生防芽孢桿菌與殺菌劑的篩選復(fù)配及對欒樹枝枯病防控效果

曾艷玲，劉 韓，黎肇家，李姝江*

（1.長江上游森林資源保育與生態(tài)安全國家林業(yè)和草原局重點實驗室/四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，成都 611130；2.四川省甘孜州林業(yè)科學(xué)研究所，四川康定 626001）

欒樹枝枯病由小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）引起的枝干病害[1]。枝枯病可致欒樹枝條無法正常生長，病害嚴(yán)重會導(dǎo)致整個枝條干枯死亡，藥用價值、觀賞價值、園林綠化價值、經(jīng)濟(jì)價值降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。中國北部及中部大部分省區(qū)均有欒樹枝枯病的發(fā)生。小新殼梭孢是一種木本植物病害常見病原菌。小新殼梭孢可以導(dǎo)致多種木本植物發(fā)生多種病害，可以侵染桉樹，導(dǎo)致桉樹枝干枯萎[2-3]；能使麻風(fēng)樹發(fā)生芽枯病[4]；能使柑橘果實腐爛[5]；藍(lán)莓、核桃枝干枯死等[6-7]。目前對小新殼梭孢引起的病害防治主要是依靠苯醚甲環(huán)唑、多菌靈和甲基硫菌靈等化學(xué)藥劑防治為主[2，8]。然而，化學(xué)藥劑長期使用破壞生態(tài)環(huán)境，并且長期使用高濃化學(xué)藥劑對人體健康存在潛在的威脅[9-10]，病原菌容易產(chǎn)生抗藥性[11-12]。生物防治具有低毒、綠色環(huán)保的優(yōu)點，但易受環(huán)境、氣候、定殖能力等的影響，存在大田防效差、顯效慢等特點。目前已有多種菌藥聯(lián)用增效組合的報道，將生物防治與化學(xué)防治相結(jié)合，不但能控制病害，而且降低化學(xué)藥劑使用濃度。該策略在植物保護(hù)研究領(lǐng)域被廣泛研究，且取得了良好效果[13]。W.Saksirirat等[14]認(rèn)為代森錳鋅與木霉結(jié)合使用能有效地控制馬鈴薯莖腐病?？莶菅挎邨U菌與氟環(huán)唑聯(lián)用對禾谷鐮孢霉的增效作用，結(jié)果表明：菌藥聯(lián)用對禾谷鐮孢霉的最高抑菌活性可達(dá)74.44%，表現(xiàn)增效和持效作用[15]。牛贍光等[16]的研究表明，多菌靈對熒光假單胞桿菌P32的存活和定殖有一定的促進(jìn)作用，并提高了P32防治棉花黃萎病的效果。但是利用生防芽孢桿菌和化學(xué)藥劑協(xié)同防治小新殼梭孢引起的植物病害鮮有報道。為減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，延緩抗藥性，實現(xiàn)化學(xué)農(nóng)藥的減量增效，本研究將篩選具有對小新殼梭孢抑制作用的化學(xué)藥劑與解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)配，以期為防治病害提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

枯草芽孢桿菌菌株 BS（Bacillus subtilis）、貝萊斯芽孢桿菌BV（Bacillus velezensis）、解淀粉芽孢桿菌 BA（Bacillus amyloliquefaciens）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BM（Bacillus methylotrophicus）、小新殼梭孢NP（Neofusicoccum parvum）均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理實驗室提供，分離自四川廣安前鋒區(qū)欒樹苗圃的兩年生健康欒樹。發(fā)病欒樹采自于四川廣安前鋒區(qū)欒樹苗圃兩年生苗木；盆栽欒樹采購自成都市眾鑫丹桂苗木專業(yè)合作社一年生苗木?；|(zhì)為市銷營養(yǎng)土和自然土按1∶2混勻。50%多菌靈（四川國光農(nóng)化股份有限公司），50%咪鮮胺（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份公司），30%甲霜-噁霉靈（河南省開封市浪潮化工有限公司），40%菌核凈（浙江斯佩斯植保有限公司），80%代森錳鋅（鄭州宏順化工產(chǎn)品有限公司），80%?！じｄ\（山東東合生物科技有限公司），78%波爾多-錳鋅（美國仙農(nóng)有限公司），農(nóng)泰樂70%丙森鋅可濕性粉劑（江蘇利民化工股份有限公司），66.5%霜霉威鹽酸鹽（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司），47%春雷王銅（陜西麥可羅生物科技有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基及發(fā)酵液制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL）；LB 培養(yǎng)基（酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、胰蛋白酶10 g）。使用100 mL LB培養(yǎng)液培養(yǎng)芽孢桿菌菌株24 h得到發(fā)酵液。

