單個因素預測（見圖3）。

圖3 預測模型內(nèi)部效能檢驗

討 論

本研究顯示，KRAS基因突變以 c.35G＞A,p.G12D；c.35G＞T,p.G12V 和 c.38G＞A,p.G13D 三種類型為主。其中，c.35G＞A,p.G12D 與異時性遠處轉移無明顯相關性；c.35G＞T,p.G12V 和 c.38G＞A,p.G13D均是異時性遠處轉移的獨立危險因素。以性別、原發(fā)灶的部位和組織學類型、術后pN分期和KRAS基因突變類型共5個因素建立多因素預測模型，可有效預測原發(fā)灶根治術后異時性遠處轉移的發(fā)生。

KRAS基因突變主要表現(xiàn)為SNP[14-15]。除外無氨基酸表達改變的無意義突變，KRAS基因SNP通過關鍵位點氨基酸的改變影響KRAS表達蛋白質(zhì)的結構，從而影響其生物學功能。本研究顯示，KRAS第2 外顯子 12 密碼子發(fā)生 c.35G＞A,p.G12D 突變后，盡管氨基酸發(fā)生改變，但在腫瘤遠處轉移方面影響并不顯著；然而c.35G＞T,p.G12V突變顯著提高異時性遠處轉移的發(fā)生率。因此，即使是同一位點的突變，突變類型不同，也會導致生物學性狀不同。提示在個體化治療中，不應以突變基因位點簡單區(qū)分病人，而應關注突變基因的具體生物學性狀。

本研究也存在缺陷。首先，納入樣本量較少，未包含KRAS的全部突變類型，且部分突變種類頻率較低，未進行有效的統(tǒng)計學分析。其次，建立的多因素預測模型僅接受內(nèi)部驗證，尚需外部驗證以明確其預測效能。第三，眾所周知，結腸直腸癌是一種多基因相關的惡性腫瘤，僅檢測單個KRAS基因無法精確預測疾病進程。這是今后研究的又一個方向。

本研究證實，KRAS 基因 c.35G＞T,p.G12V 和c.38G＞A,p.G13D 突變是異時性遠處轉移的獨立危險因素。本研究建立的多因素預測模型較好地預測結腸直腸癌原發(fā)灶根治術后異時性遠處轉移的發(fā)生。模型還需多中心、大樣本驗證，進一步明確其有效性與適用范圍。