叢枝菌根真菌對(duì)鎘脅迫小麥幼苗解毒效應(yīng)的研究

王紅霞， 韓蕾蕾， 李陽(yáng)， 張樂(lè)樂(lè)， 李曉， 袁祖麗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，工業(yè)“三廢”的隨意排放，使得農(nóng)田土壤遭受到不同程度的重金屬污染[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)重金屬污染的土地面積約2 500萬(wàn)hm2，占耕地總面積的20%[2]，其中以鎘(Cadmium, Cd)的污染面積最大、最嚴(yán)重[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，中國(guó)農(nóng)田Cd污染面積已達(dá)1.33萬(wàn)hm2，每年生產(chǎn)Cd含量超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品達(dá)14.6億kg，且有日益加重的趨勢(shì)[4-5]。污染土壤中的Cd被植物根系吸收后，轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部可食用部位，不僅降低農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)，還可經(jīng)食物鏈富集到人體，嚴(yán)重危害人類健康[6]。Cd脅迫能誘導(dǎo)超氧陰離子等植物體內(nèi)活性氧((Reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生[7]，造成植物體內(nèi)生物大分子的氧化傷害[8-10]，導(dǎo)致植物損傷與死亡。小麥在世界各地廣泛種植，以其為主要糧食的人口占2/5[11]，是易吸收Cd的農(nóng)作物之一[12]。小麥子粒中的Cd含量超標(biāo)時(shí)有報(bào)道[13]，因此，減少土壤中Cd對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育造成的影響，提高小麥產(chǎn)量、品質(zhì)具有重要意義。叢枝菌根真菌是一種廣泛存在于陸地生態(tài)系統(tǒng)中的土壤真菌[14]。研究表明，叢枝菌根真菌能在一定程度上增強(qiáng)植物的抗逆性[15]，調(diào)節(jié)植株對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[16]，提高植物對(duì)重金屬的耐受能力[17]。叢枝菌根真菌分泌的球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(Glomalin-related soil protein, GRSP)可與土壤中的重金屬結(jié)合，降低重金屬的毒性[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在Cd污染的土壤中，每千克的GRSP對(duì)Cd的固定量可達(dá)1 120 mg[19]。植物螯合肽(Phytochelatin, PC)是一類富含半胱氨酸(Cys)的多肽家族[20]，通過(guò)與重金屬離子螯合并運(yùn)輸?shù)揭号輧?nèi)減少細(xì)胞質(zhì)中重金屬的含量，增強(qiáng)植物抵抗脅迫的能力[21]，Cd是PC的最強(qiáng)誘導(dǎo)者[22]。目前，如何減少土壤中Cd對(duì)植物造成的毒害，已有較多報(bào)道[23-25]，但接種叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥幼苗的解毒效應(yīng)尚不清楚。因此，以小麥和摩西球囊霉菌(Glomusmosseae，Gm)為材料，采用土培試驗(yàn)，研究Cd脅迫下接種叢枝菌根真菌對(duì)小麥幼苗解毒效應(yīng)的影響，為小麥栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥(TriticumaestivumL.)品種為百農(nóng)207，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心提供。叢枝菌根真菌為摩西球囊霉菌(Glomusmosseae，Gm)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

采用土培試驗(yàn)，營(yíng)養(yǎng)土按m(基質(zhì))∶m(蛭石)=3∶1的比例拌勻，高溫(121 ℃)滅菌30 min后自然晾干，供試基質(zhì)的主要成分為泥炭土，Cd的本底值為0.11 mg·kg-1。塑料杯用5 mL 75%乙醇消毒。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，未接菌組每個(gè)杯子裝入120 g營(yíng)養(yǎng)土，接菌組放入115 g營(yíng)養(yǎng)土和5 g菌種。小麥種子用3%過(guò)氧化氫浸泡消毒20 min，蒸餾水沖洗數(shù)次后浸泡30 min，待用。每杯播種36粒，覆土，澆水至杯子質(zhì)量250 g，并將杯子放置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件設(shè)置為16 h光照/8 h黑暗，溫度16～25 ℃，相對(duì)濕度80%，光照度0～100 μmol·m-2·s-1。待幼苗剛出土后，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)對(duì)脅迫組小麥幼苗進(jìn)行Cd脅迫處理，脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)依據(jù)《農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15618—2018)中關(guān)于管制值的基礎(chǔ)上定為5和10 mg·kg-1。此后每2 d澆灌不再含Cd的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液50 mL，每個(gè)處理重復(fù)5次。幼苗生長(zhǎng)至兩葉一心收獲。葉片用錫箔紙包裹迅速放液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of experiment

