糖對椰棗組織培養(yǎng)物的影響

李東霞 徐中亮 符海泉 張寧 王義 王富有

摘要：【目的】為降低椰棗愈傷組織褐化率和提高體胚發(fā)生率，研究培養(yǎng)基中不同糖處理對愈傷組織和體胚發(fā)生的影響，為優(yōu)化培養(yǎng)基配方提供依據(jù)。【方法】以椰棗組織培養(yǎng)物為研究對象，進行3種糖處理（蔗糖、蔗糖+果糖、蔗糖+葡萄糖）的組織培養(yǎng)試驗，統(tǒng)計椰棗愈傷組織褐化率及體胚發(fā)生率，測定不同糖處理下愈傷組織、體胚和不定芽的淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖含量，綜合分析不同糖處理對椰棗組織培養(yǎng)物影響的差異。【結(jié)果】在蔗糖培養(yǎng)基中增加果糖，體胚和不定芽的蔗糖含量和葡萄糖含量下降，愈傷組織和體胚的果糖含量及愈傷組織的淀粉含量上升，愈傷組織褐化率升高。在蔗糖培養(yǎng)基中增加葡萄糖，不定芽蔗糖含量和愈傷組織果糖含量降低，愈傷、體胚和不定芽的淀粉含量上升，愈傷和體胚的葡萄糖含量上升，體胚發(fā)生率升高。愈傷組織和體胚的淀粉和果糖含量顯著高于不定芽的淀粉和果糖含量（P<0.05，下同），愈傷組織的葡萄糖含量顯著高于體胚和不定芽，體胚的蔗糖含量顯著高于不定芽，不定芽的蔗糖含量顯著高于愈傷組織。相關分析結(jié)果表明：愈傷組織褐化率與愈傷組織果糖含量、不定芽果糖含量均呈顯著正相關;體胚發(fā)生率與體胚淀粉含量呈顯著正相關;體胚發(fā)生率與體胚蔗糖含量、愈傷組織褐化率與愈傷組織果糖含量均呈極顯著正相關（P<0.01，下同）;體胚發(fā)生率與體胚蔗糖含量、愈傷組織葡萄糖含量、體胚葡萄糖含量均呈極顯著正相關，同時，與體胚淀粉含量呈顯著正相關。【結(jié)論】在椰棗愈傷組織誘導與增殖培養(yǎng)過程中減少果糖的用量，在體胚發(fā)生培養(yǎng)時增加葡萄糖的用量，可降低愈傷組織的褐化率，提高體胚發(fā)生率。

關鍵詞：椰棗;組織培養(yǎng)物;蔗糖;果糖;葡萄糖

中圖分類號：S667.904.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-3059-08

Effects of sugar on tissue culture of date palm

LI Dong-xia， XU Zhong-liang， FU Hai-quan， ZHANG Ning， WANG Yi， WANG Fu-you*

（Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops/Tropical Palm Germplasm Nursery， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Wenchang， Hainan? 571339， China）

