土壤微塑料殘留對大豆幼苗生長及生理生化特征的影響

安 菁，劉歡語，鄭 艷，程 俊，宋 春*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

我國是農(nóng)業(yè)大國，累積農(nóng)膜使用量已超過250萬t[1]。大塊的農(nóng)膜經(jīng)破碎、風(fēng)化等一系列作用逐漸變?yōu)榱捷^小的塑料碎片，最終以微塑料的形式滯留在土壤中[2]。由于含微塑料有機(jī)廢物的循環(huán)利用以及塑料地膜的大量使用，農(nóng)業(yè)土壤中積累的微塑料積累量實(shí)際上比水域生態(tài)系統(tǒng)更多[3-4]。Zhang G.S.等[5]于2016年調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國西南地區(qū)土壤團(tuán)聚體中微塑料的平均豐度為18 760個(gè)/kg土壤，其中粒徑＜1 mm的微塑料豐度最高，且塑料顆粒在耕地土壤中的積累日益增長。

研究表明，微塑料具有高疏水性和較大的比表面積，其在環(huán)境中通常難以降解，對環(huán)境的危害主要表現(xiàn)為以下兩方面：一是通過生態(tài)循環(huán)進(jìn)入生物體引起細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、氧化應(yīng)激及損傷和行為異常等生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致生物死亡；二是吸附周圍環(huán)境污染物和病原體，通過食物鏈傳遞、富集，對生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成威脅[6]。土壤環(huán)境中微塑料的殘留會(huì)通過一系列物理和化學(xué)作用抑制土壤微生物的活性，進(jìn)而對植物生長發(fā)育造成一定影響[7-8]。目前國內(nèi)外對微塑料生理毒性的研究多集中于水體動(dòng)物，對陸地植物的影響研究剛剛起步[9]，關(guān)于土壤微塑料殘留對高等植物生長脅迫及植物對此作出的抗性反應(yīng)鮮見報(bào)道。本研究通過向土壤中添加聚氯乙烯微塑料顆粒，分析土壤微塑料不同殘留量下大豆苗期生長發(fā)育及生理生化特征，旨在探討農(nóng)田土壤微塑料殘留對農(nóng)作物的生態(tài)毒理效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2019年5月—6月在日光型人工氣候室（白天溫度25℃，夜晚溫度20℃，相對濕度60%）內(nèi)進(jìn)行。供試土壤采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地，土壤基本理化性狀如表1所示。供試大豆品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N南豆12，由四川省南充市農(nóng)科院提供。微塑料材質(zhì)為粒徑＜15 μm的PVC顆粒，以下簡稱mPVC，購自東莞市靜天塑料原料有限公司。盆栽試驗(yàn)栽培盆子尺寸為40 cm×22 cm×11 cm，每盆裝風(fēng)干土10 kg。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil tested

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理，即對照（CK），以田間農(nóng)膜殘留量151 kg/hm2[5]為依據(jù)，換算為盆栽微塑料添加量為 0.054 g/kg，CK 的 10倍（T1）、30倍（T2）和 50 倍（T3），微塑料添加量分別為 0.54、1.62和2.70 g/kg土壤。每個(gè)處理重復(fù)3次。每盆播種大豆12粒（定植9株），出苗后每日觀察苗情長勢及土壤水分，用噴壺灌溉補(bǔ)充水分，保證土壤水分充足。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 株高、葉面積、根鮮重的測定

分別于大豆出苗后第7、14和21天測定株高，并進(jìn)行破壞性取樣，每次每盆取3株植物樣。將大豆植株分為地上部和地下部。采取主莖或主枝頂部新長成的健壯葉或功能葉采用數(shù)格子法[10]測定葉面積。將根系用自來水清洗干凈，用吸水紙吸出多余水分，測定根鮮重。

1.3.2 根系活力的測定

采用-萘胺法[11]測定植物根系活力。

1.3.3 葉綠素含量

采用分光光度法[12]，用乙醇提取植物葉片中的葉綠素，根據(jù)Lambert-Beer定律在645、663 nm波長下測得植物葉片葉綠素a、葉綠素b含量。

1.3.4 葉片SOD、POD和CAT活性、MDA和可溶性蛋白含量的測定

采用四氮唑藍(lán)（NBT）法[13]測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚顯色法[13]測定過氧化物酶（POD）活性，紫外分光光度法[13]測定過氧化氫酶（CAT）活性；在酸性高溫條件下采用硫代巴比妥酸（TBA）法[14]測定中丙二醛（MDA）含量；用常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)（G-250）法[15]測定可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微塑料對大豆植株形態(tài)的影響