1.3 小麥葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率的測(cè)定

植物組織中超氧陰離子產(chǎn)生速率的測(cè)定參照ELSTNER等[26]的方法。

1.4 球囊霉素相關(guān)土壤蛋白的測(cè)定

球囊霉素相關(guān)土壤蛋白的測(cè)定參照謝小林等[27]、何開平等[28]的方法。稱取0.75 g土樣，加入20 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH值7.0)6 mL，超聲混勻，121 ℃高溫滅菌，然后10 000 r·min-1離心20 min，取上清液，于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。

1.5 小麥根內(nèi)Cd含量的測(cè)定

小麥根系用剪刀沿植株根莖交界處剪斷，用流動(dòng)的自來(lái)水將根系上的營(yíng)養(yǎng)土沖洗干凈，然后用去離子水沖洗3次后，吸干表面水，裝入信封在80 ℃烘箱中干燥，用組織搗碎機(jī)(WARING-800 S，上海凌初環(huán)保儀器有限公司)粉碎，過(guò)篩。Cd含量測(cè)定參照BUSCEM等[29]的方法，用電感耦合等離子體(ICP)XSERISE2型高效液相色譜儀測(cè)定。

1.6 小麥葉片PC含量、PCS活性的測(cè)定

PC含量和PCS活性的測(cè)定依據(jù)試劑盒(購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.7 數(shù)據(jù)分析

各試驗(yàn)結(jié)果用DPS v 14. 10數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行LSD -單因素差異顯著性分析，使用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

如圖1所示，Gm與CK相比，小麥葉片中超氧陰離子產(chǎn)生速率降低了23.91%；Cd5，Cd10與CK相比，小麥葉片中超氧陰離子產(chǎn)生速率分別增加了52.17%和91.30%。而Cd5+Gm，Cd10+Gm與Cd5，Cd10相比，小麥葉片中超氧陰離子產(chǎn)生速率分別下降了32.86%和28.41%。表明叢枝菌根真菌能在一定程度上緩解Cd脅迫造成的氧化傷害。

注：Gm，Cd5，Cd5+Gm，Cd10和Cd10+Gm分別表示接菌，5 mg·kg-1 Cd(NO3)2，5 mg·kg-1 Cd(NO3)2+接菌，10 mg·kg-1 Cd(NO3)2，10 mg·kg-1 Cd(NO3)2+接菌。不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

2.2 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥根際土壤中GRSP含量的影響

如圖2所示，Gm與CK相比，土壤中GRSP含量極顯著增加，上升了30.03%；Cd5，Cd10與CK相比，GRSP含量差異不顯著；而Cd5+Gm，Cd10+Gm與Cd5，Cd10相比，土壤中GRSP含量分別上升了28.05%和28.12%。表明接種叢枝菌根真菌可以提高根際土壤中GRSP的含量。

圖2 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥根際土壤中GRSP含量的影響Fig.2 Effects of inoculation AMF on GRSP content in wheat soil under cadmium stress

2.3 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥根系內(nèi)Cd含量的影響

如圖3所示，隨著Cd脅迫質(zhì)量濃度的增加，小麥根系中Cd含量極顯著增加，Cd5，Cd10與CK相比，分別上升了1 309.75%和4 131.23%；Cd5+Gm，Cd10+Gm與Cd5，Cd10相比，小麥根系中Cd含量分別增加了189.36%和51.10%。表明接種叢枝菌根真菌可以提高小麥根系內(nèi)Cd的含量。

圖3 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥根Cd含量的影響Fig.3 Effects of inoculation AMF on Cd content in wheat roots under cadmium stress

2.4 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥葉片PC質(zhì)量濃度的影響

如圖4所示，Gm與CK相比，小麥葉片中PC質(zhì)量濃度下降了3.03%；Cd5，Cd10與CK相比，小麥葉片中PC質(zhì)量濃度分別上升了16.55%和37.07%；而Cd5+Gm，Cd10+Gm與Cd5，Cd10相比，小麥葉片中PC質(zhì)量濃度分別下降了21.75%和21.36%。這可能是接種叢枝菌根真菌降低了植物螯合肽合成酶(Phytochelatin synthase, PCS)的活性，從而導(dǎo)致PC質(zhì)量濃度的下降。