Abstract：【Objective】In order to reduce the callus browning rate and increase somatic embryogenesis rate， and provide the basis for the optimizing medium formulation， this experiment was conducted to study the effect of the ratio of sucrose， fructose and glucose in the culture medium on the callus and somatic embryos during tissue culture of date palm.【Method】The cultures were used as research object. Three treatments（sucrose， sucrose+fructose， sucrose+glucose） were used to the tissue culture experiment. The callus browning rate and somatic embryogenesis rate were observed and analyzed. The content of starch， sucrose， fructose and glucose in callus， somatic embryo and adventitious bud were detected and analyzed. Comprehensive analysis of the difference of different sugar treatments on the tissue culture of date palm.【Result】Increasing fructose in the sucrose culture medium decreased the sucrose content of somatic embryos and adventitious buds， and the glucose content， while increased the fructose content of callus and somatic embryos and the starch content of callus， and increased the callus browning rate. Increasing glucose in the sucrose medium decreased the sucrose and fructose content of adventitious buds， while increased the starch content of callus， somatic embryos and adventitious buds， increased the glucose content of callus and somatic embryos， and increased somatic embryogenesis rate. The starch and sugar content of callus and somatic embryos were significantly higher than that of the starch and sugar content of adventitious bud（P<0.05， the same below）. The glucose content of callus was significantly higher than that of the glucose content of somatic embryos and adventitious bud. The sucrose content of somatic embryos? was significantly higher than that of the sucrose content of adventitious bud， the sucrose content of adventitious bud was significantly higher than that of the sucrose content of callus. The results of correlation analysis showed that the callus browning rate was extremely significantly positively correlated with the fructose callus（P<0.01， the same below）. The somatic embryogenesis rate was extremely significantly positively correlated with sucrose content of somatic embryos， glucose content of callus and somatic embryos， and it was significantly positively correlated with the the starch content of somatic embryos. 【Conclusion】It is necessary to reduce the fructose in the the medium for callus induction and proliferation， and add glucose in the medium for somatic embryogenesis during date palm tissue culture， thereby decrease the callus browning rate and increase the somatic embryogenesis rate.

Key words： date palm; tissue culture; sucrose; fructose; glucose

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319QN325）; Agricultural International Exchange and Coo-peration Project（125163015000200006）; Protection Project of Species Resources（125163015000160004）

0 引言

【研究意義】椰棗（Phoenix dactylifera L.）是中東和北非地區(qū)重要的木本糧食作物，為多年生熱帶棕櫚植物，雌雄異株，繁殖方式多依賴植物組織培養(yǎng)方法（李東霞等，2017，2019;Gantait et al.，2018）。在植物組織培養(yǎng)基中通常需要加入糖作為碳源來維持外植體的生長（伍菲，2008），培養(yǎng)基中添加的糖的種類和用量不僅影響培養(yǎng)物的生長速度、生長量、代謝水平及次生代謝物合成，還影響細胞的分化和形態(tài)發(fā)生（吉訓志等，2019b）。糖和生物大分子的代謝對植物體胚發(fā)生有著重要影響（崔麗娜等，2011;Baskaran et al.，2016）。植物組織培養(yǎng)中碳源的種類及其濃度的選擇是必不可少的環(huán)節(jié)。因此，研究不同糖對椰棗組織培養(yǎng)物的影響，對進一步優(yōu)化椰棗愈傷組織誘導和體胚發(fā)生培養(yǎng)基配方，降低愈傷組織褐化率，提高體胚發(fā)生率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】國外研究者多針對椰棗不同品種和組織部位改變培養(yǎng)基中蔗糖濃度（Gantait et al.，2018），以Zaghlool莖尖為外植體時，在體胚發(fā)生培養(yǎng)中添加2%～3%的蔗糖，能夠使組織培養(yǎng)物在5 ℃避光保存12個月（Bekheet et al.，2002）;以Medzool、Sayar、Samran和Jaglool莖尖為外植體時，在愈傷誘導和體胚發(fā)生培養(yǎng)中添加3%的蔗糖，有利于通過體細胞胚胎發(fā)生途徑獲得克隆苗，其中從基因型Sayar獲得的80多個克隆已經(jīng)轉(zhuǎn)移到田間進行農(nóng)藝評價（Bhargava et al.，2003）;以Sukary莖尖為外植體時，在體系胞胚胎發(fā)生過程中培養(yǎng)基分別設計添加0、3%和6%的蔗糖與5% PEG-8000的組合，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加6%的蔗糖和5% PEG-8000大大提高了體胚產(chǎn)量（Alkhateeb，2006）;以Sakoty嫩葉為外植體時，在體胚發(fā)生培養(yǎng)基中添加4%的蔗糖，能直接誘導嫩葉形成體胚及發(fā)育成苗，而以老葉為外植體時無法直接誘導形成體胚（Elbar and Eldawayati，2014），可見并未開展通過改變添加培養(yǎng)基中不同糖種類組合獲得更好的效果的研究。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)蔗糖、果糖、葡萄糖、淀粉與多年生植物體胚發(fā)生密切相關，賴鐘雄和李惠華（2006）研究發(fā)現(xiàn)龍眼體胚發(fā)生過程中出現(xiàn)2次淀粉積累高峰期;顧曉川等（2018）研究發(fā)現(xiàn)在橡膠體細胞胚植株再生培養(yǎng)基中蔗糖的最佳用量為50 g/L;吉訓志等（2019a）研究認為蔗糖含量的積累是荔枝體胚發(fā)生的前提，隨著荔枝體胚發(fā)生進一步分化，蔗糖含量下降，果糖和葡萄糖含量上升，同時淀粉含量與荔枝體胚發(fā)生密切相關;吉訓志等（2020）研究發(fā)現(xiàn)在胡椒的胚性愈傷組織時期，其果糖和葡萄糖含量最高，表現(xiàn)出胚性愈傷組織極強的分化能力?！颈狙芯壳腥朦c】目前國內(nèi)外鮮見研究不同糖種類對椰棗組織培養(yǎng)物影響的報道?！緮M解決的關鍵問題】采用固體培養(yǎng)的試驗，分析蔗糖、蔗糖+果糖及蔗糖+葡萄糖3種糖處理中椰棗的愈傷褐化率和體胚發(fā)生率，以及培養(yǎng)物中不同糖類含量的差異，探討糖對椰棗組織培養(yǎng)物的影響，為優(yōu)化椰棗組織培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以椰棗fard無菌苗的不定根根尖培養(yǎng)形成的愈傷組織、體細胞胚胎和不定芽為試驗材料。其中椰棗無菌苗的培養(yǎng)方法：去掉椰棗種子表皮，將椰棗種子的兩端剪掉，將滅菌洗滌好的種子接種于MS+3 g/L活性炭（200目）+3.5 g/L植物凝膠+30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)環(huán)境為全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃。以培養(yǎng)30 d后的椰棗無菌苗的帶有不定根的主根為外植體，將其接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得椰棗愈傷組織、體胚和不定芽。

