人源JAZF1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)胚胎癌細(xì)胞凋亡的影響

陳 倩，李 超，楊誠(chéng)誠(chéng)，母 彬，龔 歡，黃 超

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室，成都 611130）

鋅指蛋白（zincfinger protein，ZNF）屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具備特別的鋅指模體結(jié)構(gòu)，具有種類多、存在普遍性的特征。鋅指并列基因1（Juxtaposed With AnotherZincfingerGene1，JAZF1）又稱 ZNF802、Tip27，其相對(duì)分子質(zhì)量約為2.7×104，屬于鋅指核蛋白，在小鼠和人中有著較高的保守性[1]。研究者們發(fā)現(xiàn)JAZF1基因作為睪丸孤核受體（testicular orphan nuclear receptor 4，TR4）的競(jìng)爭(zhēng)抑制型調(diào)控因子[2]，對(duì)雄性哺乳動(dòng)物的生殖活動(dòng)調(diào)控作用重大[3-4]；全基因組關(guān)聯(lián)研究已確定JAZF1與糖脂代謝的關(guān)系[5-7]；亦有少量研究表明，JAZF1參與甲狀腺乳頭狀癌[8-9]、非病毒性肝細(xì)胞癌[10]、前列腺癌[11]等腫瘤的進(jìn)展。然而JAZF1對(duì)胚胎癌發(fā)展的影響仍未可知。

胚胎癌（embryonal carcinoma，EC）由生殖細(xì)胞前體發(fā)育異位產(chǎn)生，具有胚胎發(fā)育多能性，是各種腫瘤中唯一具有野生型基因組的非典型惡性腫瘤[12]。胚胎癌主要發(fā)生于人體性腺或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等人體中線等部位[13-14]。EC或具有EC成分的生殖細(xì)胞腫瘤常見(jiàn)于20～35歲的年輕人，也可發(fā)生于數(shù)月至2歲大的嬰幼兒。其惡性程度往往高于其他生殖細(xì)胞腫瘤成分，5年生存率僅為44%[15]。由于EC較為罕見(jiàn)，臨床病理特點(diǎn)復(fù)雜，目前鮮見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。NCCIT是代表EC腫瘤的細(xì)胞系之一[16]，具有與胚胎干細(xì)胞相似的基因表達(dá)譜，原則上可以分化為幾乎所有的組織譜系，能作為研究初期胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生的優(yōu)良模型[17]。綜上所述，JAZF1作為新發(fā)現(xiàn)的多功能基因，研究者對(duì)其了解較少，而JAZF1對(duì)胚胎癌的影響更是鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)主要通過(guò)構(gòu)建pRK5-myc-JAZF1重組質(zhì)粒，初步了解JAZF1在NCCIT細(xì)胞生存中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步研究JAZF1基因在胚胎癌中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制提供基本依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

人胚胎癌細(xì)胞NCCIT購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。pRK5-myc質(zhì)粒、大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α、DNA Marker DL5000、限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ、限制性核酸內(nèi)切酶NotⅠ、PrimeSTAR Max預(yù)混合物（2×）、10×QuickCut Green緩沖液、RNAiso Plus、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（TliRnaseH Plus）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）、TransEasyTM轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司。DAPI封閉劑購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒（E.Z.N.A.Gel Extraction Kit）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。RNA抽提試劑盒購(gòu)自Invitrigen公司。質(zhì)粒抽提試劑盒（Plasmid Mini KitⅠ）購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

借助GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載JAZF1基因（Gene ID：221895），利用引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)JAZF1基因特異的PCR引物，上游引物為5’-CATATATACG CGTCGACTATGACAGGCATCGCC-3’，下游引物為5’-TTGCGGCCGCTTATTGCTGCATCTTCCTGATA-3’。IL1-β上下游引物分別為5’-ACCAAACCTCTT CGAGGCAC-3’和 5’-CGAGCTCAGGTACTTCTGCC-3’、IL8上下游特異性引物分別為5’-AGCCAGATG CAATCAATGCC-3’和 5’-AATTTCTGTGTTGGCGCA GTG-3’、TGF-β 上下游特異性引物分別為 5’-AAGGACCTCGGCTGGAAGTG-3’和 5’-CCCGGGCC ATGCTGGTTGTA-3’。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 擴(kuò)增目的基因片段

使用RNA抽提試劑盒從NCCIT細(xì)胞中抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后用PCR儀擴(kuò)增JAZF1基因。在1%濃度的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，分離PCR產(chǎn)物，與DNA Marker DL2000比較，篩選出長(zhǎng)度約為850 bp、濃度較高、特異性強(qiáng)的產(chǎn)物，割取對(duì)應(yīng)條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