1.3 4種芽孢桿菌對病原菌的室內(nèi)抑菌篩選

1.3.1 芽孢桿菌菌懸浮液抑菌效果

取芽孢桿菌發(fā)酵液，離心去掉上清液，菌體重新用無菌水懸浮使菌體濃度達(dá)到1×107cfu/mL。選用對峙平板法[17]測定芽孢桿菌對病原菌的抑菌效果，根據(jù)菌體懸浮液抑菌效果篩選出抑菌率具有顯著高的芽孢桿菌。抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌塊直徑）×100%。

1.3.2 芽孢桿菌發(fā)酵液無菌上清液抑菌效果

挑取芽孢桿菌發(fā)酵液，離心，將上清液移到新的無菌離心管，去掉菌體，上清液反復(fù)經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾除去殘余菌體，制成無菌上清液。采用瓊脂擴(kuò)散法[18]測定抑菌效果。抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌塊直徑）×100%。

1.3.3 芽孢桿菌粗提取物的抑菌效果

向無菌上清液加入硫酸銨鹽析[19]（飽和度30%、40%、50%、60%、70%），攪拌均勻，4℃放置 48 h，雙層濾紙過濾后，用去離子水溶解沉淀，再反復(fù)經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾滅菌，濾液用于檢測抗菌活性。收集所有經(jīng)過微孔濾膜過濾的溶液，將收集好的溶解加入甲醇旋渦攪拌混勻，在4℃，6 000 r/min下離心10 min，去掉硫酸銨鹽分沉淀，即得粗提取物。粗提取物采用紫外吸收法（OD280）測定濃度[20]。粗提取物經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液用于抗菌活性檢測，測定抑菌率。

1.4 化學(xué)殺菌劑對小新殼梭孢的室內(nèi)毒力篩選[21]

采用生長速率法[22]測定殺菌劑對小新殼梭孢菌絲生長的抑制率。將供試藥劑分別稀釋：5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L 用于試驗濃度梯度，多菌靈試驗濃度設(shè)計為 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/L。采用十字交叉法[23]測定各處理的菌落直徑，并通過抑菌率計算EC50值[24]、P值。比較毒力大小及抑菌效果，篩選最佳抑菌效果的藥劑作為后續(xù)利用。

1.5 化學(xué)殺菌劑與芽孢桿菌混合搭配對病原菌的室內(nèi)篩選

1.5.1 化學(xué)殺菌劑對芽孢桿菌菌株生長的影響

以化學(xué)殺菌劑50 mg/L濃度為母液，將母液藥劑配制成含藥 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/L 的 LB液體培養(yǎng)基200 mL。根據(jù)1.3篩選結(jié)果，將目標(biāo)芽孢桿菌懸液50 μL接入含化學(xué)藥劑LB液體培養(yǎng)基中，25℃，150 rpm/min培養(yǎng)24 h。經(jīng)過含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)之后，芽孢桿菌懸浮液OD600值[25]。

1.5.2 聯(lián)合毒力測定

以測定殺菌劑和粗提物有效中量EC50值為基礎(chǔ)，配制50倍母液Wadley法確定復(fù)配比例混合單劑成為復(fù)合劑[26]，設(shè)計殺菌劑與粗提物（V殺菌劑∶V粗提物）復(fù)配比例為2∶0、1∶1、1∶2、1∶4、2∶1、4∶1、5∶1、7∶1、0∶2。制成含復(fù)合劑的PDA培養(yǎng)基，使培PDA養(yǎng)基中復(fù)合劑體積濃度為2.00%。同時分別設(shè)計以殺菌劑和粗提物EC50值為基礎(chǔ)的單劑抑菌率試驗，單劑試驗按在復(fù)合配比中所占有的比例進(jìn)行試驗，用十字交叉法測定各處理的菌落直徑，并計算實際抑菌率，采用Horsfall方法[27]評價復(fù)配聯(lián)合毒力作用。