1. 2 培養(yǎng)條件

于2020年12月挑選長勢一致的愈傷組織接種于培養(yǎng)基中，每盒培養(yǎng)基接種9塊愈傷組織，同時挑選長勢一致的體胚和白色不定芽接種于培養(yǎng)基中，每盒培養(yǎng)基均分別接種9塊體細胞胚胎和不定芽，培養(yǎng)環(huán)境均為全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃。本試驗所有材料進行不同糖處理的培養(yǎng)基為MS+2 mg/L異戊烯基腺嘌呤（2ip）+2 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）+1 mg/L萘乙酸（NAA）+5 mg/L谷氨酰胺（Gln）+10 mg /L酸水解酪蛋白+3.5 g/L植物凝膠+糖，設置不同的糖處理CK、M1和M2處理（表1）。滅菌前培養(yǎng)基pH 5.70～5.75。椰棗組織培養(yǎng)物的培養(yǎng)均在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所組織培養(yǎng)暗培養(yǎng)室中進行，培養(yǎng)環(huán)境為全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃。每45 d繼代培養(yǎng)1次。

1. 3 測定指標及方法

采用華為P30手機超級微距拍攝不同糖處理20 d后椰棗愈傷組織的形態(tài)變化。用萬分之一電子天平稱取樣品液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。采用索萊寶葡萄糖含量檢測試劑盒（BC2500可見分光光度法）測定葡萄糖含量（Basagni and Bonicolini，1991）;采用索萊寶淀粉含量檢測試劑盒（BC0700蒽酮比色法）測定淀粉含量（Rose et al.，1991）;采用索萊寶果糖含量檢測試劑盒（BC2450可見分光光度法）測定果糖含量（Varandas et al.，2004）;采用索萊寶蔗糖含量檢測試劑盒（BC2460可見分光光度法）測定蔗糖含量（Fils-Lycaon et al.，2011）。以上測定具體方法均參照制造商說明書進行測定，按照樣本質(zhì)量進行計算，每個指標的測定進行3次生物學重復。