圖4 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥葉片PC質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effects of inoculation AMF on PC mass concentration in wheat leaves under cadmium stress

2.5 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥葉片PCS活性的影響

如圖5所示，Gm與CK相比，小麥葉片中PCS的活性有不同程度下調(diào)，下降了6.23%；Cd5，Cd10與CK相比，小麥葉片中PCS活性分別上升了8.71%和24.88%，而Cd5+Gm，Cd10+Gm與Cd5，Cd10相比，小麥葉片中PCS活性分別下降了22.94%和20.29%。表明接種叢枝菌根真菌在一定程度上降低了PCS的活性。

圖5 叢枝菌根真菌對(duì)Cd脅迫小麥葉片PCS活性的影響Fig.5 Effects of inoculation AMF on PCS activity of wheat leaves under cadmium stress

3 結(jié)論與討論

植物在重金屬脅迫下，ROS產(chǎn)生與清除機(jī)制被打破，超氧陰離子等大量積累[30]，造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子受到傷害，生理代謝紊亂，植物生長(zhǎng)受阻[31-32]。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫下小麥葉片內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生速率極顯著提高，說(shuō)明Cd脅迫造成了氧化損傷。這與賈月慧等[33]、鄧勇等[34]的研究結(jié)果一致。然而，Cd脅迫接種叢枝菌根真菌后與同等脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)下未接種相比，超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著降低，這與Cd脅迫接種叢枝菌根真菌可減少小麥葉片內(nèi)的Cd含量有關(guān)[35]。該結(jié)果與伍松林等[36]的研究結(jié)果一致。

GRSP是一種廣泛存在的叢枝菌根真菌分泌物[37]，不僅可以增加土壤顆粒的團(tuán)聚性，穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)[38]，而且當(dāng)重金屬過(guò)量時(shí)，還可與土壤中的重金屬結(jié)合，減弱重金屬的毒性。叢枝菌根真菌可以抑制重金屬向地上部的運(yùn)輸，減輕重金屬對(duì)植物的生理毒害[39]。劉靈芝等[40]研究表明，在Cd脅迫下，接種叢枝菌根真菌顯著增加了玉米根系中Cd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和吸收量，降低了植物地上部分的Cd含量。本研究結(jié)果表明，隨著Cd脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，小麥根中Cd含量顯著增加，同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd脅迫接種叢枝菌根真菌與未接種相比，根際土壤中GRSP及根系中Cd含量均極顯著增加，說(shuō)明接種叢枝菌根真菌增加了小麥根中的Cd含量，提高了根際土壤中GRSP。這也和很多的研究結(jié)論[41-45]一致。

PC是重金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類多肽，由PCS以谷胱甘肽(Glutathione, GSH)為底物催化合成，能通過(guò)Cys的-SH絡(luò)合重金屬，并通過(guò)液泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-ABC運(yùn)輸體將其轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡內(nèi)，解除重金屬毒性[46]。本研究結(jié)果表明，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd脅迫小麥葉片中PC質(zhì)量濃度和PCS活性均顯著高于對(duì)照，且隨著Cd脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PC質(zhì)量濃度和PCS活性均極顯著上升。這與劉媛等[47]、ANJUM等[48]、丁戈等[49]研究結(jié)論一致。Cd脅迫接種叢枝菌根真菌與同質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫未接種相比，由于大量的Cd被固定到根系中，導(dǎo)致地上部Cd含量顯著減少，從而造成了小麥葉片中PC質(zhì)量濃度和PCS活性隨之下降。說(shuō)明叢枝菌根真菌在一定程度上緩解了Cd的毒性，并伴隨著PC誘導(dǎo)量的降低。

本研究結(jié)果表明，Cd脅迫下接種叢枝菌根真菌增加了小麥根中Cd含量，提高了根際土壤中GRSP，降低小麥葉片中超氧陰離子產(chǎn)生速率、PC質(zhì)量濃度和PCS活性，說(shuō)明叢枝菌根真菌在一定程度上可緩解Cd的毒性，促進(jìn)小麥幼苗生長(zhǎng)。