不同微塑料殘留量土壤中大豆的葉面積、株高和根鮮重如圖1所示。大豆出苗后第7天，與CK相比，處理 T1、T2和 T3的葉面積均顯著降低（P＜0.05），分別降低了6.2%、12.7%和9.9%；處理T2和T3的株高分別降低了6.4%和16.5%（P＜0.05）；處理T3的根鮮重降低了21.5%（P＜0.05）。大豆出苗后第14天，與CK相比，處理T2和T3的葉面積分別降低了17.6%和 25.4%（P＜0.05）；處理 T1、T2和 T3的株高分別降低了 17.1%、14.3% 和 21.8%（P＜0.05）；處理 T2和 T3的根鮮重分別降低了18.3%和25.4%（P＜0.05）。出苗后第21天，處理T1、T2和T3的大豆葉面積、株高和根鮮重與CK相比，均無顯著差異。

圖1 微塑料對大豆幼苗生長發(fā)育的影響Figure 1 Effects of microplastics on growth and development of soybean seedlings

2.2 微塑料對大豆苗期根系活力的影響

根系是植物活躍的吸收器官和合成器官。根的生長情況和代謝水平即根系活力直接影響大豆地上部分的生長、營養(yǎng)狀況，是植物生長的重要生理指標(biāo)之一。微塑料添加量的增加對大豆根系活力均表現(xiàn)出一定的抑制作用（圖2），其中，在大豆出苗后第7天和第21天，T3處理根系活力顯著低于CK，分別降低了2.7%、2.2%；大豆出苗后第14天，與CK相比，處理T1、T2和T3的根系活力分別降低了1.8%、1.7%和 1.3%（P＜0.05）。

圖2 微塑料對大豆幼苗根系活力的影響Figure 2 Effect of microplastics on root vitality of soybean seedlings

2.3 微塑料對大豆葉綠素的影響

由圖3可以看出，大豆出苗后第7天，處理T1、T2和T3的葉綠素a/b值與CK相比，均無顯著差異（圖3A）；處理T1、T2和T3的葉綠素含量（葉綠素a與葉綠素b之和）顯著高于CK（P＜0.05），分別增加了5.2%、4.6%和5.6%（圖3B）。出苗后第14天，處理 T1、T2和 T3的葉綠素含量顯著低于 CK（P＜0.05），分別降低了3.2%、8.5%和2.5%（圖3B）。出苗后第21天，處理T1和T3的葉綠素a/b值顯著低于CK（P＜0.05），分別降低了 13.3%和 12.7%（圖 3A）；處理T1的葉綠素含量與CK相比，降低了13.5%（P＜0.05）（圖 3B）。

圖3 微塑料對大豆幼苗葉綠素a/b（A）和葉綠素含量（B）的影響Figure 3 Effect of microplastics on chlorophyll a/b(A)and chlorophyll content(B)in soybean seedlings

2.4 微塑料對大豆抗氧化能力的影響

植物抗氧化能力的強(qiáng)弱體現(xiàn)了其受外界逆境影響的程度。不同mPVC含量對大豆葉片抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性以及膜質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）和細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白）含量均造成了一定程度的影響（圖4、圖5）。大豆出苗后第7天，處理T1、T2和T3的大豆葉片SOD活性顯著提升（圖4A），較CK分別升高了52.4%、67.0%和91.1%（P＜0.05）。大豆出苗后第 14天，處理 T2和T3的SOD活性較第7天降低了近1/2，但仍顯著高于CK（P＜0.05）。大豆出苗后第21天，所有處理大豆SOD活性進(jìn)一步降低，但處理T1、T2和T3的SOD活性仍然顯著高于CK，較CK分別升高了14.8%、18.6%和24.6%（P＜0.05）。POD活性隨著生育時(shí)期的延長呈逐漸升高趨勢（圖4B）。出苗后第7天和第21天，處理T1、T2和T3的大豆葉片POD活性顯著高于CK，且隨土壤微塑料含量增加而增加。CAT活性在3個(gè)采樣時(shí)期呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢（圖4C），同一取樣時(shí)期，處理間表現(xiàn)出隨土壤微塑料含量增加先升高后降低的趨勢，T2處理大豆葉片CAT活性最高。