1. 4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行分析并制圖;采用SAS 9.1進行方差分析;采用OriginPro 9.1進行變異情況分析和相關分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 糖對椰棗愈傷組織褐化率和體胚發(fā)生率的影響

將培養(yǎng)相同時期的愈傷組織接入到不同糖處理的培養(yǎng)基中，在接種20 d后觀察椰棗愈傷組織的褐化情況，發(fā)現(xiàn)愈傷組織在M1處理下比在CK和M2處理下褐化更明顯（圖1），褐化率顯著增加（P<0.05，下同），分別是CK和M2處理下愈傷組織褐化率的3.51和4.10倍，M2處理的愈傷組織褐化率與CK間無顯著性差異（P>0.05，下同）;相同時期的胚性愈傷組織接入到M2處理培養(yǎng)基中其體胚發(fā)生率增加，分別是CK和M1處理下體胚發(fā)生率的2.55和6.42倍（表2）。

2. 2 糖對椰棗組織培養(yǎng)物淀粉含量的影響

從圖2可看出，3個處理下不定芽的淀粉含量均顯著低于愈傷組織和體胚，愈傷組織與體胚間淀粉含量無顯著性差異;M2處理下愈傷組織淀粉含量顯著高于CK，是CK的愈傷組織淀粉含量的1.25倍，同時，M2處理下體胚淀粉含量顯著高于CK和M1處理，分別是CK和M1處理下體胚淀粉含量的1.23和1.13倍，M2處理下不定芽淀粉含量也顯著高于CK和M1，分別是CK和M1處理下不定芽淀粉含量的1.38和1.80倍。

2. 3 糖對椰棗組織培養(yǎng)物蔗糖含量的影響

從圖3可看出，3個處理下愈傷組織的蔗糖含量最低，顯著低于不定芽和體胚，不定芽的蔗糖含量顯著低于體胚。同時，3個處理間愈傷組織蔗糖含量無顯著性差異;M1處理下體胚蔗糖含量顯著低于CK和M2處理，分別是CK和M2處理下體胚蔗糖含量的81%和79%;M1和M2處理下不定芽蔗糖含量顯著低于CK，分別是CK的體胚蔗糖含量的79%和82%。

2. 4 糖對椰棗組織培養(yǎng)物果糖含量的影響

從圖4可看出，不同糖處理下椰棗不同培養(yǎng)階段培養(yǎng)物的果糖含量不同，3個處理下不定芽的果糖含量均顯著低于愈傷組織和體胚。M1處理下愈傷組織和體胚果糖含量顯著高于CK和M2處理，其中，M1處理下愈傷組織果糖含量分別是CK和M2處理的1.19和1.71倍，其體胚果糖含量分別是CK和M2處理下體胚果糖含量的1.66和1.21倍。M2處理下愈傷組織果糖含量顯著低于CK，是CK愈傷組織果糖含量的70%;M2處理下體胚果糖含量顯著高于CK，是CK體胚果糖含量的1.37倍。

2. 5 糖對椰棗組織培養(yǎng)物葡萄糖含量的影響

從圖5可看出，3個處理下愈傷組織的葡萄糖含量均顯著高于不定芽和體胚。M2處理下愈傷組織和體胚葡萄糖含量均顯著高于CK和M1處理，其中，M2處理下愈傷組織葡萄糖含量分別是CK和M1處理的1.38和1.45倍，其體胚葡萄糖含量分別是CK和M1處理的1.49和1.98倍;M2處理下不定芽葡萄糖含量顯著高于M1處理，是M1處理下不定芽葡萄糖含量的1.75倍。