1.4 構(gòu)建pRK5-myc-JAZF1重組質(zhì)粒并測(cè)序

用SalⅠ、NotⅠ對(duì)膠回收產(chǎn)物和pRK5-myc質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行膠回收，用T4連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRK5-myc-JAZF1，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli DH5α感受態(tài)中。挑斑，接種到LB培養(yǎng)液（內(nèi)含氨芐青霉素）中擴(kuò)增，并用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用NotⅠ和SalⅠ雙酶切篩選出濃度較高的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，送往擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 轉(zhuǎn)染NCCIT細(xì)胞

將NCCIT細(xì)胞培養(yǎng)于含DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)視野的2/3左右時(shí)，將重組質(zhì)粒pRK5-myc-JAZF1和空載體pRK5-myc分別轉(zhuǎn)染至NCCIT細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染完畢后于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，4～6 h換液。培養(yǎng)36 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平

提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增這些cDNA，qRT-PCR（20μL）程序設(shè)置：95℃預(yù)變性2min；95℃變性10s，60℃退火30 s，共進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。設(shè)立內(nèi)參h-βactin，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子JAZF1及炎性因子IL1-β、IL8、TGF-β 的轉(zhuǎn)錄水平。

1.7 檢測(cè)NCCIT細(xì)胞凋亡情況

用多聚賴氨酸預(yù)處理6孔板中的蓋玻片，24 h后清除液體并鋪入細(xì)胞。細(xì)胞密度達(dá)到視野的2/3左右，即可轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRK5-myc-JAZF1，空載體pRK5-myc以同樣的方法轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組。36 h后吸出六孔板中的培養(yǎng)液并用PBS清洗，然后用DAPI染色封閉劑處理，封片完畢后，室溫避光放置24 h后觀察結(jié)果。

1.8 處理分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)

采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，采用作圖軟件Adobe Photoshop CS6處理圖片。P＜0.01為極顯著，在統(tǒng)計(jì)圖中以**表示；P＜0.05為顯著，以*表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 JAZF1基因擴(kuò)增結(jié)果

從人胚胎癌細(xì)胞NCCIT中提出RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板擴(kuò)增JAZF1序列。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道呈現(xiàn)約800 bp的單一明亮條帶（圖1），與預(yù)期JAZF1基因的條帶大小幾乎一致。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

仔細(xì)挑取單菌落，經(jīng)擴(kuò)增后提取質(zhì)粒。用SalⅠ和NotⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳顯示2條線性條帶：一條為大小約800 bp的條帶（圖2），與預(yù)期的JAZF1片段大小基本相符，另一條為大小約5 000 bp的條帶，與pRK5-myc質(zhì)粒大?。? 000 bp）基本一致，表明目的基因與質(zhì)粒已成功連接；將所測(cè)序列與GenBank中JAZF1基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果證實(shí)插入的DNA片段與人源JAZF1基因的編碼序列完全一致（圖3）。證明成功將JAZF1基因重組到pRK5-myc質(zhì)粒上，構(gòu)建了人源JAZF1真核表達(dá)質(zhì)粒。

圖2 pRK5-myc-JAZF1重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖Figure 2 Electrophoretogram of recombinant plasmid pRK5-myc-JAZF1 using double enzyme digestion

圖3 pRK5-myc-JAZF1重組質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果Figure 3 Sequencing results of recombinant plasmid pRK5-myc-JAZF1

2.3 qRT-PCR檢測(cè)JAZF1基因及炎性因子mRNA表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRK5-myc-JAZF1的NCCIT細(xì)胞中，JAZF1的mRNA表達(dá)水平極顯著升高（圖4A），證實(shí)了重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCCIT細(xì)胞后極顯著上調(diào)了JAZF1基因的轉(zhuǎn)錄水平。檢測(cè)過(guò)表達(dá)JAZF1基因的NCCIT細(xì)胞中炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)JAZF1基因后，促炎因子IL1-β和IL8的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降（圖4B-C），而抑炎因子TGF-β的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯改變（圖4D），這提示JAZF1的過(guò)表達(dá)在NCCIT細(xì)胞中具有抑炎作用。

圖4 JAZF1基因及炎性因子mRNA表達(dá)水平（n=3）Figure 4 mRNA level of JAZF1 and inflammatory factor（n=3）

2.4 過(guò)表達(dá)JAZF1基因?qū)CCIT細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染后，兩組細(xì)胞均發(fā)生不同程度的凋亡，其中轉(zhuǎn)染空載體的NCCIT細(xì)胞存活更多（圖5），而轉(zhuǎn)染pRK5-myc-JAZF1的NCCIT細(xì)胞出現(xiàn)了包括染色加深、染色質(zhì)固縮和大量細(xì)胞核裂解等現(xiàn)象在內(nèi)的更明顯的凋亡（圖6）。隨機(jī)選取7個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)并比較細(xì)胞凋亡率（圖7），結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)JAZF1基因的NCCIT細(xì)胞凋亡率更高（P＜0.01），表明上調(diào)JAZF1基因的轉(zhuǎn)錄水平能促進(jìn)NCCIT細(xì)胞凋亡。