圖4 微塑料對大豆幼苗超氧化物歧化酶（A）、過氧化物酶（B）和過氧化氫酶（C）活性的影響Figure 4 Effects of microplastics on the activity of SOD(A)，POD(B)and CAT(C)in soybean seedlings

除出苗后第14天時(shí)T3處理的MDA含量與CK無顯著差異外（圖5A），處理T1、T2和T3在大豆出苗后第7、14和21天的MDA含量均顯著低于CK（P＜0.05）。值得關(guān)注的是，在出苗后第7天，隨著微塑料添加量的增加，大豆葉片的MDA含量呈梯度下降趨勢，處理T1、T2和T3較對照CK分別降低了23.5%、34.1%和37.9%。

由圖5B可知，大豆出苗后第7天，處理T1、T2和T3的可溶性蛋白含量與CK均無顯著差異。大豆出苗后第14天，處理T1的可溶性蛋白含量顯著低于CK（P＜0.05）。在出苗后第21天，處理T2大豆葉片的可溶性蛋白含量顯著高于CK和T1（P＜0.05），高濃度處理T3大豆葉片可溶性蛋白含量顯著低于CK、T1和 T2處理（P＜0.05）。

圖5 微塑料對大豆幼苗丙二醛（A）和可溶性蛋白（B）含量的影響Figure 4 Effects of microplastics on the contents of malondialdehyde(A)and soluble protein(B)in soybean seedlings

3 討論與結(jié)論

微塑料是一種全球性的污染物，它們小到可以被多種生物吸收，甚至可以跨越一些生物屏障。在水生系統(tǒng)中，微塑料已經(jīng)成為藻類、苔蘚蟲、甲藻、等足類、海洋蠕蟲和微生物的浮動(dòng)棲息地[16]，并通過食物鏈傳遞對水生生物造成毒害。然而，目前有關(guān)微塑料對土壤-植物系統(tǒng)毒性的研究報(bào)道較少，其對陸地植物的作用機(jī)理也尚不清楚[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨土壤中微塑料含量的增加，大豆苗期的表觀生長呈現(xiàn)出脅迫現(xiàn)象，這與Qi Y.L.等[18]發(fā)現(xiàn)塑料殘留物對農(nóng)作物的生長造成不良影響的結(jié)果一致。徐榮樂等[19]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)膜殘留明顯阻礙了植物根系對必需營養(yǎng)元素和水分的吸收，導(dǎo)致植物新陳代謝的需求得不到滿足。本研究中，高梯度微塑料添加量處理下，大豆根系活力明顯受到抑制；盡管中低濃度處理下不良影響效應(yīng)減小，但仍低于空白對照。G.Kalˇíková 等[20]發(fā)現(xiàn) 30～600 μm 的 PE 微珠可以通過機(jī)械阻斷對浮萍的根系生長造成顯著影響。環(huán)境中的微塑料顆粒形狀各異、邊緣粗糙，可能會(huì)對根尖造成如細(xì)胞壁破損等機(jī)械損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性從而導(dǎo)致根細(xì)胞活性降低，且這種機(jī)械損傷隨著微塑料濃度的增加會(huì)越來越嚴(yán)重[20]。由此推測本研究中15 μm mPVC可能是因?yàn)橥ㄟ^吸附在大豆根系細(xì)胞壁孔洞，擾亂根系對水分和養(yǎng)分的正常運(yùn)輸或吸收，從而導(dǎo)致大豆生長受抑。

葉綠素是植物光合過程的主要參與者，高等植物葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b兩種，它們在植物的生長代謝中不斷合成和分解。在不利條件下，葉綠素a/b值的變化可以理解為植物為抵御不良環(huán)境進(jìn)行的一種自我保護(hù)[21]。由圖3A可知，大豆出苗后第7天，各處理的葉綠素a/b值與對照CK無顯著差異，表明微塑料在短期內(nèi)對大豆幼苗光合效率影響不大，這與M.C.Alicia等[22]對浮萍的七天暴露試驗(yàn)研究結(jié)果一致。然而，通過對大豆出苗后第21天葉綠素含量的研究發(fā)現(xiàn)，各處理的葉綠素含量呈低抑制中高恢復(fù)的趨勢（圖3B），其原因可能是大豆對微塑料的吸附與吸收主要取決于微塑料顆粒本身的性質(zhì)[23]。在中高濃度下，微塑料不斷團(tuán)聚，團(tuán)聚后的微塑料顆粒粒徑逐漸增大、成為吸附的主要阻礙因素[24]，降低了大豆與微塑料的接觸性，從而減輕了其光合脅迫。