2. 6 糖對椰棗組織培養(yǎng)物生理指標變異系數(shù)的影響

不同糖處理下，椰棗不同階段組織培養(yǎng)物的14個生理指標中愈傷組織褐化率和體胚發(fā)生率的四分位距大，落在箱子里的范圍分散，數(shù)據(jù)波動幅度大，變異系數(shù)大，達70.00%以上。不定芽葡萄糖、體胚葡萄糖、體胚果糖、不定芽淀粉、愈傷組織果糖和愈傷組織葡萄糖含量的四分位距較愈傷組織褐化率和體胚發(fā)生率小，變異系數(shù)范圍在19.02%～31.67%;愈傷組織蔗糖、體胚淀粉和愈傷組織淀粉含量的四分位距小，落在箱子里面的數(shù)據(jù)集中，數(shù)據(jù)波動幅度小，變異系數(shù)范圍在10.68%～12.00%;體胚蔗糖含量的變異系數(shù)是11.84%，四分位居雖比較大，但數(shù)據(jù)近似對稱，中位數(shù)近似位于四分位居的中間，不存在異常值（圖6，表3）。

2. 7 不同糖處理下椰棗不同組織培養(yǎng)物性狀的相關分析

如表4所示，不同糖處理下，體胚發(fā)生率與體胚蔗糖含量、愈傷組織葡萄糖含量、體胚葡萄糖含量，愈傷組織褐化率與愈傷組織果糖含量，體胚蔗糖含量與愈傷組織葡萄糖含量、體胚葡萄糖含量，不定芽蔗糖含量與不定芽葡萄糖含量，以及愈傷組織葡萄糖含量與體胚葡萄糖含量均呈極顯著正相關（P<0.01，下同）;不定芽果糖含量與愈傷組織褐化率、愈傷組織果糖含量，體胚發(fā)生率與體胚淀粉含量，不定芽淀粉含量與愈傷組織葡萄糖含量、體胚葡萄糖含量，均呈顯著正相關。愈傷組織褐化率與體胚蔗糖含量、不定芽葡萄糖含量，體胚發(fā)生率與愈傷組織果糖含量、不定芽果糖含量，不定芽淀粉含量與愈傷組織果糖含量，體胚蔗糖含量與愈傷組織果糖含量、不定芽果糖含量，不定芽蔗糖含量與體胚果糖含量，以及愈傷組織果糖含量與愈傷組織葡萄糖含量、體胚葡萄糖含量，體胚果糖含量與不定芽葡萄糖含量均呈極顯著負相關。愈傷組織褐化率與體胚發(fā)生率、不定芽蔗糖含量和體胚葡萄糖含量，愈傷組織淀粉含量與不定芽蔗糖含量，愈傷組織蔗糖含量與體胚果糖含量，以及不定芽果糖含量與愈傷組織葡萄糖含量和體胚葡萄糖含量均呈顯著負相關。

3 討論

碳水化合物在體外培養(yǎng)方面起重要作用，發(fā)揮著營養(yǎng)和調(diào)控效應。糖類在常綠果樹體胚發(fā)生過程中既是一種滲透劑，又是一種能源和碳源，使用濃度常為3%（Encina et al.，2014）。蔗糖是植物組織培養(yǎng)中普遍添加的碳源，是決定培養(yǎng)物生長速度、生長量、代謝水平及次生代謝物合成的關鍵因素之一（李秋利等，2019;Ameri et al.，2020）。本研究中，蔗糖+果糖處理下提高了椰棗愈傷組織的褐化率;蔗糖+葡萄糖處理下提高了椰棗體胚發(fā)生率，可見改變培養(yǎng)基中糖的添加量和種類也使椰棗組織培養(yǎng)物的代謝水平和形態(tài)發(fā)生變化，從而影響椰棗愈傷組織褐化率和體胚發(fā)生率。阮燕曄等（2007）研究發(fā)現(xiàn)擬南芥愈傷組織可吸收蔗糖，蔗糖轉(zhuǎn)化酶將蔗糖的分解產(chǎn)生為果糖和葡萄糖供于愈傷組織吸收，且其吸收葡萄糖的能力高于果糖。孫果忠等（2009）的研究報道也證實了這一點，其研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖能促進小麥未成熟胚、休眠成熟胚及不休眠成熟胚的萌發(fā)。本研究中，椰棗體胚發(fā)生率與愈傷葡萄糖含量、體胚葡萄糖含量呈極顯著正相關，葡萄糖有助于體胚的形成，與前人研究結(jié)果相同，即提高培養(yǎng)基中葡萄糖含量有益于愈傷組織和體胚的發(fā)育。綜上所述，相比蔗糖和果糖，葡萄糖更有利于椰棗體胚發(fā)生。