1.6 欒樹枝枯病盆栽防治試驗

采用傷口接種法[28]檢測欒樹枝枯病防治效果。在欒樹苗木枝干需要劃傷處作標(biāo)記，用無菌水洗凈并用酒精棉消毒后，滅菌刀片在標(biāo)記處橫縱交叉劃傷造成輕微傷口；將生長3 d的菌餅接種到傷口處，保鮮膜包裹紗布保濕，每隔2 d揭開紗布不揭開保鮮膜觀察是否需要更換菌餅，常規(guī)管理。苗木發(fā)病后，依次用篩選出來的化學(xué)殺菌劑（4 mg/L）、芽孢桿菌發(fā)酵液（OD600為1.522）、芽孢桿菌粗提取物（OD600為 0.079）、復(fù)合劑（100%）、蒸餾水（CK）涂布處理發(fā)病部位，30 d后記錄發(fā)病情況、計算病情指數(shù)和防治效果（表1）。

表1 枝干病害分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Classification criteria of branch diseases

病情指數(shù)=［∑（病級株數(shù)×代表數(shù)值）］/（株數(shù)總和×發(fā)病最重等級的代表數(shù)值）

防治效果=[對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)]/對照病情指數(shù)×100%

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用origin2018和SPSS 22.0軟件分析處理，LSD 法做多重比較分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種芽孢桿菌對病原菌抗菌效果的室內(nèi)篩選

2.1.1 芽孢桿菌菌懸液的室內(nèi)抑菌篩選

初步篩選結(jié)果如表2所示，枯草芽孢桿菌的抑菌率為41.65%，顯著低于其他菌株。因此通過菌體對小新殼梭孢的抑菌率篩選貝萊斯芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進(jìn)入下階段篩選。

表2 4種芽孢桿菌懸浮液對病原菌抑菌率Table 2 The antifungal rate of four Bacillus suspensions to pathogen（5 days）

2.1.2 無菌上清液對枝枯病菌的抑菌效果

如圖1顯示3種菌的抑菌率隨著培養(yǎng)時間的推移，抑菌率先上升再下降。貝萊斯芽孢桿菌培養(yǎng)液的抑制率總是小于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)液對小新殼梭孢的抑制作用明顯，篩選出甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進(jìn)入下一個階段。

圖1 無菌上清液對病原菌的抑菌率隨時間變化趨勢圖Figure 1 Trend chart of antibacterial rate of sterile supernatant with time

2.1.3 粗提取物篩選

試驗發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌經(jīng)過硫酸銨沉淀之后的培養(yǎng)液所含的非蛋白類對小新殼梭孢無抗菌活性（抑菌率為0），而蛋白類提取物質(zhì)對小新殼梭孢具有抑制效果（表3），且解淀粉芽孢桿菌粗提取物抑菌率顯著高于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌粗提取物（Sig＜0.05），說明解淀粉芽孢桿菌的蛋白類代謝物對小新殼梭孢的抑菌能力強(qiáng)于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。因此，選擇解淀粉芽孢桿菌作為篩選之后的拮抗菌菌株。

表3 芽孢桿菌蛋白類代謝物在不同硫酸銨濃度沉淀下對病原菌的獨(dú)立性檢驗Table 3 Independence test of two bacillus protein metabolites under different ammonium sulfate concentrations for pathogens

2.2 化學(xué)殺菌劑對小新殼梭孢的室內(nèi)毒力篩選

在10種化學(xué)藥劑對小新殼梭孢毒力試驗中（表4），50%多菌靈可濕性粉劑EC50值最小，抑菌效果最佳，其次是50%咪鮮胺-錳鋅可濕性粉劑，且EC50值相差較小。毒力效果較差的是40%菌核凈可濕性粉劑和80%代森錳鋅可濕性粉劑；80%福-福鋅可濕性粉劑、78%波爾多-錳鋅可濕性粉劑和70%丙森鋅可濕性粉劑對病原菌基本沒有毒力作用，EC50值超過100 mg/L。毒力回歸方程斜率B值與病原菌對藥劑的敏感性成正相關(guān)關(guān)系，47%春雷王銅可濕性粉劑和66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑毒力試驗B為負(fù)值，在毒理學(xué)上不成立，對小新殼梭孢毒力試驗所測得的EC50值也不成立，對小新殼梭孢沒有抑菌效果。B值最大為40%菌核凈可濕性粉劑約2.185，但40%菌核凈可濕性粉劑EC50較大不適合作為小新殼梭孢的防治藥物。50%多菌靈可濕性粉劑EC50小于50%咪鮮胺-錳鋅 EC50，B值高于50%咪鮮胺-錳鋅，說明小新殼梭孢對50%多菌靈可濕性粉劑的敏感度增強(qiáng)幅度強(qiáng)于50%咪鮮胺-錳鋅。因此根據(jù)化學(xué)藥劑毒力測試篩選結(jié)果，50%多菌靈可濕性粉劑適合作為小新殼梭孢化學(xué)防治藥劑選擇。