SOD、POD、CAT、MDA 和可溶性蛋白等生理生化參數(shù)可以作為反映植物對微塑料脅迫下毒理學(xué)反應(yīng)的良好指標(biāo)[25]。通常，如果生物體的活性氧（ROS）水平超過它的抗氧化活性，就會(huì)引起生物細(xì)胞脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂雙分子層塌陷、細(xì)胞扭曲變形，使細(xì)胞的物質(zhì)能量交換等生長代謝活動(dòng)受到影響[26]。Sun X.等[9]研究表明＜200 nm 的聚苯乙烯納米級塑料顆粒可被擬南芥根系吸收，導(dǎo)致根細(xì)胞中H2O2和O2-含量增加，對根系及地上部植株生長造成不良影響。為對抗ROS的不良影響，植物會(huì)產(chǎn)生一系列用于消除ROS的抗氧化酶和抗氧化劑[27]，其中超氧化物歧化酶（SOD）可催化超氧化物自由基，將其歧化為 H2O2和O2，是清除ROS的第一道防線，CAT和 POD能將H2O2歧化為 H2O和O2，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)。本研究中，微塑料濃度的升高在大豆出苗初期顯著提高了大豆體內(nèi)抗氧化酶SOD的活性（圖 4A），POD 和 CAT活性（圖 4B、4C）也隨土壤微塑料殘留量增加表現(xiàn)出升高的趨勢，因此促進(jìn)了大豆抗氧化系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)，從而減少了活性氧ROS的積累，降低外界的脅迫與毒害效應(yīng)。這與水體中無脊椎動(dòng)物在受到微塑料脅迫時(shí)激發(fā)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，從而減少氧化損傷的研究結(jié)果一致[28]。同時(shí)，大豆幼苗葉片中的MDA含量在出苗初期隨土壤微塑料濃度升高顯著下降（圖5A），說明上述大豆對土壤微塑料殘留脅迫表現(xiàn)出的氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕了其細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化程度。目前微塑料對高等植物的研究較少，但與微塑料類似，納米級金屬顆粒也存在對植物的潛在生理毒性，研究表明在菠菜葉面噴施納米TiO2顯著提高了植株SOD、POD等抗氧化酶含量，降低了氧化自由基和MDA含量[29]，與本研究表現(xiàn)出的趨勢相同。在大豆出苗中后期，葉片中SOD活性逐漸降低，CAT活性先升高后降低，這極有可能是因?yàn)殡S著幼苗的生長發(fā)育，大豆的生命力不斷增強(qiáng)、合成蛋白質(zhì)的速率逐漸加快（圖5B），產(chǎn)生了大量的營養(yǎng)物質(zhì)和酶來調(diào)節(jié)大豆的正常生理活動(dòng)[30]，致使土壤中微塑料顆粒對其脅迫作用減弱。盡管大豆自身的抗氧化系統(tǒng)能在一定程度上緩解土壤微塑料殘留帶來的生理毒性脅迫，但在高殘留濃度下，隨生育時(shí)期延長，大豆的根系活力與對照相比依舊顯著降低。

綜上所述，本研究結(jié)果表明中高濃度（1.62～2.70 g/kg）微塑料（15 μm mPVC）殘留土壤顯著抑制大豆幼苗的葉面積、株高和根鮮重（大豆出苗后第7天和第14天），隨著植株生長時(shí)間的延長（出苗后第21天），微塑料對大豆的生長影響逐漸減弱。高濃度（2.70 g/kg）mPVC顯著抑制大豆的根系活力。隨著mPVC添加量的升高，大豆幼苗體內(nèi)抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性升高，表明大豆可通過自身抗氧化酶體系的調(diào)解減輕微塑料造成的脅迫。但在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)加強(qiáng)對農(nóng)田中農(nóng)膜的回收，以減少土壤微塑料殘留量，降低其對農(nóng)作物生長發(fā)育的影響。