淀粉是常綠果樹能源貯存物質(zhì)，淀粉積累與常綠果樹體胚發(fā)生密切相關（司園園等，2018），龍眼體胚發(fā)生過程中出現(xiàn)2次淀粉累積高峰值，分別為愈傷組織形成階段和球形胚階段，在其體胚發(fā)生早期的胚性愈傷組織階段淀粉含量有累積高峰，而在體胚發(fā)生過程中逐漸減少，消耗的淀粉含量為其他物質(zhì)的合成提供了物質(zhì)能量（賴鐘雄和李惠華，2006）。淀粉含量與荔枝體胚發(fā)生也密切相關（吉訓志等，2019a）。本研究中椰棗愈傷組織和體胚的淀粉含量顯著高于不定芽，同時發(fā)現(xiàn)椰棗體胚發(fā)生率與體胚淀粉含量呈顯著正相關。

吉訓志等（2019a）研究認為荔枝體胚發(fā)生的前提必須有蔗糖含量的積累，但是隨著體胚發(fā)生的進一步分化，果糖和葡萄糖以碳骨架物質(zhì)參與體胚結(jié)構(gòu)的發(fā)育，因而蔗糖含量下降、果糖和葡萄糖含量上升。吉訓志等（2020）研究發(fā)現(xiàn)糖類、生物大分子與胡椒體細胞胚胎發(fā)生密切相關，胡椒愈傷組織中蔗糖含量顯著低于體細胞胚胎和體細胞胚胎增殖時期的蔗糖含量，胚性愈傷組織的的葡萄糖含量顯著高于體細胞胚胎。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，3種糖處理下椰棗愈傷組織的蔗糖含量最低，顯著低于不定芽的蔗糖含量，而不定芽的蔗糖含量顯著低于體胚，愈傷組織中葡萄糖含量最高，顯著高于體胚和不定芽的葡萄糖含量，但是在蔗糖+果糖處理下，體胚的蔗糖和葡萄糖含量顯著低于蔗糖和蔗糖+葡萄糖處理;愈傷組織與體胚的果糖含量沒有顯著性差異，且均顯著高于其他2個處理下愈傷組織和體胚的果糖含量。王瑞等（2013）對比分析了蔗糖、果糖、葡萄糖、白糖、和麥芽糖等5種碳源對油茶愈傷組織誘導的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30g/L的果糖處理下，油茶愈傷組織的誘導率最低。本研究發(fā)現(xiàn)，在蔗糖+果糖處理下椰棗愈傷組織褐化率最高，同時相關分析表明愈傷組織褐化率與愈傷組織果糖含量呈極顯著正相關，可見培養(yǎng)基中果糖含量不利于愈傷組織的發(fā)育，如需降低椰棗愈傷組織的褐化率，則應減少培養(yǎng)基中果糖含量。

4 結(jié)論

在椰棗愈傷組織誘導與增殖培養(yǎng)過程中減少果糖的用量，在體胚發(fā)生培養(yǎng)時增加葡萄糖的用量，可降低愈傷組織褐化率，提高體胚發(fā)生率。

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收稿日期：2021-05-07

基金項目：海南省自然科學基金項目（319QN325）;農(nóng)業(yè)國際交流與合作項目（125163015000200006）;物種品種資源保護費項目（125163015000160004）

通訊作者：王富有（1970-），https：//orcid.org/0000-0002-8671-210X，研究員，主要從事植物遺傳資源政策和農(nóng)業(yè)科技發(fā)展戰(zhàn)略研究工作，E-mail：fuyouwangcatas@163.com

第一作者：李東霞（1987-），https：//orcid.org/0000-0003-4238-1932，主要從事椰棗組織培養(yǎng)與營養(yǎng)研究工作，E-mail：lixia.311@163.com