表4 10種化學(xué)藥劑對小新殼梭孢的毒力效果Table 4 Toxicity of 10 fungicides to Neofusicoccum parvum

2.3 化學(xué)殺菌劑與芽孢桿菌混合搭配對病原菌的室內(nèi)篩選

2.3.1 多菌靈對解淀粉芽孢桿菌生物相容性

經(jīng)過含藥LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h之后，含藥培養(yǎng)基渾濁，對照組澄清，即解淀粉芽孢桿菌與多菌靈有良好的生物相容性，經(jīng)過分光光度計測定每個含藥培養(yǎng)基OD600值，各個培養(yǎng)基菌液OD600均在1.027～1.037之間（表5），各個多菌靈藥劑濃度對解淀粉芽孢桿菌生長速度沒有影響。多菌靈和解淀粉芽孢桿菌可以共存并沒有出現(xiàn)抑制生長速度的情況，所以多菌靈和解淀粉芽孢桿菌可以相互混合搭配。

表5 解淀粉芽孢桿菌在含藥LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h OD600值Table 5 OD600values of Bacillus amyloliquefaciens cultured in drug-containing LB medium for 24 h

2.3.2 粗提物抗菌效果

解淀粉芽孢桿菌粗提物抑菌試驗結(jié)果顯示，當(dāng)粗提物濃度達(dá)到70 ml/L時，抑菌率達(dá)到50%以上，EC50值為68.0070mg/L。毒力回歸方程斜率為4.1034，該斜率大于多菌靈毒力回歸方程斜率值（1.205 7），則說明小新殼梭孢對粗提物敏感度高于對多菌靈的敏感度。

2.3.3 復(fù)配劑對病原菌的毒力測定

對于小新殼梭孢而言，復(fù)合劑實際抑菌率隨著配比比例的變化而變化，變化趨勢隨著多菌靈比例的提高而提高。當(dāng)V（多菌靈）∶V（粗提物）比例為1∶4和 1∶2時，IR＜1，屬于拮抗作用；比例為 1∶1到 7∶1時，IR＞1，則為加和作用，其中 5∶1是增效作用IR最大為1.222。

V（多菌靈）∶V（粗提物）為 5∶1 為優(yōu)選復(fù)配比例。

2.4 欒樹枝枯病的盆栽防治效果

欒樹枝枯病防治效果如表8所示，所選的藥劑對欒樹枝枯病防治表現(xiàn)出良好的防治效果，施加藥劑處理組無葉片枯萎現(xiàn)象，而對照組欒樹出現(xiàn)葉片缺水枯萎現(xiàn)象（圖2）。防治效果最佳為復(fù)合劑，復(fù)合劑處理組發(fā)病率為27.80%，病情指數(shù)均為15.62%，防治效果為81.99%，防治效果顯著高于其他防治試劑。接種防治試劑后欒樹發(fā)病明顯緩慢，對照組發(fā)病率高達(dá)為90.42%，病情指數(shù)71.43%顯著高于試驗組。粗提物防治效果低于多菌靈，而復(fù)合劑防治效果增強(qiáng)，多菌靈成分對防治效果起主導(dǎo)作用，解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物在防治起輔助作用。多菌靈在芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的輔助下，防治效果增強(qiáng)，防治效果所反映的效應(yīng)與室內(nèi)毒力試驗基本一致。

圖2 藥劑對欒樹枝枯病盆栽防治效果Figure 2 Prevention effect of fungicides on potting of Koelreuteria bipinnata branch withered disease