圖5 轉(zhuǎn)染空載體組的細(xì)胞凋亡情況（n=7）Figure 5 Apoptosis in the empty vector group（n=7）

圖6 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡情況（n=7）Figure 6 Apoptosis in the recombinant plasmid group（n=7）

圖7 空載體組和重組質(zhì)粒組的細(xì)胞凋亡率情況（n=7）Figure 7 Cell apoptosis rate in empty group and transfected pRK5-myc-JAZF1 recombinant plasmid group（n=7）

3 討論

近些年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們相繼對(duì)JAZF1展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)JAZF1基因作為廣泛表達(dá)于機(jī)體的核轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究[18-21]表明過(guò)表達(dá)JAZF1基因能夠抑制 TNF-α、IFN-γ、MCP-1 及 IL17 等促炎因子的表達(dá)及釋放，并相應(yīng)上調(diào)IL4等抑炎因子的相對(duì)表達(dá)量。我們的研究結(jié)果與先前的報(bào)道相符，初步證實(shí)JAZF1在NCCIT細(xì)胞中的抑炎作用，說(shuō)明JAZF1在抑制機(jī)體炎癥中發(fā)揮重要作用。

此外，JAZF1能影響細(xì)胞增殖和凋亡，這能對(duì)腫瘤進(jìn)展及細(xì)胞損傷性疾病等發(fā)揮重要作用。K.Bae等[22]發(fā)現(xiàn)上調(diào)JAZF1基因轉(zhuǎn)錄水平會(huì)引起心力衰竭癥狀。Huang L.等[9]發(fā)現(xiàn) JAZF1 可以抑制 TAK1/NF-κB通路，從而誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞BCPAP凋亡，影響細(xì)胞增殖，提示JAZF1可作為甲狀腺乳頭狀癌的分子標(biāo)記。本試驗(yàn)的體外研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)JAZF1后，NCCIT細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮、核碎裂和核溶解等典型的凋亡形態(tài)，核內(nèi)可見(jiàn)濃染的藍(lán)色顆粒狀強(qiáng)熒光。過(guò)表達(dá)JAZF1后，NCCIT細(xì)胞的凋亡率為12.5%，極顯著大于轉(zhuǎn)染pRK5-myc的空載體對(duì)照組，證實(shí)過(guò)表達(dá)JAZF1可促進(jìn)NCCIT細(xì)胞凋亡，從而抑制胚胎癌增殖。

許多研究闡述了炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間存在的相關(guān)性[12]。例如慢性肝炎能誘發(fā)肝癌，NF-κB信號(hào)通路是得到證實(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[23]；遺傳性顯性等位基因突變引發(fā)的家族性胰腺炎會(huì)引發(fā)胰腺癌[24]；而阻斷炎癥細(xì)胞內(nèi)的IKK信號(hào)通路可以有效抑制結(jié)腸癌的形成等[12]。試驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)JAZF1能夠明顯抑制促炎因子IL1-β、IL8的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)NCCIT細(xì)胞凋亡，推測(cè)JAZF1可能通過(guò)抑制炎癥的發(fā)生來(lái)促進(jìn)NCCIT細(xì)胞凋亡，從而抑制胚胎癌進(jìn)展。許多研究者對(duì)JAZF1在炎癥和癌癥等方面的作用機(jī)制開(kāi)展研究，Huang L.等[8]研究推測(cè)JAZF1通過(guò)調(diào)節(jié)睪丸孤兒核受體TR4來(lái)激活NF-κB信號(hào)通路，從而在甲狀腺癌中發(fā)揮作用。胡文靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)JAZF1直接或間接抑制高脂誘導(dǎo)的小鼠肝組織p38 MAPK、JNKs和NF-κB激酶的激活程度，從而抑制促炎因子IL-8、MCP-1及TNF-α的產(chǎn)生。Sung Y.等[25]發(fā)現(xiàn)JAZF1通過(guò)調(diào)節(jié)JNK/Slug信號(hào)來(lái)促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。盡管獲得了上述結(jié)果，但JAZFl所在的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及抑制胚胎癌增殖的具體作用機(jī)制尚不明確，亟待下一步深入研究證實(shí)。

4 結(jié)論

構(gòu)建了人源轉(zhuǎn)錄因子JAZF1真核表達(dá)載體。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JAZF1的過(guò)表達(dá)具有抑炎作用，并對(duì)NCCIT細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，暗示JAZF1可能通過(guò)抑制促炎因子IL1-β和IL8表達(dá)來(lái)抑制炎癥，進(jìn)而抑制胚胎癌的進(jìn)展。