表6 解淀粉芽孢桿菌粗提物對病原菌的毒力測定Table 6 Toxicity of crude extract of Bacillus amyloliquefaciens to Neofusicoccum parvum

表7 復(fù)配劑對病原菌的毒力試驗Table 7 Toxicity test of compounding agents to pathogenic bacteria

表8 藥劑對欒樹枝枯病盆栽防治效果Table 8 Prevention effect of fungicides on potting of Koelreuteria bipinnata branch withered disease

3 討論

枝枯病是危害比較嚴(yán)重的一種枝干病害，能夠危害林木的主干、大枝和小的枝條，林木被枝枯病病原菌侵染以后，輕則樹皮腐爛，影響?zhàn)B分傳輸，重則整個枝條或者整棵樹死亡。枝枯病的防治方法包括增強(qiáng)樹勢或在秋天落葉后和春天萌芽前在枝干噴施藥劑預(yù)防；發(fā)病初期及時刮除病斑，并涂藥劑防護(hù)。當(dāng)前防治枝枯病的主要藥劑是化學(xué)殺菌劑，但是長期大量使用化學(xué)藥劑破壞生態(tài)的弊端不容忽視。本研究所篩選的解淀粉芽孢桿菌在其生長過程中能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，具有廣泛抑制真菌與細(xì)菌的功能，近年來解淀粉芽孢桿菌作為益生菌的應(yīng)用方面的研究與探索越來越多[29]，和其他生防菌一樣存在諸如防效不穩(wěn)定和商業(yè)化困難等問題。已有研究表明：化學(xué)藥劑有助于生防微生物克服包括病原菌在內(nèi)的自然環(huán)境中習(xí)居微生物的排斥作用，使其能夠順利地在各種土壤生態(tài)環(huán)境中定殖、繁殖，并形成優(yōu)勢種群，從而更好地發(fā)揮生物防治作用。兩種植物病害防治方式相協(xié)同可以相互補(bǔ)充各自的短處發(fā)揮各自的優(yōu)勢，增強(qiáng)防治效果[30]。

生防微生物與化學(xué)藥劑協(xié)同防治植物病害既能達(dá)到預(yù)期防治效果又能減少化學(xué)藥劑的使用，本試驗結(jié)果也證實了這種情況：利用50%多菌靈可濕性粉劑與解淀粉芽孢桿菌粗提物復(fù)配成新的復(fù)合劑，其中50%多菌靈可濕性粉劑與解淀粉芽孢桿菌粗提物復(fù)配比例為5∶1增效作用最強(qiáng)。盆栽試驗防治效果以復(fù)合劑最佳，復(fù)合劑防治效果為83.83%，顯著優(yōu)于單劑防治效果（粗提物防治效果66.14%；多菌靈防治效果74.98%）。單劑試驗中多菌靈單劑防治效果優(yōu)于芽孢桿菌代謝產(chǎn)物單劑，而復(fù)合劑因有芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的參與，不僅可以減少多菌靈藥劑的使用，還可以增強(qiáng)多菌靈殺菌效果，提高防治效果，即高效又降低環(huán)境污染。

盆栽試驗結(jié)果與室內(nèi)毒力試驗結(jié)果基本一致，但是這只是在室內(nèi)和盆栽進(jìn)行的試驗，大部分環(huán)境條件均可以通過人為控制，而自然條件是復(fù)雜多樣的、是不可控制的，因而在自然條件下，復(fù)合劑和藥劑單劑對欒樹枝枯病的防治效果要取得良好的效果還需要進(jìn)一步等待研究。本研究只針對欒樹枝枯病病原菌進(jìn)行了篩選復(fù)配對應(yīng)的藥劑，因此本試驗涉及的其他芽孢桿菌如甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是否也能與多菌靈或其他殺菌劑進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配后是否也能提高防治效果；多種芽孢桿菌是否能與殺菌劑復(fù)配等問題，以及關(guān)于如何增強(qiáng)菌藥聯(lián)用后芽孢桿菌拮抗代謝物質(zhì)對靶標(biāo)病原菌的抑菌活性，也將成為下一步研究的關(guān)鍵。通過研究其菌藥聯(lián)合增效機(jī)制，可以更清楚地了解如何使二者達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)，發(fā)揮多位點、多途徑的特點，從而達(dá)到減少化學(xué)藥劑用藥量、增強(qiáng)防效的目的。